Wir danken den Autoren von Robinson et al. 12 für ihre Beiträge zu dem Manuskript, aus dem dieses Protokoll teilweise abgeleitet.

Die Verwendung von Tieren werden durch das Oberlin College Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Ausschuss und sind in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren 21. 1. Vorbereitung für Viral Infusion Hinweis: Dieses Protokoll verwendet BSL-1 Vorsichtsmaßnahmen. Beim Einsatz BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen, eine Einweg-Kittel, Handschuhe, Überschuhe, Augenschutz und soll ein Beatmungsgerät (Typ N95) erforderlich. Alle Individuen Umgang BSL-2-Verbindungen müssen fit für ein Beatmungsgerät getestet von einer lokalen Einrichtung des Gesundheitswesens werden. Siehe Lowery &amp; Majewska (2010) 22 für weitere Informationen zur Handhabung und Lagerung von viralen Vektoren. <ol><li> Beim ersten Gebrauch aliquoten und speichern nicht verwendete Virus in 20 ul Reaktionsgefäße zu wiederholtem Einfrieren und Auftauen vermeiden. </li><li> Bereiten Sie die Arbeitsfläche, indem Sie alle nicht benötigten Objekte und Sterilisieren der Oberfläche mit 70% Ethanol. Bereiten Sie eine 10% Bleichlösung zur Dekontamination von AAV Abfall. Legen Sie einen Becher voll von der Bleichlösung und einer sterilen 10 &amp; mgr; l-Spritze auf die Arbeitsfläche. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit dem AAV in einen Behälter mit Crushed Ice im Aufbau. </li><li> Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Virus in eine Standard-Schraubstock. Laden Sie eine 10 &amp; mgr; l-Spritze mit mindestens 4 ul AAV. Darauf achten, dass die Spitze der Spritze gegen den Boden der Mikrozentrifugenröhrchen während des Ladens zu biegen. Sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den 4 ul AAV Lösung in der Spritze. </li><li> Entsorgen Sie das leere Virusrohr in das Becherglas, das 10% Bleichmittel. Bewahren Sie unbenutzte Teile des Virus, wie vom Hersteller angegeben. </li><li> Fügen Sie zusätzliche 10% Bleichmittel auf den Abfallbehälter und lassen Abfälle zu 30 Minuten vor der Entsorgung der dekontaminierten flüssigen Abfall zu sitzen. </li><li> Entsorgen Sie die Schutzausrüstung und Kunststoffabfälle in einem Behälter für biologischen wie von den Richtlinien des Instituts beauftragt. Decontaminate jedes Gerät oder Oberflächen, die in Kontakt mit dem Virus mit 10% Bleich kam. </li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> Bereiten Sie den OP-Bereich, indem absorbierenden Papierbank unter der stereotaktischen Apparat und auf einer als dedizierte Virenhandhabungsbereich bezeichnet angrenzenden Raum. <ol><li> Legen Sie eine 10% Bleichabfallbehälter in den dedizierten Virus Handhabungsbereich in der Nähe der Operationsvorrichtung. </li></ol></li><li> Induzieren einen stetigen Niveau der Anästhesie und bereiten die Ratte für die Chirurgie. <ol><li> Zeigen die Ratte in einer Induktionskammer, die eine Mischung von Isofluran Gas (im Bereich von 1 bis 3%) und Sauerstoff (100% auf etwa 1 l / min) enthält, bis es zu einem Verlust des Bewusstseins und Fehlens des Brutto gezielte Bewegung. Aufrechtzuerhalten Isoflurananästhesie gesamten chirurgischen Prozedur. </li><li> Nach 6 tiefe Narkose erreicht ist, rasieren die Ratte aus zwischen den Augen bis leicht hinter den Ohren. </li><li> Legen Sie die Ratte zurück in die Induktionskammer für einweitere 1-3 min. </li><li> Sicherzustellen, dass der Isoflurananästhesie System ist mit dem Nasenkonus des stereotaktischen Chirurgie verbunden sind. Öffnen des Hahnes auf das Isofluran Schlauch, um den Fluss von Isofluran zum stereotax beginnen. Aufrechterhaltung der Isofluran und Sauerstoff bei den oben genannten Ebenen. </li><li> Legen Sie die Ratte in einem stereotaktischen Apparat durch die Sicherung der Mund auf den Biss Bar und der Sicherung der Ohr-Bars. </li><li> Gelten Augensalbe für die Augen und Betadin zum Operationsort vor Einschnitt. </li></ol></li><li> Machen Sie eine 2,4 cm Mittellinienschnitt der Haut auf der dorsalen Oberfläche des Schädels ab ca. 2 mm kaudal auf die Augen. Ziehen Sie die Haut, um den Schädel freizulegen. Von Zeit zu Zeit zu vermitteln steriler 0,9% iger steriler Kochsalzlösung an den Rändern der Operationsstelle zu Geweben vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Klare membranöse Gewebe vom Schädel bis Bregma und Lambda sind deutlich sichtbar. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Schädel ist Ebene durch Messung der dorsal-ventralen Koordinaten anBregma und Lambda. Stellen Sie den stereotaktischen Gerät entsprechend bis dorsal-ventralen Koordinaten Bregma und Lambda um nicht mehr als 0,04 mm. </li><li> Zu dieser Zeit reduzieren die Isofluran Gas zwischen 2 und 2,5%. </li><li> Bringen Sie den Bohrer zu Bregma, Rezero den Koordinaten und bewegen Sie dann den Bohrer auf die gewünschte medial-lateral und anterior-posterior zu koordinieren. </li><li> Bohren Sie ein Loch an der Koordinate mit einem 0,9 mm Bohrer, da sie eine geeignete Größe Loch für eine 28 G Infusionsspritze erzeugt. </li><li> Stellen Sie die Infusionspumpe Virus bei einer Rate von 0,2 ml / min zu liefern. Legen Sie die Spritze in die Infusions Arm der stereotaktischen Gerät und senken Sie die Spritze in die gewünschte koordinieren. Geben Sie die gewünschte Menge an Virus (Bereich 0,1 bis 0,8 &amp; mgr; l). Zum Beispiel liefern 0,8 ul von AAV als 4 min. Anmerkung: Pilotstudien durchzuführen, um die ideale Infusionsvolumen und die typische Ausbreitung des Virus in jeder Region von Interesse zu bestimmen. <ol><li> Nach der Lieferung von Virus cosolute Lassen Sie die Spritze in Platz für 10 min zum Rückfluss in den Nadeltrakt zu verhindern. Langsam heben Sie die Spritze mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 mm / min. Wiederholen, bis alle Koordinaten mit AAV infundiert worden. </li></ol></li><li> Schließen Sie die Wunde mit Operationsklammern und Mantel die Wunde mit topischen antibiotischen Salbe. </li><li> Folgen Sie den Richtlinien des Instituts für die postoperative Schmerztherapie. </li><li> Legen Sie die Ratte in einem Käfig mit Decken und Kissen, einem Deckel und ordnungsgemäße Beschilderung und gibt die Ratte auf die Tierhaltung. <ol><li> Wenn Arbeiten unter BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen, sammeln Bettwäsche für die Höhe der Zeit (in der Regel 48 bis 72 h) von institutionellen Richtlinien festgelegt. Zeigen Betten in ein biohazard Abfallbehälter. </li><li> Entsorgen Sie alle AAV-kontaminierten Materialien wie von Richtlinien für ihre sichere Entsorgung angegeben. </li></ol></li></ol> 3. Behavioral Vorrichtung Hinweis: Die sensorischen Präkonditionierung Gerät besteht aus einem Standard-operante Konditionierung Chamber (12 &quot;L x 9.5&quot; W x 11.5 &quot;H) mit einem Edelstahl-Gitterboden, 2 Seitenwänden aus Plexiglas und 2 Metallwände. <ol><li> Montieren Sie eine 2,8 W Licht auf eine der Aluminiumwände, die als Hauslicht dienen und als visueller Reiz, wenn sie bei 2 Hz blinkt. Montieren Sie einen Lautsprecher an der Kammer, um die auditive Reize liefern (10 sec, 1500 Hz, 78 dB und einen reinen Ton dB Rauschen 10 sec 78). <ol><li> Verwenden Sie eine Futterraufe auf 45 mg Futterpellets in die Nahrungs Tasse zu liefern. In der Lebensmittelbecher, Infrarotlichtschranken erkennen die gesamte Zeit in der Lebensmittel Tasse verbrachte vor, während und nach der Präsentation der Reize und Lebensmittel Belohnungen. </li><li> Haus die Kammern in schalldämpfenden Gehäuse (22 &quot;W x 22&quot; H x 16 &quot;D) mit Abluftventilatoren ausgestattet (~ 68 dB). </li><li> Verwenden Sie einen PC mit Med Associates-Software, um die operante Kammer zu steuern und erfassen die Daten. Während der Sitzungen Anlage, sammeln Daten über die Gesamtzeit, während presenta mit dem Kopf verbrachte in der Lebensmittel Tassetion der Lichtreiz (5 sec Epoche) und während der Präsentation der Speisen Belohnung (5 sec Epoche). Während der Test-Session, sammeln Daten über die Gesamtzeit, in der Lebensmittel Tasse an Präsentationen der auditive Reize verbrachte in Reaktion (10 sec Epoche