NGL wurde von der Wayne State University in Perinatal Initiative von Müttern, Perinatal and Child Health. Wir danken Maureen McGerty und Amy E. Furcron (Wayne State University) für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Vor der Arbeit mit den in diesem Protokoll genannten Proben müssen Tier ethische Genehmigung durch die lokalen Forschungsethikkommission und der Institutional Review Boards gegeben. Bei der Arbeit mit Tierblut, Zellen oder gefährliche Mittel, wie in diesem Protokoll erwähnt, müssen die richtige biologische Sicherheit und Laborsicherheitsmaßnahmen eingehalten werden. 1. Maus Handhabung und Gewebeentnahme <ol><li> Bereiten Sie eine sterile Arbeitsstation und erhalten sterile Werkzeuge für Gewebesammlung. Diese Werkzeuge sind große und kleine chirurgische Scheren, Pinzetten, und Feinspitze Pinzette. Umfassen kleine Petrischalen mit dem entsprechenden Gewebe-Namen versehen, mit 1 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt (3-5 ml) auf Raumtemperatur äquilibriert (20-22 ° C). Auch eine große Petrischale, unbeschriftet, mit 1x PBS-Lösung gefüllt (10-15 ml). </li><li> Euthanize einer schwangeren Maus (10,5 bis 19,0 Tage nach coitum (dpc) oder vor der Abgabe) unter Verwendung von Kohlendioxid (CO 2). Um sicherzustellen, dass die Maus getötet, verwenden Sie den Genickbruch-Technik. Hinweis: Vor 10,5 dpc, ist es schwierig, die Dezidua-Gewebe aus der Uterusgewebe von Hand zu trennen. Wenn die Isolierung der Dezidua-Leukozyten nicht erforderlich ist, Leukozyten aus den Uterusgewebe von nicht-schwangeren Mäusen oder von Mäusen, denen in &lt;10,5 dpc kann auch über diesen Protokoll durchgeführt werden. </li><li> Verwendung eines Paares von sterilen OP-Schere, die unteren Bauchteil der Haut und Muskelgewebe vollständig zu entfernen. Mit einer Pinzette, bewegen beiseite alle anderen Organe, bis die Gebärmutter und Eierstöcke sichtbar sind. Mit der Uterus noch angebracht, verwenden Sie die Zange, um sie außerhalb der Bauchhöhle (Abbildung 1A) zu bewegen. </li><li> Suchen Sie die Eierstöcke distal der Eileiter und uterotubalen Verbindungs ​​jedes Uterushorn. Mit den kleinen chirurgischen Schere, einen Einschnitt an der uterotubalen Verbindungs ​​und trennen Sie die Gebärmutterhörner aus dem Mesenterium, die die Gebärmuttergefäße; dann,Verbrauch an der Cervix, die Gebärmutterhörner von der Peritonealhöhle (1B) zu lösen. </li><li> Mit kleinen chirurgischen Schere, einen Einschnitt zwischen dem Gebärmutterhals und dem unteren Segment der Uterushörner. Leave befestigt einen Teil des Gebärmutterhalses während dieses Prozesses (1C), um zu vermeiden Öffnen des Uterushorns. </li><li> Einzutauchen Uterushörner (einschließlich dem Gebärmutterhals) in einer großen Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt (10-15 ml), um die Implantationsstellen hydratisieren. </li><li> Während noch in 1x PBS-Lösung eingetaucht, schneiden Sie Fett aus den Uterushörner mit den kleinen chirurgische Scheren. Halten Sie die in 1x PBS-Lösung in der gesamten Präparation eingetaucht Gewebe. </li><li> Halten Sie die Gebärmutterhörner an Ort und Stelle mit der Zange, entfernen Sie eine der Implantationsstellen aus der Gebärmutter mit einem quer durch die inter-Implantationsbereich schneiden, mit den kleinen chirurgische Scheren (1D). Die Implantationsstelle enthält den Fötus durch die umgebenChorioallantoismembran und die uterine, Dezidua und Plazenta-Gewebe. </li><li> Unter Verwendung der Zange, halten Sie die Website vorhanden und machen einen kleinen Schnitt in der Gebärmutterwand neben der Plazenta und Dezidua-Gewebe (1E). Ordnung um den Umfang der Plazenta / Dezidua bis diese sowohl von der Uteruswand und der Chorioallantoismembran dass