B.S.S. wird von NIH Grant (R01 AI076457) und von der Stony Brook University zur Verfügung gestellten Mittel unterstützt. Z.Q stützt sich auf NIH (K12 GM102778) zu gewähren.

Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Leitlinien des National Institute of Health und durch die Stony Brook University institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Genehmigungen erteilt werden, vor der Durchführung der Verfahren.
1. Vorbereitung der Lösung
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin und Gentamycin), 100 ×
	<ol>
<li>Mischen Sie 59,6 g HEPES 500 mM (final), 14,6 g L-Glutamin 200 mM (final), 1 × 106 U Penicillin (2.000 U/mL final), 1 g Streptomycin (2 mg/mL final) und 2,5 mg Gentamicin (5 µg/mL final). Hinzufügen von RPMI 1640 bis 500 mL. Anpassen der pH-Wert auf 7,5 mit NaOH (vor der Anpassung, der Puffer ist gelb/Orange mit einem pH-Wert um 6,0). Filter mit einem 0,45 µm-Filter zu sterilisieren. Aliquoten und Store bei-20 ° C bis zu 1 Jahr oder bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HEPES-Bicarbonat-Puffer, 10-fach
	<ol>
<li>
23,8 g HEPES 100 mM (Finale), 21 g Nahco33 (250 mM final) mischen und 1.000 mL Wasser hinzufügen. PH-Wert auf 7,2 mit HCl. Filter einstellen mit einem 0,45-μm-Filter zu sterilisieren. Bei Raumtemperatur lagern. Der pH-Wert ändert sich im Laufe der Zeit. Neu zu justieren pH in regelmäßigen Abständen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medien zu ernten (~ 1 Flasche/2-Mäuse)
	<ol>
<li>500 mL RPMI 1640 fügen Sie hinzu, 25 mL Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum (5 % final) und 5 mL 100 × HGPG. Speichern Sie bis zu 6 Monate bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dithioerythritol (DTE) Lösung (40 mL/kleine Darm)
	<ol>
<li>Mix 50 mL 10 × Hanks ausgeglichene Salzlösung, Ca2+- und Mg2+-kostenlos, 50 mL 10 × HEPES-Bikarbonat Puffer und 50 mL Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum (10 % final). 350 mL H2O und 15,4 mg Dithioerythritol/100 mL (1 mM final) hinzufügen. Diese frisch vor Gebrauch zubereiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-Lösung (50 mL/kleine Darm)
	<ol>
<li>Mix 50 mL 10 × Hanks ausgeglichene Salzlösung, Ca2+- und Mg2+-gratis mit 5 mL 100 × HGPG. Fügen Sie 445 mL H2O. hinzufügen 260 µL 0,5 M EDTA/100 mL (1,3 mM final). Diese frisch vor Gebrauch zubereiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kollagenase-Lösung (30 mL/LP)
	<ol>
<li>Hinzufügen 500 mL RPMI, 50 mL EB (10 % FBS Final), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (Finale 1 mM) und 1 mL 0,5 M CaCl2 (Finale 1 mM). Fügen Sie Kollagenase, Typ I (100 U/mL Final). Diese frisch vor Gebrauch zubereiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dichte-Gradienten (DG) Lösungen
	<ol>
<li>1 × DG-Stammlösung durch das Mischen von 90 mL DG-Stammlösung vorbereiten (siehe die Tabelle der Materialien) mit 10 mL 10 × PBS. Bei 4 ° c steril halten</li>
		<li>Bereiten Sie 44 % DG Lösung (8 mL/IEL, 8 mL/LP), durch das Mischen von 44 mL der Stammlösung 1 × GD und 56 mL RPMI 1640. Diese frisch vor Gebrauch zubereiten.</li>
		<li>Bereiten Sie 67 % DG Lösung (5 mL/IEL, 5 mL/LP), durch das Mischen von 67 mL der Stammlösung 1 × GD und 33 mL RPMI 1640. Diese frisch vor Gebrauch zubereiten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolierung der mesenterialen Lymphknoten, Darm, und Peyer Patches
<ol><li>Einschläfern Sie die Maus mit CO2-Narkose und sekundäre zervikale Dislokation. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Rücken und sprühen Sie mit 70 % Ethanol. Mit einer Schere einen Midline Schnitt machen, und öffnen Sie die Haut und Bauchdecke in die Bauchhöhle aussetzen.</li>