Anfang, wenn die akustische Reize werden beendet). </li></ol></li></ol> 4. Überblick über die Sinnes Präkonditionierung Paradigm <ol><li> Nach Erholung von der Operation, nach und nach Nahrung zu beschränken, die Ratten zu 85% ihrer freien Fütterung Körpergewicht. Wenden Veterinärpersonal nach einem geeigneten Nahrungsmittelbeschränkung Paradigma. Anmerkung: Die 3-Phasen-sensorischen Vorkonditionierung Paradigma ist in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Präkonditionierung Sessions (Phase 1; Täglich 64 min Training über 4 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt): <ol><li> Vorliegenden Ratten mit 12 vermischt Studien, die der Lieferung von auditiven und visuellen Stimuli bestehen. Gehören unter Untersuchungsintervalle, dass durchschnittlich 4,5 min (Bereich 4,0 bis 5,0 min) nach jeder einuditory Präsentation. </li><li> Am 6. der Versuche, ein Ton vorhanden (vorkonditioniert Stimulus) für 10 sec, unmittelbar gefolgt von einer 5 s Präsentation der blinkenden Lichtreiz. </li><li> An den anderen 6 Studien präsentieren die weiße Rauschen (ungepaarten Stimulus) allein für 10 sec. </li></ol></li><li> Anlage Sitzungen (Phase 2; Täglich 64 min Schulungen über 5 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt): <ol><li> Vorliegenden Ratten mit 8 Studien, die der Lieferung der visuellen Reiz (die blinkende Lichtreiz) für 5 Sekunden aus, unmittelbar gefolgt von Lieferung von zwei 45 mg Futterpellets. Gehören unter Untersuchungsintervalle, dass durchschnittlich 7 Minuten (Bereich 6,0 bis 8,0 min) nach jedem Versuch. Gelegentlich Ratten benötigen mehr als 5 Anlage Sitzungen, um den Lichtnahrungs Verein zu lernen. </li></ol></li><li> Test Session (Phase 3; eine einzige Sitzung 78 min): <ol><li> Präsentieren Sie die Ratten, die mit 12 vermischt Studien, die der Lieferung der auditive Reize allein bestehen. Gehören unter Untersuchungsintervalle aveWut 4,5 min (Bereich 4,0 bis 5,0 min) nach jedem Gehör Präsentation. </li><li> Am 6. der Versuche stellen den Ton Reiz (Stimulus die vorkonditioniert) allein für 10 sec. </li><li> An den anderen 6 Studien präsentieren die weiße Rauschen (das ungepaarte Stimulus) allein für 10 sec. </li></ol></li><li> Gegengewicht zu den Stimuli durch die Vollendung der Studie mit einer zweiten Gruppe von Ratten, die weißes Rauschen als vorkonditioniert Reiz und den Klang wie die ungepaarten Reiz erhalten. </li></ol> 5. Pharmakologische und Verhaltensordnung <ol><li> Schalten Sie das Gerät an den Verhaltens Gerät und laden Sie die Med-PC-Code für das entsprechende Verhaltens Sitzung. Draht und die Verhaltens-Programm Gerät, so dass die Fans, die auf den Schalldämpfungsschränke montiert sind einzuschalten, wenn der Strom eingeschaltet ist. </li><li> Um eine 1 mg / ml-Lösung von Clozapin-N-oxid (CNO) vorzubereiten, wiegen 5,0 mg CNO in einen 15 ml konischen Rohr und 5 ml sterilem Wasser oder 5 ml steriler 0,9% saline. Vortex, bis die Lösung klar ist. <ol><li> Wenn CNO nicht in Lösung aufzulösen oder wenn konzentriertere Lösungen von CNO gewünscht hinzuzufügen ein Solubilisierungsmittel, wie DMSO 23. Insbesondere, um eine 1 mg / ml-Lösung von CNO mit 0,5% DMSO herzustellen, wiegt 5,0 mg CNO und füge 25 ul DMSO zu einer 15 ml konischen Röhrchen. Flick leicht sichergestellt wird, dass der Inhalt an der Basis der Röhre verbleiben. Wenn die Lösung klar wird, mit 5 ml sterilem Wasser oder 5 ml steriler 0,9% iger Kochsalzlösung. Weitere Anleitungen zur Herstellung von Lösungen von CNO sind auf der DREADD Wiki-Ressourcenseite 25 zur Verfügung. </li><li> Bereiten Sie jeden Tag, die es verabreicht wird, eine neue CNO-Lösung. </li></ol></li><li> Spritzen den CNO intraperitoneal in einer Dosis von 1 mg / kg, etwa 30 Minuten vor dem Verhaltenstests. B. spritzen ein 200 g Ratte mit 0,2 ml der 1 mg / ml Lösung CNO. Die Dosis und Zeitverlauf der CNO Verwaltung wurden auf der Grundlage bisher veröffentlichten Berichte 2,12 ausgewählt.<ol><li> Injizieren CNO 30 Minuten vor jeder Sitzung Präkonditionierung (Phase 1; insgesamt 4 Tagen Injektionen), sondern verwalten das Fahrzeug vor allen nachfolgenden Verhaltens Sitzungen. </li></ol></li><li> Nach 30 Minuten, legen Sie die Ratten in den Verhaltenstests Kammern und starten Sie die Computer-Code für die entsprechende Verhaltens Sitzung. </li><li> Nach Abschluss der verhaltens Aufgabe sofort den Ratten aus den Kammern und zurück die Ratten zur Tierkolonie. </li></ol> 6. Analyse der Verhaltensdaten Hinweis: Die abhängige Variable für alle Verhaltens Sitzungen ist die Zeitdauer, die den Kopf der Ratte ist in der Nahrungsmittelbecher durch Unterbrechung des Infrarot-Lichtschranken in der Lebensmittel Tasse erkannt. Die Daten (in sec) werden gesammelt und von der Computersoftware aufgezeichnet. <ol><li> Führen Sie keine Analysen auf Daten, die während der Vorkonditionierungsphase erzeugt. </li><li> Für die Konditionierung Sitzungen: Analysieren Sie jede Ratten einkeit, die leichte Kost Verein durch den Vergleich Food Tasse Verhalten während der Präsentation der visuellen Reiz über die 5 Verhaltenssitzungen erlernen. Genauer gesagt, die Berechnung der durchschnittlichen Zeit in der Lebensmittel Tasse verbrachte während der 5 sec Licht Epoche für jede 8 Studien / Sitzung (dh durchschnittlich 8 Studien, die jeweils 5 sec Dauer / Ratte sind). Vergleiche zwischen den mittleren Kontroll- und Versuchswerte für jede der 5 täglichen Sitzungen (siehe 3A). <ol><li> Analysieren Sie die Ratten &quot;Motivation, Futterbelohnung durch Vergleich Food Tasse Verhalten bei Auslieferung des Futterbelohnung (5 sec Epoche) über die 5 Verhaltens Sitzungen mit dem gleichen Berechnung wie für den 5 sec Licht Epoche oben genannten zu erhalten. Diese Werte werden ständig höher als die während der Präsentation der visuellen Stimulus erworben werden (siehe 3B). </li></ol></li><li> Für die Testsitzung: Berechnung eines Unterscheidungsquote, die die Ratten &quot;Food Tasse Verhalten als Reaktion auf pres beschreibttationen jedes auditorischen Reizes. <ol><li> Insbesondere wird für jede Ratte, unterteilen die durchschnittliche Zeit nach jedem von 6 Darstellungen der sensorischen vorkonditioniert Stimulus (dh der Ton) durch die Summe der durchschnittlichen Zeit, in der Lebensmittelbecher verbracht in der Lebensmittelbecher verbracht folgenden jeweils von 6 Darstellungen der sensorischen vorkonditioniert Stimulus (dh der Ton Anregung) plus dem Durchschnitt der Gesamtzeit in der Lebensmittelbecher verbracht folgenden jeweils von 6 Darstellungen der ungepaarten Stimulus (dh das weiße Rauschen Stimulus). Jede Epoche ist 10 Sekunden in Dauer. Hinweis: Eine Diskriminierung Score von 0,5 oder mehr zeigt, dass Ratten gelernt, die Verbände die sich aus der sensorischen Präkonditionierung Paradigma. </li></ol></li></ol> 7. Überprüfung der AAV Placement und Expression <ol><li> Betäuben und perfundieren die Ratten transkardial mit 4% Paraformaldehyd. Aufgrund der Verwendung von Fluoreszenzmarkern, keinen post-Fixierungszeit von 2 h nicht überschreiten zu minimize Verlust der Antigenität und um das Fluoreszenzsignal zu erhalten. </li><li> Dehydratisieren perfundierten Gehirnen indem sie in einen Gehirn Gefäß mit 30 ml einer 20% Saccharose-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x) für mindestens 2 Tage lang oder bis das Gehirn sinkt auf den Boden des Gehirns Glas. </li><li> Verwenden eine Gefrier Schlittenmikrotom koronalen Hirnschnitten (20-40 &amp; mgr; m) über den gesamten Umfang der rostrokaudale dem interessierenden Bereich zu machen. </li><li> Zuführen Immunhistochemie gegen den markierten Rezeptor oder dem Reporterprotein gerichtet, um den Ort und die Expression des Designers Rezeptor und / oder Reporter-12 zu ermitteln. Ein Immunhistochemie Färbung Protokoll basiert auf dem DREADD Wiki-Ressourcenseite 25 zur Verfügung gestellt. </li><li> Montieren Sie die Schnitte auf Superfrost-plus Folien und Deckglas mit 100-200 &amp; mgr; l einer wässrigen Eindeckmedium. </li><li> Führen Fluoreszenzmikroskopie auf Hirngewebe zu AAV Platzierung und Proteinexpression 12,24 überprüfen.</li>
</ol>