der Fötus umfasst (1F) getrennt werden. </li><li> Entfernen Sie die Plazenta und die angeschlossenen dezidualen Gewebe und in 1x PBS-Lösung (3-5 ml; siehe Schritt 1.12). </li><li> Platzieren Sie den Fötus durch die Chorioallantoismembran den Uterusgeweben in einer Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt befestigt umgeben (3-5 ml). Die Hydratisierung von diesen Geweben wird die Trennung der Chorioallantoismembran von der Gebärmutterwand zu erleichtern (siehe Schritt 1.14). </li><li> Verwendung eines Paares von Fein Spitze Pinzette, ziehen Sie vorsichtig die Decidua (weiß-grau-Schicht) aus der Plazenta Oberfläche. Führen Sie dieseSchritt sorgfältig, um die Integrität der Plazenta und Dezidua-Gewebe (1G) zu halten. </li><li> Legen Sie die Plazenta und Dezidua-Gewebe in zwei separat markierten Gerichte Petri mit 1x PBS-Lösung gefüllt (3-5 ml jeweils). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutterwand vom Chorioallantoismembran mit feinen Spitze Pinzette. Dies sind die Uterusgeweben. </li><li> Legen Sie die uterine Gewebe in einer Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt (3-5 ml). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.8 bis 1.15, bis alle Implantationsstellen verarbeitet worden sind. </li><li> Sammeln Sie mehrere uterine, Dezidua und Plazenta-Gewebe, die Ausbeute an Zellen während enzymatische Verdauung zu verbessern. Die Menge an Gewebe ist abhängig von der Wurfgröße; aber Leukozyten Isolierung erfordert&gt; 2 Stück Gewebe. Hinweis: Weitere detaillierte Informationen über die Präparation der Implantationsstellen auf verschiedenen Schwangerschafts Tage, sehen die Bilder in Kapitel zwei der Guide to Investigati gefundenauf der Maus 42 Schwangerschaft. </li></ol> 2. Uterine, Deziduale und Plazentagewebe Dissoziation <ol><li> Beschriften Sie mehrere sterile 2 ml konische Röhrchen mit dem entsprechenden Gewebe Namen, und legen Sie ein Fläschchen mit 1000 ul der Enzymlösung auf Eis. </li><li> Aus der Petrischale mit 1x PBS-Lösung gefüllt ist, übertragen zwei Stücke (100 bis 150 mg) der Uterus, decidual oder Plazentageweben an eine markierte 2 ml konischen Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 500 ul kalten Enzymlösung in jedes 2 ml konischen Röhrchen. </li><li> Mit feinen sterilen Schere, beginnen, um das Gewebe in der enzymatischen Lösung eingetaucht distanzieren, bis es fein zerkleinert wird. Mit der Zeit wird die Suspension ein milchiges Aussehen zu entwickeln. Dieser Schritt sollte mehr als 2 min nicht übersteigt, um Über Manipulation der Probe zu verhindern. </li><li> Sobald das Gewebe wurde gespalten, fügen Sie eine zusätzliche 500 ul kalten enzymatische Lösung für das 2 ml konischen Röhrchen. </li><li> Legen Sie die 2 ml konischen Röhrchen auf Eis. </li><li> Die Schritte 2.2 bis 2.6 wobei jede einzelne Gewebe bis alle Gewebe verarbeitet worden sind. </li><li> Übertragen Sie alle 2 ml konische Röhrchen mit homogenisierten Gewebe (zerkleinerte Gewebe + Enzymlösung) Proben aus dem Eis in einem Brutschrank bei 37 ° C und führen Sie eine sanfte orbitalen Schütteln (80 rpm). Inkubieren für 30 bis 35 min. Sicherzustellen, dass die Temperatur des Inkubators vor Beginn der Inkubationszeit wird stabilisiert. </li><li> Nach der Inkubation, entfernen Sie die 2 ml konische Röhrchen mit dissoziierten Gewebe aus dem Inkubator und legen Sie sie auf Eis, um eine weitere Verdauung zu verhindern. </li><li> Beschriften Sie sterile 50 ml konische Röhrchen nach Gewebetyp. Entfernen Sie den Deckel und ersetzen Sie sie mit einer sterilen Zellsieb (100 &amp; mgr; m Porengröße). </li><li> Gießen Sie die dissoziierten Gewebe aus den 2 ml konische Röhrchen durch die Zelle Sieb mit ~ 20 ml 1x