	<li>Suchen Sie den Blinddarm und verwenden Sie Zange, um den Blinddarm ziehen vorsichtig nach unten. Verwenden Sie Zange vorsichtig bewegen des Dünndarms nach rechts, Freilegung der gesamten MLN-Kette, die mit dem Doppelpunkt ausgerichtet ist. Hinweis: Eine Karte der mesenterialen Lymphknoten, die Kette und lymphatische Drainage des Darms zuvor war dargestellt13.</li>
	<li>Identifizieren Sie den unteren Knoten in der Kette, befindet sich am nächsten an der Blinddarm. Verwenden Sie eine Reihe der Zange zu fassen das Mesenterium/Fett um ihn herum und MLN Kette entfernen sanft von unten nach oben durch das Fett aus den Lymphknoten mit einem anderen Satz von Pinzetten tweezing.</li>
	<li>Legen Sie die Mio-Kette auf einem Papiertuch angefeuchtet mit Ernte Medien. Mesenterium/Fett durch Rollen der Kette auf dem Papier-Turm und das Fett abziehen, mit zwei Sätzen der Zange zu entfernen. Legen Sie die MLN in kalten Ernte Medien für die spätere Isolierung Schritte. Hinweis: (i) direkte Handhabung der Knoten wird abgeraten. Greifen Sie stattdessen das Mesenterium/Fett um sie herum. (Ii) Es ist wichtig, Mesenterium/Fett so viel wie möglich, um die Zellviabilität verbessern zu entfernen.</li>
	<li>Schneiden Sie der Dünndarm unterhalb der Pylorussphinkter und oberhalb der Blinddarm mit einer Schere. Herausziehen der Darm langsam vom Ileum Zwölffingerdarm mit einem Satz von Zange beim Entfernen der angehängten Mesenterium/Fettes mit einem anderen Satz von Zangen.</li>
	<li>Legen Sie den Darm auf ein Papiertuch mit Ernte Medien befeuchtet und necken Sie verbleibenden Mesenterium/Fett weg mit zwei Zangen. Hinweis: (i) achten Sie darauf, Mesenterium/Fett so viel wie möglich für optimale Zellausbeute und Lebensfähigkeit zu entfernen. (Ii) halten Sie den Darm in diese und die folgenden Schritte durch Anwendung Ernte Medien regelmäßig befeuchtet.</li>
	<li>Sammeln Sie Peyer Patches, indem Sie sie aus dem Darm mit einer gebogenen Schere entfernen. Verwenden Sie einen sezierenden Umfang oder Lupe ggf. (Anfänger); die meisten Peyer Patches sollten für das geschulte Auge sichtbar sein. Sammle 5-11 (typisch) Peyer Patches aus dem Dünndarm. Ort Peyer Flecken im kalten Ernte Medien für die spätere Isolierung Schritte. Hinweis: Peyer Patches sind kleine, in erster Linie Runde Ausbuchtungen im Darm Außenwand gegenüber der Linie des Mesenterium Anlage.</li>
	<li>Verwenden Sie die flache Seite der Zange und sanft gleiten vom Zwölffingerdarm in Richtung Ileum, um fäkal Inhalt und Schleim zu vertreiben. Einmal wiederholen Sie, um die meisten der Schleim zu entfernen. Hinweis: Unvollständiger Entfernung des Schleims kann verringern Zellviabilität und Ertrag. Doch achten Sie darauf, den Darm sanft zur Vermeidung stripping Zotten oder beschädigen der Basalmembran schieben.</li>
	<li>Verwenden Sie feine Schere mit einem stumpfen Ende in einem Punkt, stecken Sie das stumpfe Ende in den Darm und schneiden Sie des Darms längs von Zwölffingerdarm auf, Krummdarm. Seitlich schneiden Sie der geöffneten Darm in ~ 2 cm Stücke. Legen Sie die intestinale Stücke in einem 50 mL konische Röhrchen mit 25 mL kalte Ernte Medien für die spätere Isolierung Schritte. Hinweis: Halten Sie die Schere angefeuchtet mit Medien mühelos durch den Darm schieben helfen.</li>
</ol>3. Isolation von Lymphozyten aus dem induktiven Websites
<ol><li>Isolieren Sie Lymphozyten von MLN, indem Sie sanft durch eine 70 µm Zelle Sieb mit den Kolben einer 3-mL-Spritze aufzulösen. Waschen Sie Zelle Sieb mit 5 mL kalte Ernte Medien.</li>
	<li>Pellet MLN-Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Die Zelle Pellet in 1 mL kalte Ernte Medien aufzuwirbeln. Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung. Hinweis: rote Blutzelle Lysis Puffer kann rote Blutkörperchen zu entfernen, wenn Blutungen während der Entfernung aufgetreten verwendet werden.</li>
	<li>Lymphozyten von Peyer Patches von Peyer Patches in einem 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL vorgewärmt Kollagenase-Lösung bei 37 ° C und 220 u/min für 30 min Inkubation zu isolieren.</li>