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	<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G-protein+coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li><li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+(Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs):+Chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility.">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).</li><li>Weiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+M1+muscarinic+receptor+agonism+of+N-desmethylclozapine+in+the+unique+clinical+effects+of+clozapine.">The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine.</a> Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).</li><li>Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> amnesia and the hippocampal system. , (1993).</li><li>Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+memory:+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network).">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network).</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).</li><li>Agster, K. L., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+efferents+of+the+perirhinal,+postrhinal+and+entorhinal+cortices+of+the+rat.">Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat.</a> Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).</li><li>Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+anatomical+systems+embedded+within+the+primate+medial+temporal+lobe:+implications+for+hippocampal+function.">Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).</li><li>Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functional+circuitry+between+retrosplenial+and+postrhinal+cortices+during+fear+conditioning.">Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning.</a> J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).</li><li>Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticohippocampal+contributions+to+spatial+and+contextual+learning.">Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning.</a> J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).</li><li>Kaut, K. P., Bunsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+lesions+to+the+rat+hippocampus+or+rhinal+cortex+on+olfactory+and+spatial+memory:+retrograde+and+anterograde+findings.">The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings.</a> Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).</li><li>Brogden, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+preconditioning.">Sensory preconditioning.</a> J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).</li><li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+silencing+of+neurons+in+retrosplenial+cortex+disrupts+sensory+preconditioning.">Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning.</a> J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+guidelines+for+research+involving+recombinant+or+synthetic+nucleic+acid+molecules.">NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules.</a> Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes.">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Gene Ther. 3, 545-565 (2003).</li><li>Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-2+(AAV-2)+causes+trophoblast+dysfunction,+and+placental+AAV-2+infection+is+associated+with+preeclampsia.">Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia.</a> Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).</li><li>Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+of+adeno-associated+virus+(AAV)+in+testicular+tissue+and+in+abnormal+semen+samples.">DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples.</a> Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).</li><li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vector+integration+sites+in+mouse+hepatocellular+carcinoma.">AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma.</a> Science. 317 (5837), 477-47 (2007).</li><li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors.">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li><li>Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+expression+of+Pctk1,+Tcf12+and+Ccnd+in+hippocampus+of+rats:+impact+on+cognitive+function,+synaptic+plasticity+and.">Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and.</a> 97 (1), 69-80 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Academy+Press.+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> National Academy Press. , (1996).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors.">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li><li>Cavaletti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+in+the+peripheral+nervous+system+of+systemically+administered+dimethylsulfoxide+in+the+rat:+a+neurophysiological+and+pathological.">Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological.</a> 119 (1-2), 1-2 (2000).</li><li>Parnaudeau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediodorsal+thalamus+hypofunction+impairs+flexible+goal-directed+behavior.">Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior.</a> Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).</li><li>wiki, D. R. E. A. D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2014).</li><li>Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-pathway+striatal+neurons+regulate+the+retention+of+decision-making+strategies.">Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies.</a> J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).</li><li>Cassatarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+pharmacogenetic+modulation+of+the+nucleus+accumbens+reduces+ethanol+consumption+in+a+limited+access+paradigm.">Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm.</a> Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).</li><li>Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+versus+delayed+stimulation+of+feeding+by+the+endogenously+released+AgRP+neuron+mediators.">Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators.</a> GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).</li><li>Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+correlates+of+compensatory+collateral+sprouting+by+aminergic+and+cholinergic+afferents+in+the+hippocampal+formation.">Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation.</a> Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).</li><li>Nelson, R. J., Young, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+in+mice+with+targeted+disruption+of+single+genes.">Behavior in mice with targeted disruption of single genes.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Dieses Protokoll beschreibt, wie man einen pharmakogenetischen Ansatz (DREADD) anzuwenden, um zu untersuchen, wie eine bestimmte Hirnregion trägt zu einer Mehrphasen komplexen Lernaufgabe. Mit der Fähigkeit, vorübergehend zum Schweigen zu bringen und aus der Ferne neuronalen Aktivität in Hirnregionen in diskreten Phasen des Lernens, diese Kombination von Ansätzen bietet eine Plattform, um eine breite Palette von Verhaltensweisen, einschließlich differenzierter oder maskiert Lernformen zu untersuchen. Bei dem in di...