PBS-Lösung. Die Gewebefragmente werden in der Zelle Sieb verbleiben und die Zellsuspension wird durch sie hindurch. </li><li> Waschen Sie die dibestimungsbahnhof Gewebe im Zellsieb 2-3 Mal mit 20 ml 1x PBS-Lösung unter Verwendung einer Übertragungspipette. </li><li> Spülen Sie die leeren 2 ml konische Röhrchen mit 1x PBS-Lösung (1 ml) und den Inhalt durch die Zellsiebe. </li><li> Entfernen Sie die Zelle Siebe aus den 50 ml konische Röhrchen, und ersetzen Sie die Abdeckungen. Zentrifugieren der Röhrchen bei 1.250 × g für 10 min bei 4 ºC. </li><li> Vorsichtig den Überstand aspirieren, ohne das Zellpellet zu stören. Das Zellpellet enthält die isolierten Leukozyten und Stromazellen. </li><li> Resuspendieren das Zellpellet in 1 ml RPMI-Kulturmedium ohne fötales Rinderserum (FBS). Vorsichtig mischen. Verwenden Sie keine Wirbel. </li><li> Fügen Sie 500 ul ordentlich FBS auf eine 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr und langsam überlagern die Zellsuspension. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 1.100 × g ohne Bremse bei RT pelletiert lebensfähigen Zellen während Zelltrümmer im PBS / FBS-Schnittstelle erhalten bleiben. </li><li> Den Überstand aspirieren, ohne den Zellpellet. Die cell Pellet enthält meist lebensfähigen Zellen. </li><li> Optional: Um die mononuklearen Zellen zu konzentrieren, mit einem 20% igem gesättigtem Polysaccharidlösung, wie unten beschrieben. <ol><li> Zellpellet in 1000 ul RPMI Kulturmedium ohne FBS. </li><li> 1 ml 20% gesättigte Polysaccharidlösung in ein 5 ml Polystyrolkunststoffrohr und langsam lagern die Zellsuspension auf die Oberseite dieser Lösung, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Während Schichtung der Probe sollte das Mischen der 20% gesättigten Polysaccharidlösung mit der Zellsuspension. </li><li> Zentrifuge mit einem Ausschwingrotor bei 500 xg für 30 min bei RT ohne Bremse. Es ist sehr wichtig, schalten Sie die Bremse, um zu vermeiden, indem die Zellen und verlieren den Gradienten. Mononuklearen Zellen werden in der Grenzfläche zwischen dem 20% gesättigte Polysaccharidlösung und 1x PBS-Lösung ermittelt werden. </li><li> Absaugen und den Überstand verwerfen. Das Zellpellet enthält meist mononuklearen Zellen. Neinte: Um die Lebensfähigkeit Färbung und intrazelluläre Färbung durchzuführen, siehe Schritt 3. Um Immunphänotypisierung durchführen, finden Sie in Schritt 4. Um die Lebensfähigkeit Färbung und nur extrazelluläre Färbung durchzuführen, siehe Schritt 5. Um eine Zellkultur von isolierten Leukozyten durchführen, siehe Schritt 6. So führen magnetische Zellsortierung, siehe Schritt 7. </li></ol></li></ol> 3. Viability Staining für Fixable Cells <ol><li> Zellpellet in 1100 ul 1x PBS-Lösung. Vorsichtig mischen unter Verwendung einer Mikropipette. </li><li> Dann 100 ul der Zellsuspension in ein 5 ml Polystyrolkunststoffrohr. Fügen Sie 400 ul 1x PBS-Lösung in die 5 ml Polystyrolröhrchen. Dieses Rohr wird eine Steuerung zur Gewebeautofluoreszenz. Lagerung bei 4 ° C bis 3,5 Schritt. </li><li> Übertragen Sie die restlichen 1.000 &amp; mgr; l der Zellsuspension auf eine neue 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr. 1 ul der Lebensfähigkeit Farbstoff und schonend homogenisieren. Inkubation 30 min im Dunkeln bei 4 ° C. </li><li> Nach der Inkubation hinzufügen 1000 &amp; #181; l 1x PBS-Lösung. Vorsichtig mischen von Hand. </li><li> Zentrifuge jeweils 5 ml Polystyrolkunststoffrohre (Schritte 3.2 und 3.3) bei 1250 × g für 10 min bei 4 ºC. Absaugen und den Überstand verwerfen. Hinweis: Das Zellpellet (Schritt 3.3), wird in Schritt 4 Das Zellpellet (Schritt 3.2) wird als eine Kontrolle für die Gewebeautofluoreszenz zu dienen. </li></ol> 4. Immunphänotypisierung <ol><li> Zellpellet in 50 ul Anti-Maus-CD16 / CD32 (verdünnt 1: 100 in FACS-Puffer [0,1% BSA, 0,05% Natriumazid, 1x PBS-Lösung, pH 7,4]). Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig. Verwenden Sie nicht den Wirbel. </li><li> Inkubieren der Zellsuspension in 5 ml Polystyrolröhrchen in der Dunkelheit bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Nach der Inkubation werden 50 ul jeder Anti-Leukozyten monoklonalen Antikörper reagieren mit extrazellulären Zelloberflächenmarker oder Isotyp-Kontroll-Antikörper (Antikörperverdünnungen müssen validiert werden). Zum Beispiel, um Leukozyten-Subpopulationen zu analysieren, verwenden Sie Anti-moverwenden Antikörper, die mit den folgenden Leukozyten Zelloberflächenmarker: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4 und CD8 (Tabelle 1). </li><li> Sobald Antikörper gegen extrazelluläre Marker auf die 5 ml Polystyrol-Kunststoffröhrchen hinzugefügt, vorsichtig mischen. Inkubieren in der Dunkelheit für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Während dieser Inkubation vorbereiten und pre-warm die Fixierung Pufferlösung (mit entionisiertem Wasser verdünnt, 1: 5) auf 37 ° C, falls erforderlich. Halten Sie den Puffer bei 37 ºC in der Finsternis, bis ihre Verwendung notwendig ist. </li><li> Nach 30 min Inkubation, fügen 500 ul FACS Puffer in der 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr und vorsichtig mischen. Dieser Schritt ist notwendig, um die Zellen zu waschen und zu entfernen überschüssiges ungebundenes Antikörper. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 1250 × g bei 4 ° C für 10 min. Absaugen und den Überstand verwerfen. Hinweis: Wenn die intrazelluläre Färbung nicht erforderlich ist, siehe Schritt 5. Wenn die intrazelluläre Färbung erforderlich ist, führen Permeabilisierung und Intrazelldere Färbung hier, und dann mit der Fixierung (Schritt 4.8) fortfahren. </li><li> Fügen Sie 500 ul der vorgewärmten Fixierung Pufferlösung zu dem Zellpellet und Inkubation im Dunkeln für 10 min bei 37 ºC. </li><li> Dispense 500 ul FACS-Puffer in die 5 ml Polystyrol-Kunststoffrohr. Vorsichtig mischen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 1250 × g bei 4 ° C für 10 min. Absaugen und den Überstand verwerfen. </li><li> Gib 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer zu jeder Probe. Diese Proben können nun mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Erwerben Sie die Proben sofort für beste Ergebnisse. </li></ol> 5. Viability Staining für Nicht behebbarer Cells <ol><li> Nach dem extrazellulären Immunphänotypisierung, Zellpellet in 500 ul FACS Puffer. </li><li> 1 &amp; mgr; l 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI, 200 ug / ml) kurz vor dem Erwerb der Probe. </li><li> Visualisieren Sie die Proben in 1 - 2 min nach DAPI mit einem Durchflusszytometer. </li></ol><ol><li> Bereiten Sie eine Workstation unter einem sterilen Abzug. Pre-warm das RPMI-Kulturmedium auf 37 ° C mit einem Wasserbad. </li><li> Zellpellet in 1000 &amp; mgr; l FACS-Puffer für die Zellzählung. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines automatischen Zellzähler oder Hämozytometer und 0,4% Trypanblau-Lösung, nach den Anweisungen des Herstellers. Notieren Sie die Gesamtlebendzellzahl. </li><li> Zentrifugation der Zellen bei 1250 × g bei 4 ° C für 10 min, um die FACS-Puffer zu entfernen. </li><li> Zellpellet in 500 ul vorgewärmtem RPMI Kulturmedium durch vorsichtiges Pipettieren 2 bis 3 Mal. </li><li> Platte die gewünschte Anzahl von Zellen in einer sterilen 24-Well-Platte und bei 37 ° C. Die Inkubationszeit wird von der Fragestellung bestimmt werden. </li></ol> 7. Magnetische Zellsortierung <ol><li> Richten Sie eine saubere Arbeitsstation mit den folgenden Stoffen: MS-Säulen, Magnet Zellseparator, 15ml konische Röhrchen 30 um Vortrennung Filtern und einem mehrgerüstigen. </li><li> Zellpellet in 500 &amp; mgr; l MACS-Puffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 × PBS-Lösung, pH 7,2). </li><li> Unter Verwendung eines automatischen Zellzähler oder Hämozytometer und 0,4% Trypanblau-Lösung, zu zählen und notieren Sie die Gesamtlebendzellzahl. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 1.250 × g bei 4 ° C für 10 min. Absaugen und den Überstand verwerfen. Fügen Sie eine weitere 500 ul MACS-Puffer. </li><li> Fortfahren, die magnetische Trennung folgenden Empfehlungen des Herstellers durchzuführen. </li><li> Bestimmen Sie die Reinheit mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. </li></ol>

Die Autoren offenbaren keine Interessenkonflikte.

Die einheitliche Datenerhebung, die die Fülle und phänotypischen Eigenschaften der infiltrierenden Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zeichnet ist wesentlich für das Verständnis der Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen. Verschiedene Techniken wurden beschrieben, dass die Isolierung der infiltrierenden Leukozyten aus den Mäusegeweben am mütterlich-fötalen Grenzfläche während der gesamten Schwangerschaft 31,38,39,43-46 erleichtern. Aber jede Technik unterschiedlich ist, verwend...

Immuntoleranz bei Schwangerschaft ist eine Periode, in Scheidungs ​​Veränderungen im Immunsystem der Mutter erfolgen. Diese Änderungen ermöglichen die Mutter auf den Fötus, eine semi-allogenen Transplantats 1 zu tolerieren. Der Fötus drückt väterlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) -Antigene 2 und fötalen Zellen im mütterlichen Kreislauf 3 gefunden worden ist; jedoch ist der Fötus nicht abgelehnt 4,5. Dieses Rätsel ist nicht vollständig geklärt. Die jüngste Hypothese besagt, dass Mutter und Fötus Toleranz während des Koitus erstellt und Befruchtung und 6,7 gehalten, um eine volle Laufzeit der Schwangerschaft 8-10 erhalten. Eine Aufschlüsselung dieser Mutter und Fötus Toleranz wird in der frühen und späten Stadien der Schwangerschaft 10-16 als einen Mechanismus der Krankheit. Mutter und Fötus Toleranz beinhaltet die Mitwirkung der verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen, einschließlich T-Zellen (regulatorische T-Zellen, Th1-Zellen, Th2-Zellen, und Th17-Zellen), macrophages, Neutrophilen, Mastzellen, NK-Zellen, NKT-Zellen, dendritische Zellen und B-Zellen, die Änderung in der Dichte und Lokalisierung während der Schwangerschaft 15,17-19. Der anatomischen Stelle, wo das Immunsystem der Mutter mit den fetalen Antigene 20,21 interagiert - Mutter und Fötus Toleranz wird am Mutter und Fötus-Schnittstelle 20 angereichert. Die Mutter und Fötus-Schnittstelle wird während des Plazenta erstellt, wenn die fetalen extravillösen Trophoblastenzellen dringen in die Uterusschleimhaut 22-24. Auf der fetalen Seite dieser Schnittstelle, die Membranen den Fötus umgibt, schaffen eine spezialisierte Epitheloberfläche innerhalb der Plazenta und die Synzytiotrophoblasten Zellen steuern den Stoffaustausch durch ihre direkten Kontakt mit Blut der Mutter 22. Auf der mütterlichen Seite der Schnittstelle, rekrutiert die decidua einen heterogenen Pool von Leukozyten, die bei Mäusen verantwortlich für 30% bis 50% aller Deciduazellen. Zusätzlich zu ihrer Beteiligung an Maternal Immuntoleranz, diese Zellen sind wichtige Mitwirkende zu verschiedenen Prozessen während der Schwangerschaft, z. B. der Schutz der reproduktiven Fläche von Infektionen, Befruchtung, Embryoimplantation 7,25, dezidualen Angiogenese 26, vaskuläre Remodeling 24,27, Trophoblastinvasion 28, Plazenta Entwicklungs 24,25, und schließlich