	<li>Wirbel für 15 s bei maximaler Einstellung und Filter verdaut Gewebe und überstand in ein 50 mL konische Rohr durch ein Sieb 70 µm Zelle. Sanft distanzieren Sie die Reststücke Gewebe mit den Kolben der Spritze 3 mL und waschen Sie die Zelle-Sieb mit 5 mL kalte Ernte Medien.</li>
	<li>Pellet-Peyer Patch Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL kalte Ernte Medien. Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung. Hinweis: Peyer des Patches Isolierung möglicherweise einige kontaminierenden Lamina Propria Lymphozyten und intraepitheliale Lymphozyten.</li>
</ol>4. Isolierung der intraepithelialen Lymphozyten aus dem Dünndarm
<ol><li>Waschen Sie die Teile des Dünndarms, dreimal mit 25 mL kalte Ernte Medien durch Umkehrung der Röhre 10 Mal, lassen den Darm Stücke zu begleichen und gießt den überstand. Hinweis: Gewebe Stücke sollte leicht auf den Boden des Rohres zu begleichen. Wenn sie dies nicht tun, ist es ein Hinweis darauf, dass zuviel Mesenterium/Fett befestigt bleibt oder sie verbunden mit einer Luftblase sind.</li>
	<li>Die 50 mL konische Röhrchen mit Darm Stücke 20 mL vorgewärmte DTE-Lösung hinzu und übertragen Sie auf eine 50 mL silikonisierte Erlenmeyerkolben mit rühren-Bar. Rühren Sie bei 37 ° C und 220 u/min auf einen Magnetrührer für 20 min. verwenden einen grossen Magneten auf der Außenseite des Kolbens rühren-Bar zu halten und das Gewebe und die Lösung zurück auf die 50 mL konische Rohr übertragen.</li>
	<li>Wirbel der Röhre bei maximaler Einstellung für 10 S. Übertragung des Überstands in ein neues 50 mL konische Rohr durch ein 70 µm Zelle Sieb achtgeben, die Gewebe-Stücke in den original Schlauch zu halten. Bewahren Sie den Überstand; der Überstand enthält intraepitheliale Lymphozyten. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL kalte Ernte Medien und speichern auf Eis.</li>
	<li>Die 50 mL konische Röhrchen mit Darm Stücke 20 mL vorgewärmte DTE-Lösung hinzu und transfer zurück zu den 50 mL silikonisierte Erlenmeyerkolben mit rühren-Bar. Rühren Sie bei 37 ° C und 220 u/min auf einen Magnetrührer für 20 min. verwenden einen grossen Magneten auf der Außenseite des Kolbens rühren-Bar zu halten und das Gewebe und die Lösung zurück auf die 50 mL konische Rohr übertragen. Hinweis: DTE ist ein Reduktionsmittel, die intraepitheliale Lymphozyten bereichert.</li>
	<li>Wirbel der Röhre bei maximaler Einstellung für 10 S. Transfer des Überstands durch ein 70-µm-Zelle-Sieb in der vorherigen Röhrchen mit Zellen aus der überstand die erste DTE-Behandlung (aus Schritt 4.3). Hinweis: Der Darm Reststücke werden zur Lymphozyten aus der Lamina Propria zu isolieren. Qualitätskontrolle: Ein Stück des Gewebes kann entfernt und histologisch überprüft, um sicherzustellen, dass die Epithelzellen vorhanden sind und der Basalmembran intakt ist.</li>
	<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugieren des Überstands bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 8 mL 44 % DG Lösung bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Transfer der 8 mL 44 % DG Lösung/Zellsuspension in einem 17 mm Ø X 100 mm Stil 14 mL Polypropylen Rundboden Röhrchen. Unterlage mit 5 mL RT 67 % DG Lösung. Zentrifugieren Sie bei 1600 × g für 20 min bei RT ohne mit der Bremse. Hinweis: Rohre können mit Rinderserum zu verhindern, dass Zellen festhalten an die Rohrwände vorbehandelt werden.</li>
	<li>Beachten Sie, dass lebensfähige Zellen eine Band (buffy Coat) an der Schnittstelle von 44 % bis 67 bilden %, abgestorbene Zellen und einige Epithelzellen in einem schleimigen Film an der Spitze des Verlaufs sind und der roten Blutkörperchen im Pellet sind. Entfernen Sie die obere Schicht des Farbverlaufs auf innerhalb von ~ 2 cm von der Schnittstelle durch Vakuum Aspiration. Verwenden Sie eine Pasteurpipette buffy Mantel an der Schnittstelle zu ernten und übertragen Sie sie auf eine 50 mL konische Röhrchen mit 40 mL kalte Ernte Medien.</li>