Eine spannende Herausforderung auf dem Gebiet der Behavioral Neuroscience ist es, die neuronalen Substrate komplexe Verhaltensweisen zu bestimmen. Eine Anzahl von Techniken, wie beispielsweise Dauer Läsionen, temporäre Gehirn Inaktivierung über Kanülenimplantate und Optogenetik verwendet worden sind, um die Beiträge der einzelnen Gehirnregionen zu Subkomponenten komplexe Verhaltensweisen zu identifizieren. Während diese Ansätze informieren unser Verständnis der regionalen Spezifität beim Lernen, ist jede Technik nicht ohne Einschränkungen. Insbesondere werden Läsionen typischerweise permanent durchgeführt vor der Verhaltenstests, wodurch ihre Wirkung während der gesamten Dauer des Paradigmas vorliegen. Kanülierung Studien, die die Vorlage eines kurzfristigen neuronalen Inaktivator (zB Tetrodotoxin) beinhalten können erhebliche Schäden an Hirngewebe zu produzieren und können Stress bei Patienten kurz vor der Verhaltenstests zu induzieren. Weiterhin wird die Inaktivierung durch Kanülierung in die Region des Gewebes, die die Umgebung begrenztSpitze der Kanülen. Schließlich, während Optogenetik bietet eine Reihe von Flexibilität für die zeitliche Steuerung der Aktivität in bestimmten Hirnregionen, ist es kostspielig und technisch anspruchsvoll. Diese Einschränkungen können mit einer pharmakogenetischen Ansatz (Designer-Rezeptoren-Exklusiv-Activated-by-Designer-Drogen, DREADDs) 1,2 überwunden werden. Wichtig ist, dass, während das Konzept der Pharmakogenetik ist anspruchsvoll, ist die Ausführung der Technik unkompliziert. Ähnlich herkömmlichen stereotaktischen chirurgischen Methoden, die Infusion von Toxin (zB NMDA, Ibotensäure) in diskreten Gehirnbereichen beinhaltet diese Technik das Infundieren eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), die ein DNA-Fragment für ein modifiziertes inhibitorische G-Protein-gekoppelten Rezeptor enthält beinhalten (hM4Di; der Designer-Rezeptor) in dem interessierenden Bereich von Standard-Labornagern (siehe Abbildung 1). Der virale Vektor enthält auch einen fluoreszierenden Reporter (mcitrine). Einmal in eingeauf Zellen, die Designer-Rezeptor (und Reporterprotein) maximal exprimiert ~ 3 Wochen nach der Infusion und selektiv für 2-5 Stunden nach der systemischen Verabreichung des ansonsten biologisch inert Designerdroge, Clozapin-N-oxid aktiviert werden (CNO) 1 , 3. Weil der Experimentator mit präziser, noch remote zeitliche Kontrolle über neuronale Aktivität in bestimmten Hirnregionen ausgestattet, kombiniert Pharmakogenetik besonders gut mit Verhaltensparadigmen, die in mehreren Phasen durchgeführt werden. In diesem Beispiel ist der Beitrag der retrosplenialen Cortex (RSC) auf einen Reiz-Stimulus Lernen wird zu seiner Rolle bei Pavlovian Lernens verglichen jedoch Kombination dieser beiden Ansätze ist gut geeignet, um eine beliebige Anzahl von Fragen, die zu ermitteln, wie bestimmte Hirnregionen tragen zu suchen komplexes Verhalten. Darüber hinaus, während in dem vorliegenden Protokoll beschrieben, können virale und transgene Ansätze verwendet werden, um Zelltyp-spezifische Expression DREADD 2 zu erzielen. Da ichs eigen Verhaltensparadigmen, die pharmakologischen und / oder andere Arten von experimentellen Manipulationen, sorgfältige Prüfung der Versuchsaufbau und die anschließende quantitative Analyse beteiligt ist erforderlich, wenn unter Verwendung der DREADD Ansatz. Experimentatoren neu in der DREADD Ansatz sind, um eine umfassende Überprüfung der derzeitigen DREADD Technik 2 bezeichnet. Jeden Tag Organismen lernen Sie neue Impulse und Ereignisse und ihre Beziehungen untereinander. Selbst in einer vertrauten Umgebung, wie zu Hause, ist eine schnell zu Veränderungen in den Beziehungen zwischen Reizen zu erkennen, weil diese Änderungen können prädiktiv für sinnvolle Veranstaltungen. Solche Stimulus-Stimulus (dh relational) beinhaltet die Lernzusammengehen mehrerer Reize und ist traditionell mit dem Hippocampus, die zentral innerhalb des medialen Temporallappens 4 wohnt in Verbindung gebracht. Allerdings ist der Hippocampus nicht vorhanden, noch isoliert handeln; kortikalen Regionen innerhalb und außerhalbSeite der medialen Temporallappen liefern wichtige sensorische Information an den Hippokampus 5-7. Traditionelle Permanent Läsion Studien liefern überzeugende Beweise für die Beteiligung einer Reihe von kortikalen Regionen (zB die retrosplenialen, postrhinal und entorhinalen Kortex) in hippocampalen abhängigen Lern sind jedoch in ihrer Fähigkeit, die Rolle eines bestimmten Bereichs bei diskreten Phasen unterscheiden begrenzt Lernen 8-10. Das vorliegende Protokoll testet die Hypothese, dass die RSC ist für Stimulus-Stimulus Lernen erforderlich, durch Schweigen den RSC während einer einzelnen Phase einer 3-Phasen-sensorische Präkonditionierung Paradigma 11,12. Kurz gesagt, erhalten Ratten Infusionen eines AAV, die die Designer-Rezeptor umfasst und ca. 3 Wochen später sind die Designer-Droge (CNO) 30 Minuten vor dem Beginn der Verhaltenstests verabreicht. In dem vorliegenden Protokoll zu empfangen Versuchsratten CNO während der ersten Phase der Prüfung (wenn Stimulus-Stimulus learning auftritt), und sie Fahrzeugs während der nächsten 2 Phasen des Tests unterzogen. Um unbeabsichtigte Auswirkungen der CNO auf Verhalten zu steuern, ziehen Ratten mit dem Designer-Rezeptor (hM4Di) und spritzen mit Fahrzeug statt CNO. Um die für die allgemeine Wirkung von viralen Infusion und Rezeptorexpression Konto, ziehen ein Steuer Virus, das nicht enthält den Designer-Rezeptor und verwalten CNO. Eine Anzahl von verschiedenen Serotypen von AAV verwendet werden, um genetisches Material zu liefern. Die aktuellen NIH Richtlinien für die Forschung an rekombinante oder synthetische Moleküle behält diese AAV (alle Serotypen) und rekombinante oder synthetische AAV-Konstrukte, in denen das Transgen nicht entweder eine potentiell tumorigenen Genprodukt oder ein Toxinmolekül kodieren, und werden in der Abwesenheit eines erzeugten Helfervirus erfordert BSL-1 Vorsichtsmaßnahmen (Anhang B-1. Risikogruppe 1 (RG1) Agents) 13. A Anzahl der Bewertungen im Zusammenhang mit AAV-Struktur, Nutzen und Sicherheit sind 14,15. Bemerkenswert ist, wenn, Aufgrund von Bedenken in Bezug auf mögliche Fortpflanzungs 16,17 und potenziellen karzinogenen Mechanismen 18-20 in Nagetieren, einige Institutionen erfordern die Verwendung von BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen bei der Arbeit mit AAV. Überprüfen Sie die entsprechende BSL vor durch Rücksprache mit Aufsichtsgremien bei einzelnen Institutionen in denen die Forschung, die Centers for Disease Control und den NIH-Richtlinien für die Forschung an rekombinanten DNA-Moleküle 13 bei der Verwendung von viralen Vektoren für die Gen-Manipulation in den Vereinigten Staaten durchgeführt werden, zu nutzen. Personenschutz, Ermittler Ausbildung, Vektor-Containment, Dekontamination, Entsorgung dekontaminiert Materialien und Nacheinspritzung Tierhaltung Anforderungen werden von diesen Leitlinien festgelegt. Darüber hinaus beraten und folgen geeigneten Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Richtlinien oder gleichwertig institutionellen Aufsichtsgremium Richtlinien, um die sichere Handhabung, Verwaltung und Veräußerung von AAV zu gewährleisten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Male, Long Evans Rats, 55-60 d</td>
			<td >Hilltop Lab Animals Inc</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine</td>
			<td >Virus Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>Caution:&#160; This is a BSL-1 compound</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rAAV8/hSyn-GFP</td>
			<td >Virus Vector Core</td>
			<td ></td>
			<td>Caution:&#160; This is a BSL-1 compound</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clozapine-N-Oxide</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td >4936-10</td>
			<td>Designer Drug</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rat Cage lid (Polycarbonate)</td>
			<td >Alternative Design&#160;</td>
			<td >FT 8XL-PC</td>
			<td>Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filer Paper (Replacement)</td>
			<td >Alternative Design&#160;</td>
			<td >FP-R-1018XAD</td>
			<td>Filter paper that goes with cage lids</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table Top Vise</td>
			<td >JETS</td>
			<td >2201-265</td>
			<td>For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medline Biohazard liners&#160;</td>
			<td >Staples</td>
			<td >113444</td>
			<td>Biohazard Trash Bags</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle&#160;</td>
			<td >Amazon.com</td>
			<td ></td>
			<td>Biohazard Trash Can</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane, 100 mL</td>
			<td >Patterson Veterinary Supply Inc.&#160;</td>
			<td >07-890-8540</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 942</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat)</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 955</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthesia Mask (Rat)</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 906</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model 1474</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microdrill burrs, 0.9 mm</td>
			<td >Fine Science Tools Inc</td>
			<td >19007-09</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Syringe pump with Micro4 Controller&#160;</td>
			<td >David Kopf</td>
			<td >Model UMP3-1</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit</td>
			<td >Ahdis</td>
			<td >21420</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Betadine Skin Cleanser</td>
			<td >Perdue&#160; Products L.P</td>
			<td >67618-149-04</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triple Antiobiotic Ointment</td>
			<td >Medline Supply</td>
			<td >53329-087-01</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puralube Vet Ointment</td>
			<td >Only Veterinary Supply</td>
			<td >17033-211-38</td>
			<td>Surgical supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dino-lite&#160;</td>
			<td >Microscope</td>
			<td >AD7013MTL</td>
			<td>An alternative to the traditional disection scope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand</td>
			<td >Microscope</td>
			<td >MS36B</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >28 Gauge 10uL Syringe</td>
			<td >Hamilton&#160;</td>
			<td >80308-701SN</td>
			<td>Surgical equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-018MD</td>
			<td>22&#39;Wx22&#34;Hx16&#34;D</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra Tall Modular Test Chamber</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-007</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stainless Steel Grid Floor&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-005</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >House Light</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-215M</td>
			<td>Used as the house light and stimulus light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Modular Pellet Dispenser&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-203M-45</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pellet Recetacle, Cup Type</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-200R1M</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Head Entry Detector for Rat</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-254-CB</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dustless precision food pellets, 45 mg</td>
			<td >Bio-Serv</td>
			<td >F0165</td>
			<td >Behavioral supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cage Speaker for Rat Chamber</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ENV-224AM</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Programmable Audio Generator&#160;</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >ANL-926</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Smart Ctrl 8 Input/16 output Package</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >DIG-716P2</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large Table Top Cabinet and Power Supply</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >SG-6510D</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCI Interface Package</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >DIG-700P2-R2</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19&#34; Monitor</td>
			<td >Med Associates, Inc</td>
			<td >COM-103V</td>
			<td>Behavioral equipment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (grannular), 1 kg</td>
			<td >Electron Microsopy Sciences</td>
			<td >19210</td>
			<td>Hazard:&#160; carcinogen, weigh in hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag)</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >3724S</td>
			<td>Histology reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >XP Rabbit monoclonal antibody (GFP)</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >2956S</td>
			<td>Histology reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Rabbit IgG</td>
			<td >Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td >4412S</td>
			<td>Histology supplies</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost Plus slides&#160;</td>
			<td >VWR international</td>
			<td >483111-703</td>
			<td>Histology supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for remotely silencing neural activity in rodents during discrete phases of learning