Arbeit und Lieferung 15,17. Daher ist die Untersuchung der Leukozyten in Mutter und Fötus Toleranz beteiligt wichtig, die Aufklärung der Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen. Während die Verwendung von Immunhistochemie und Immunfluoreszenz wurden Daten für die direkte Visualisierung und Lokalisierung von Gebärmutter-, decidual oder Plazenta Leukozyten 29,30 erzeugt, Durchflusszytometrie-Analyse wurde weiterhin offenbart spezifische Untergruppen von Leukozyten, die in jedem dieser Gewebe 31,32. Zusätzlich Durchflusszytometrie verwendet worden, um die Dichte und den Anteil von mater bestimmennal-fetalen Schnittstelle Leukozyten 33 und Expression von extrazellulären und intrazellulären Proteinen 8-10,34. Durchflusszytometrische Analyse von Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle benötigt eine Einzelzellsuspension. Um infiltrieren Leukozyten aus dem dezidualen, Gebärmutter und Plazenta-Gewebe zu isolieren, zwei Methoden der Gewebedissoziation verwendet: mechanische und enzymatische. Beide Verfahren ermöglichen die Trennung von infiltrierten Leukocyten aus der extrazellulären Matrix (ECM) dieser Gewebe. Enzymatische Gewebedissoziation überlegen ist mechanischen Gewebedissoziation, da es eine höhere Ausbeute an Leukozyten mit geringer Scherkraft-verbundenen Schäden 35. Folglich mechanische Gewebedissoziation erfordert die Bündelung Gewebe 36, das die Variabilität und Heterogenität der Proben erhöhen kann. Dennoch können mechanische Dissoziation der Wahl sein, wenn das Antigen von Interesse kann durch enzymatische Spaltung oder geändert werden, wenn die Funktionalität der Zelles von Interesse bewahrt werden müssen (z. B. Cytotoxizität von NK-Zellen) 35. Die Verwendung von Proteolyse mit spezifischen Enzymen, die ECM abbauen beseitigt die mechanische Dissoziation beobachtet geringe Ausbeuten. Mehrere Studien haben die Verwendung von Trypsin 32, Collagenase 37, DNase 31, Dispase 38 und kommerzielle Cocktails verschiedener Enzyme 32,39 gemeldet. Jedoch muß die Art und Konzentration der verschiedenen Enzyme und die Dauer der Verdauung genau definiert und um zur Aufrechterhaltung der Integrität der Zelloberfläche antigene Epitope zur Immunphänotypisierung erforderlich sicherzustellen, validiert werden. Die verschiedenen Oberflächenstrukturen sind unterschiedlich anfällig für Zerstörung durch verschiedene Enzyme, mit einigen Enzymen, wie Trypsin, wobei berüchtigt Strippen von vielen monoklonalen Antikörpern erkannt Leukozyten Oberflächenepitope. Hierin eingeführt ist ein Verfahren unter Verwendung eines proteolytic und kollagenolytische Enzymcocktail, genannt Accutase. Diese enzymatische Lösung ist sanft genug, während immer noch effizienter in distanziert Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle und erfordert nicht die Zugabe von anderen distanziert Reagenzien oder Serum, die Dissoziation Reaktion zu beenden. Darüber hinaus ist es gebrauchsfertig geliefert zu bedienen und, obwohl die Zeit der Dissoziation Annahmen validiert werden soll, ist robuster als die oben erwähnten Enzyme, 40,41. Die Verwendung einer Kombination beider Arten von Gewebe-Disaggregation verbessert die Qualität und die Menge der Zellen erhalten wird; Daher haben mehrere Studien die kombinierte Verwendung von mechanischen und enzymatischen Spaltung mit befriedigenden Ergebnissen 31,32,37 implementiert. Das hier beschriebene Protokoll wurde eingerichtet und in unserem Labor validiert; Es verwendet eine Kombination eines leichten mechanischen Dissoziation gefolgt von einem robusten enzymatische Zerlegung. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung und die weitere Untersuchung vondie Infiltration von Leukozyten in Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle (Uterus, Dezidua und Plazenta). Das folgende Protokoll unterhält auch die Integrität der Zelloberflächenmarker und Ausbeuten genügend lebensfähige Zellen für nachfolgende Anwendungen wie durch durchflusszytometrische Analyse demonstriert. Schließlich dieses Protokoll erhält die Konsistenz der Zellpräparation für die Analyse und den Vergleich von verschiedenen Mausgeweben zu komponieren die Mutter und Fötus-Schnittstelle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Magentic Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre separation filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe lock conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse extracellular antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

Immuntoleranz bei Schwangerschaft erfordert, dass das Immunsystem der Mutter erfährt Scheidungsänderungen, um zu akzeptieren und zu pflegen sich entwickelnden Fötus. Diese Toleranz wird während des Koitus eingeleitet, während der Befruchtung und Implantation gegründet und während der Schwangerschaft beibehalten wird. Aktive zellulären und molekularen Mediatoren von Mutter und Fötus Toleranz werden an der Stelle des Kontaktes zwischen fetalen und mütterlichen Gewebe, wie die Mutter und Fötus-Schnittstelle, die die Plazenta und die Gebärmutter und dezidualen Gewebe enthält bekannt bereichert. Diese Schnittstelle wird von Stromazellen und infiltrieren Leukozyten besteht, und deren Fülle und phänotypischen Eigenschaften im Laufe der Schwangerschaft zu ändern. Infiltrieren Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle umfassen Neutrophile, Makrophagen, dendritische Zellen, Mastzellen, T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, die zusammen das lokale Mikroumgebung, die Schwangerschaft aufrecht zu erstellen. Ein Ungleichgewicht zwischen diesen Zellen oder jede inappropriate Veränderung ihrer Phänotypen wird als ein Mechanismus der Erkrankung in der Schwangerschaft. Daher ist die Untersuchung der Leukozyten, die die Mutter und Fötus Schnittstelle infiltrieren wesentlich, um die Immunmechanismen, die schwangerschaftsbedingten Komplikationen aufzuklären. Hierin ist ein Protokoll, das eine Kombination von leichter mechanischer Dissoziation gefolgt von einem robusten enzymatische Zerlegung mit einem proteolytischen und kollagenolytischen Enzymcocktail, um die Infiltration von Leukozyten aus den Mäusegeweben an der mütterlich-fötalen Grenzfläche zu isolieren, verwendet. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung der hohen Zahl von lebensfähigen Leukozyten (&gt; 70%) mit einer ausreichend konservierten antigenen und funktionellen Eigenschaften. Isolierten Leukozyten können dann durch verschiedene Techniken, einschließlich Immunphänotypisierung Zellsortierung, Imaging, Immunoblotting-mRNA-Expression, Zellkultur und in vitro funktionelle Assays wie gemischte Leukozytenreaktionen, Proliferation oder Zytotoxizität Assays analysiert werden.

Die Präparation von Maus-Geweben von der mütterlich-fötalen Grenzfläche ist in Abbildung 1 gezeigt ist; Dieses Verfahren umfasst das Öffnen der Bauchhöhle (1A, B), Gebärmutterhörner (1C), die die Implantationsstellen (1D) und die Sammlung der Uterusgeweben (1E), Plazenta (1F) und Dezidua-Gewebe (1G) bei 16,5 dpc. 2 zeigt die Morphologie von isolierten Makrophagen (F4 / 80 +) aus...

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Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.1K Aufrufe.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

Serie: Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Forschung

Immunologie und Infektion

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...