Dieses Protokoll beschreibt, wie vorübergehend zum Schweigen zu bringen und aus der Ferne die neuronale Aktivität in einzelnen Gehirnregionen, während die Tiere in Lern- und Gedächtnisaufgaben beschäftigt. Der Ansatz kombiniert Pharmakogenetik (Designer-Rezeptoren-Exklusiv-Activated-by-Designer-Drogen) mit einem Verhaltensparadigma (sensorischen Präkonditionierung) dazu bestimmt ist, zwischen verschiedenen Lernformen zu unterscheiden. Insbesondere wird viral-vermittelte Abgabe verwendet werden, um eine genetisch modifizierte inhibitorische G-Protein-gekoppelten Rezeptor (der Designer Receptor) in einer diskreten Region des Gehirns im Nagetier auszudrücken. Drei Wochen später, als Designer-Rezeptor-Expressionsniveaus hoch sind, ein pharmakologisches Mittel (der Designer Drug) wird systemisch 30 Minuten vor einem bestimmten Verhaltens Sitzung verabreicht. Das Arzneimittel besitzt eine Affinität für den Designer-Rezeptor und damit zu einer Hemmung der Neuronen, die den Designer-Rezeptor exprimieren, ist ansonsten biologisch inert. Die Hirnregion bleibt für 2-5 Stunden zum Schweigen (DEPENDing von der Dosis und dem Weg der Verabreichung). Nach Beendigung der Verhaltensparadigma wird Hirngewebe für die korrekte Platzierung und Rezeptor-Expression bewertet. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Bestimmung der Anteile der einzelnen Gehirnregionen bestimmte Komponenten von Verhalten und kann über eine beliebige Anzahl von Verhaltensparadigmen verwendet werden.

Behavioral Ergebnisse Bei Beendigung des Versuchs sollte die Wirksamkeit der regionsspezifischen temporären Inaktivierung quantitativ und qualitativ bewertet werden. Das vorliegende Beispiel beinhaltet eine 3-Phasen-Verhaltensparadigma (sensorischen Präkonditionierung), in dem CNO wurde verabreicht, um die neuronale Aktivität in dem RSC während der Vorkonditionierung Sitzungen zu dämpfen, um die Hypothese, dass die RSC ist notwendig für die Bildung von Assoziationen zwischen neutralen Sti...

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A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

Ein Verfahren zum Fern Silencing neuronale Aktivität in Nagetiere Während diskreter Phasen des Lernens

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

14.6K Aufrufe.  Oberlin College. This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

Serie: A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of humans with orofacial pain. To measure meal duration unrestrained rats are continuously kept in sound attenuated, computerized feeding modules for days to weeks to record feeding behavior. These sound-attenuated chambers are equipped with chow pellet dispensers. The dispenser has a pellet trough with a photobeam placed at the bottom of the trough and when a rodent removes a pellet from the feeder trough this beam is no longer blocked, signaling the computer to drop another pellet. The computer records the date and time when the pellets were taken from the trough and from this data the experimenter can calculate the meal parameters. When calculating meal parameters a meal was defined based on previous work and was set at 10 min (in other words when the animal does not eat for 10 min that would be the end of the animal&#39;s meal) also the minimum meal size was set at 3 pellets. The meal duration, meal number, food intake, meal size and inter-meal interval can then be calculated by the software for any time period that the operator desires. Of the feeding parameters that can be calculated meal duration has been shown to be a continuous noninvasive biological marker of orofacial nociception in male rats and mice and female rats. Meal duration measurements are quantitative, require no training or animal manipulation, require cortical participation, and do not compete with other experimentally induced behaviors. These factors distinguish this assay from other operant or reflex methods for recording orofacial nociception.

A lengthening in meal duration represents orofacial nociceptive behavior in rodents similar to the guarding behavior of humans with orofacial pain. Eating is a behavior that requires no training or animal manipulation, requires cortical participation, and is not competing with other experimentally induced behaviors, distinguishing this assay from alternative reflex or operant measurements.

Essensdauer als Maß für orofstägliche nozizeptive Reaktionen bei Nagetieren

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of ...

Forschung

Verhalten

Automated Visual Cognitive Tasks for Recording Neural Activity Using a Floor Projection Maze

Neuropsychological tasks used in primates to investigate mechanisms of learning and memory are typically visually guided cognitive tasks. We have developed visual cognitive tasks for rats using the Floor Projection Maze1,2&#160;that are optimized for visual abilities of rats permitting stronger comparisons of experimental findings with other species.
In order to investigate neural correlates of learning and memory, we have integrated electrophysiological recordings into fully automated cognitive tasks on the Floor Projection Maze1,2. Behavioral software interfaced with an animal tracking system allows monitoring of the animal's behavior with precise control of image presentation and reward contingencies for better trained animals. Integration with an in vivo electrophysiological recording system enables examination of behavioral correlates of neural activity at selected epochs of a given cognitive task.
We describe protocols for a model system that combines automated visual presentation of information to rodents and intracranial reward with electrophysiological approaches. Our model system offers a sophisticated set of tools as a framework for other cognitive tasks to better isolate and identify specific mechanisms contributing to particular cognitive processes.

We describe protocols for training rats for chronic electrophysiological recordings in fully automated cognitive tasks on a Floor Projection Maze.

Automatisierte kognitive Anforderungen für die Aufnahme Neuronale Aktivität Mit einer Bodenprojektion Maze

Neuropsychological tasks used in primates to investigate mechanisms of learning and memory are typically visually guided cognitive tasks. We have ...

Measuring Neural and Behavioral Activity During Ongoing Computerized Social Interactions: An Examination of Event-Related Brain Potentials

Social exclusion is a complex social phenomenon with powerful negative consequences. Given the impact of social exclusion on mental and emotional health, an understanding of how perceptions of social exclusion develop over the course of a social interaction is important for advancing treatments aimed at lessening the harmful costs of being excluded. To date, most scientific examinations of social exclusion have looked at exclusion after a social interaction has been completed. While this has been very helpful in developing an understanding of what happens to a person following exclusion, it has not helped to clarify the moment-to-moment dynamics of the process of social exclusion. Accordingly, the current protocol was developed to obtain an improved understanding of social exclusion by examining the patterns of event-related brain activation that are present during social interactions. This protocol allows greater precision and sensitivity in detailing the social processes that lead people to feel as though they have been excluded from a social interaction. Importantly, the current protocol can be adapted to include research projects that vary the nature of exclusionary social interactions by altering how frequently participants are included, how long the periods of exclusion will last in each interaction, and when exclusion will take place during the social interactions. Further, the current protocol can be used to examine variables and constructs beyond those related to social exclusion. This capability to address a variety of applications across psychology by obtaining both neural and behavioral data during ongoing social interactions suggests the present protocol could be at the core of a developing area of scientific inquiry related to social interactions.

Research on social exclusion has grown tremendously in recent years. As the field expands, it is imperative to develop sophisticated methodologies allowing for the simultaneous measurement of neural and behavioral outcomes during social exclusion. This protocol utilizes event-related brain potentials to record ongoing neural activity during computerized social interactions.

Mess Neural and Behavioral Aktivität während des laufenden Computerized Soziale Interaktionen: Eine Untersuchung der ereignisbezogenen Hirnpotenziale

Social exclusion is a complex social phenomenon with powerful negative consequences. Given the impact of social exclusion on mental and emotional health, ...

The Double-H Maze: A Robust Behavioral Test for Learning and Memory in Rodents

Spatial cognition research in rodents typically employs the use of maze tasks, whose attributes vary from one maze to the next. These tasks vary by their behavioral flexibility and required memory duration, the number of goals and pathways, and also the overall task complexity. A confounding feature in many of these tasks is the lack of control over the strategy employed by the rodents to reach the goal, e.g., allocentric (declarative-like) or egocentric (procedural) based strategies. The double-H maze is a novel water-escape memory task that addresses this issue, by allowing the experimenter to direct the type of strategy learned during the training period. The double-H maze is a transparent device, which consists of a central alleyway with three arms protruding on both sides, along with an escape platform submerged at the extremity of one of these arms.
Rats can be trained using an allocentric strategy by alternating the start position in the maze in an unpredictable manner (see protocol 1; &#167;4.7), thus requiring them to learn the location of the platform based on the available allothetic cues. Alternatively, an egocentric learning strategy (protocol 2; &#167;4.8) can be employed by releasing the rats from the same position during each trial, until they learn the procedural pattern required to reach the goal. This task has been proven to allow for the formation of stable memory traces.
Memory can be probed following the training period in a misleading probe trial, in which the starting position for the rats alternates. Following an egocentric learning paradigm, rats typically resort to an allocentric-based strategy, but only when their initial view on the extra-maze cues differs markedly from their original position. This task is ideally suited to explore the effects of drugs/perturbations on allocentric/egocentric memory performance, as well as the interactions between these two memory systems.

The goal of this protocol is to investigate spatial cognition in rodents. The double-H water maze is a novel test, which is particularly useful to elucidate the different components of learning, consolidation and memory, as well as the interplay of memory systems.

Die Doppel-H Maze: A Robust Verhaltenstest für Lernen und Gedächtnis in Nagetiere

Spatial cognition research in rodents typically employs the use of maze tasks, whose attributes vary from one maze to the next. These tasks vary by their ...

Quantifying Learning in Young Infants: Tracking Leg Actions During a Discovery-learning Task

Task-specific actions emerge from spontaneous movement during infancy. It has been proposed that task-specific actions emerge through a discovery-learning process. Here a method is described in which 3-4 month old infants learn a task by discovery and their leg movements are captured to quantify the learning process. This discovery-learning task uses an infant activated mobile that rotates and plays music based on specified leg action of infants. Supine infants activate the mobile by moving their feet vertically across a virtual threshold. This paradigm is unique in that as infants independently discover that their leg actions activate the mobile, the infants&#8217; leg movements are tracked using a motion capture system allowing for the quantification of the learning process. Specifically, learning is quantified in terms of the duration of mobile activation, the position variance of the end effectors (feet) that activate the mobile, changes in hip-knee coordination patterns, and changes in hip and knee muscle torque. This information describes infant exploration and exploitation at the interplay of person and environmental constraints that support task-specific action. Subsequent research using this method can investigate how specific impairments of different populations of infants at risk for movement disorders influence the discovery-learning process for task-specific action.

A method is described in which 3-4 month old infants learn a task by discovery and their leg movements are captured to quantify the learning process.

Quantifizierung Lernen bei jungen Säuglingen: Tracking-Leg Aktionen während eines Ermittlungs-Learning-Task-

Task-specific actions emerge from spontaneous movement during infancy. It has been proposed that task-specific actions emerge through a discovery-learning ...

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for quantifying locomotor deficits in rodents is to measure minute disturbances of unconstrained gait overground (e.g., manual BBB score or automated CatWalk). However, cortical inputs are not required for the generation of basic locomotion produced by the spinal central pattern generator (CPG). Thus, unconstrained walking tasks test locomotor deficits due to motor cortical impairment only indirectly. In this study, we propose a novel, precise foot-placement locomotor task that evaluates cortical inputs to the spinal CPG. An instrumented peg-way was used to impose symmetrical and asymmetrical locomotor tasks mimicking lateralized movement deficits. We demonstrate that shifts from equidistant inter-stride lengths of 20% produce changes in the forelimb stance phase characteristics during locomotion with preferred stride length. Furthermore, we propose that the asymmetric walkway allows for measurements of behavioral outcomes produced by cortical control signals. These measures are relevant for the assessment of impairment after cortical damage.

Here, we present a protocol to quantify precise stepping in rodents. Cortical and the spinal central pattern generator signals are required for precise foot-placement during obstructed locomotion. We report here the novel constrained walking task that directly examines precise stepping behavior.

Asymmetrische Walkway: Roman Behavioral Assay zur Untersuchung Asymmetrische Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Using the Activity-based Anorexia Rodent Model to Study the Neurobiological Basis of Anorexia Nervosa

Anorexia nervosa (AN) is a psychiatric illness characterized by excessively restricted caloric intake and abnormally high levels of physical activity. A challenging illness to treat, due to the lack of understanding of the underlying neurobiology, AN has the highest mortality rate among psychiatric illnesses. To address this need, neuroscientists are using an animal model to study how neural circuits may contribute toward vulnerability to AN and may be affected by AN. Activity-based anorexia (ABA) is a bio-behavioral phenomenon described in rodents that models the key symptoms of anorexia nervosa. When rodents with free access to voluntary exercise on a running wheel experience food restriction, they become hyperactive &#8211; running more than animals with free access to food. Here, we describe the procedures by which ABA is induced in adolescent female C57BL/6 mice. On postnatal day 36 (P36), the animal is housed with access to voluntary exercise on a running wheel. After 4 days of acclimation to the running wheel, on P40, all food is removed from the cage. For the next 3 days, food is returned to the cage (allowing animals free food access) for 2 hr daily. After the fourth day of food restriction, free access to food is returned and the running wheel is removed from the cage to allow the animals to recover. Continuous multi-day analysis of running wheel activity shows that mice become hyperactive within 24 hr following the onset of food restriction. The mice run even during the limited time during which they have access to food. Additionally, the circadian pattern of wheel running becomes disrupted by the experience of food restriction. We have been able to correlate neurobiological changes with various aspects of the animals&#8217; wheel running behavior to implicate particular brain regions and neurochemical changes with resilience and vulnerability to food-restriction induced hyperactivity.

Here we present a protocol to induce activity-based anorexia (ABA) in female adolescent mice. ABA is a condition of hyperactivity evoked by imposing food restriction on rodents with access to a running wheel. This phenomenon is being used as a model to study the underlying neurobiology of anorexia nervosa.

Unter Verwendung des Activity-based Anorexia Nagetiermodell die neurobiologischen Grundlagen von Anorexia Nervosa Study

Anorexia nervosa (AN) is a psychiatric illness characterized by excessively restricted caloric intake and abnormally high levels of physical activity. A ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental paradigms and analysis tools have been limited to constrained laboratory tasks and contexts due to technical limitations imposed by the available set of measuring and analysis techniques and the age of the subjects. These limitations severely limit the study of developmental neural dynamics and associated neural networks engaged in cognition, perception and action in infants performing &#8220;in action and in context&#8221;. This protocol presents a novel approach to study infants and young children as they freely organize their own behavior, and its consequences in a complex, partly unpredictable and highly dynamic environment. The proposed methodology integrates synchronized high-density active scalp electroencephalography (EEG), inertial measurement units (IMUs), video recording and behavioral analysis to capture brain activity and movement non-invasively in freely-behaving infants. This setup allows for the study of neural network dynamics in the developing brain, in action and context, as these networks are recruited during goal-oriented, exploration and social interaction tasks.

This protocol presents a novel methodology for the neural decoding of intent from freely-behaving infants during unscripted social interaction with an actor. Neural activity is acquired using non-invasive high-density active scalp electroencephalography (EEG). Kinematic data is collected with inertial measurement units and supplemented with synchronized video recording.

A Novel experimentellen und analytischen Ansatz zur multimodalen Neural Decoding of Intent Während Soziale Interaktion in Frei-verhalten menschliche Säuglinge

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Feeding Experimentation Device (FED): Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in mice: the Feeding Experimentation Device (FED). FED is an open-source system that was designed to facilitate flexibility in food intake studies. Due to its compact and battery powered design, FED can be placed within standard home cages or other experimental equipment. Food intake measurements can also be synchronized with other equipment in real-time via FED's transistor-transistor logic (TTL) digital output, or in post-acquisition processing as FED timestamps every event with a real-time clock. When in use, a food pellet sits within FED's food well where it is monitored via an infrared beam. When the pellet is removed by the mouse, FED logs the timestamp onto its internal secure digital (SD) card and dispenses another pellet. FED can run for up to 5 days before it is necessary to charge the battery and refill the pellet hopper, minimizing human interference in data collection. Assembly of FED requires minimal engineering background, and off-the-shelf materials and electronics were prioritized in its construction. We also provide scripts for analysis of food intake and meal patterns. Finally, FED is open-source and all design and construction files are online, to facilitate modifications and improvements by other researchers.

Feeding Experimentation Device FED: Construction and Validation of an Open-source Device for Measuring Food Intake in Rodents

Feeding Experimentation Device (FED) is an open-source device for measuring food intake in mice. FED can also synchronize food intake measurements with other techniques via a real-time digital output. Here, we provide a step-by-step tutorial for the construction, validation, and usage of FED.

Feeding Experimentation Gerät (FED): Konstruktion und Validierung eines Open-Source-Vorrichtung zur Messung der Nahrungsaufnahme bei Nagetiere

Food intake measurements are essential for many research studies. Here, we provide a detailed description of a novel solution for measuring food intake in ...

A Computational Method to Quantify Fly Circadian Activity

In most animals and plants, circadian clocks orchestrate behavioral and molecular processes and synchronize them to the daily light-dark cycle. Fundamental mechanisms that underlie this temporal control are widely studied using the fruit fly Drosophila melanogaster as a model organism. In flies, the clock is typically studied by analyzing multiday locomotor recording. Such a recording shows a complex bimodal pattern with two peaks of activity: a morning peak that happens around dawn, and an evening peak that happens around dusk. These two peaks together form a waveform that is very different from sinusoidal oscillations observed in clock genes, suggesting that mechanisms in addition to the clock have profound effects in producing the observed patterns in behavioral data. Here we provide instructions on using a recently developed computational method that mathematically describes temporal patterns in fly activity. The method fits activity data with a model waveform that consists of four exponential terms and nine independent parameters that fully describe the shape and size of the morning and evening peaks of activity. The extracted parameters can help elucidate the kinetic mechanisms of substrates that underlie the commonly observed bimodal activity patterns in fly locomotor rhythms.

A method to quantify the main temporal features seen in fly circadian locomotor rhythms is presented. The quantification is achieved by fitting fly activity with a multi-parametric model waveform. The model parameters describe the shape and size of the morning and evening peaks of daily activity.