	<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Die Zelle Pellet in 1 mL kalte Ernte Medien aufzuwirbeln. Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung.</li>
</ol>(5) Isolierung der Lamina Propria Lymphozyten aus dem Dünndarm
<ol><li>Entfernen Sie durch Zugabe von 25 mL vorgewärmte EDTA-Lösung in den Kolben mit dem Darm Reststücke Epithelzellen aus Darmgewebe Stücke. Rühren-Kolben bei 37 ° C und 220 u/min auf einen Magnetrührer für 30 min. verwenden einen grossen Magneten an der Außenseite des Kolbens, rühren-Bar zu halten und sorgfältig entsorgen Überstand unter Beibehaltung Darm Stücke innerhalb der Flasche. Hinweis: (i) EDTA ist ein Kalzium-Chelator, die richtet sich an Kalzium-abhängige Kreuzungen und fördert die Ablösung der intestinalen Epithelzellen. (Ii) der Überstand soll bewölkt und kann verwendet werden, um die IEC zu isolieren, wenn ihre Sammlung gewünscht wird.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 5.1. Hinweis: Der Überstand sollte weniger bewölkt nach dieser Inkubationszeit. Qualitätskontrolle: Ein Stück des Gewebes kann entfernt und histologisch überprüft, um sicherzustellen, dass die intestinale Epithelzellen wurden entfernt und der Basalmembran intakt ist. Ein Beispiel aus der Überstand durch Durchflusszytometrie bestätigen auch beurteilt werden kann, dass Leukozyten (CD45+ Zellen) sind nicht vorhanden.</li>
	<li>Die Flasche 50 mL RT Ernte Medien hinzufügen. Rühren Sie kurz mit einem Magneten. Lassen Sie Darm Stücke zu begleichen und den Überstand vorsichtig zu verwerfen. Hinweis: Diese Schritt wird sichergestellt das Entfernen von EDTA vor Kollagenase Verdauung, wie EDTA Kollagenase inaktiviert von chelatisierenden das Kalzium, das für Kollagenase Funktion entscheidend.</li>
	<li>30 mL vorgewärmte Kollagenase-Lösung in den Kolben und verrühren Sie Darm Stücke bei 37 ° C und 220 u/min auf einen Magnetrührer für 45 Minuten.</li>
	<li>Übertragen Sie verdaute Gewebe und überstand auf eine 50 mL konische Rohr durch Filterung durch ein Sieb 70 µm Zelle. Distanzieren Sie sanft Reststücke Gewebe mit den Kolben der Spritze 3 mL Brei durch den Filter. Waschen Sie den Filter mit 10 mL kalte Ernte Medien.</li>
	<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 8 mL Umgebungstemperatur 44 % DG Lösung.</li>
	<li>Transfer der 8 mL 44 % DG Lösung/Zellsuspension in einem 17 mm Ø X 100 mm Stil 14 mL Polypropylen Rundboden Röhrchen. Unterlage mit 5 mL der Umgebungstemperatur 67 % DG Lösung. Zentrifugieren Sie die Steigungen bei Raumtemperatur und 1600 × g für 20 min mit keine Bremse.</li>
	<li>Entfernen Sie die Fettschicht an der Spitze von Vakuum Aspiration. Verwenden Sie eine Pasteurpipette buffy Mantel an der Schnittstelle und Transfer in ein 50 mL konische Röhrchen mit 40 mL kalte Ernte Medien zu ernten.</li>
	<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Die Zelle Pellet in 1 mL kalte Ernte Medien aufzuwirbeln. Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).</li><li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminology:+nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue.">Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).</li><li>Lefrancois, L., Lycke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+small+intestinal+intraepithelial+lymphocytes,+Peyer's+patch,+and+lamina+propria+cells.">Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).</li><li>Sheridan, B. S., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+lymphocytes+from+small+intestine+tissues.">Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues.</a> Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li><li>Koscso, B., Bogunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Purification+of+Mouse+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+by+Flow+Cytometry.">Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).</li><li>Goodman, T., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+gamma-delta+T-cell+receptor+on+intestinal+CD8++intraepithelial+lymphocytes.">Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes.</a> Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2+integrins+and+ICAM-1+are+involved+in+establishment+of+the+intestinal+mucosal+T+cell+compartment.">Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment.</a> Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+exhibit+multifunctional+and+protective+memory+in+intestinal+tissues.">gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues.</a> Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).</li><li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+infection+drives+a+distinct+population+of+intestinal+resident+memory+CD8(+)+T+cells+with+enhanced+protective+function.">Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function.</a> Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).</li><li>Romagnoli, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+distinct+long-lived+memory+CD4+T+cells+in+intestinal+tissues+after+oral+Listeria+monocytogenes+infection.">Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).</li><li>Houston, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct.">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li><li>Lorenz, R. G., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphoid+follicles+can+function+as+sites+for+induction+of+mucosal+immune+responses.">Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).</li><li>Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+migration+of+CD8+T+cells+in+the+intestinal+mucosa.">Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa.</a> J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).</li><li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-driven+induction+of+CD11c+on+intestinal+intraepithelial+lymphocytes+and+CD8++T+cells+in+vivo.">Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo.</a> J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Ein detailliertes Protokoll wird für die Isolierung von Lymphozyten aus der intestinalen Schleimhaut präsentiert, induktive (MLN und PP) und Effektor (LP und IEL Fach) Seiten. Das Protokoll wurde entwickelt, um (Uhrzeit) und Ausgang (Lebensfähigkeit und Ertrag) zur Maximierung der Produktivität und Ergebnisse zu balancieren. Das Protokoll gewährleistet auch minimal wohnzimmertaugliche Kreuzkontaminationen zwischen LP und IEL Fächer.
Mehrere Protokolle für die Isolierung von Immunzellen ...

Gastrointestinaltrakt (GI) hat viele Falten und Vorsprünge, die die größte Oberfläche trennt das Innere des Körpers und der äußeren Umgebung darstellt. Der intestinalen Immunsystems spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion des GI-Trakt. Es ist ständig diätetische Antigene, Kommensalen Bakterien und pathogenen Mikroben ausgesetzt. Als solche muss tolerant gegen Nahrungsmittel-Antigene und Kommensalen Bakterien bleiben und gleichzeitig die Fähigkeit, schnell eine effektive Immunantwort gegen enteropathogenic Mikroben1erzeugen. Des intestinalen Immunsystems können anatomisch unterteilt werden induktive Sites, wo naive Lymphozyten durch antigenpräsentierende Zellen Antigene von der Darmschleimhaut tragen aktiviert werden, und Effektor Sites, wo aktivierte Lymphozyten bestimmte ausüben Effektor-Funktionen2. Die induktive Websites umfassen die organisierte lymphatischen Struktur von Peyer Patches (PP), die im Darmlumen direkt durch das Wirken des spezialisierten M-Zellen und die regionalen mesenterialen Lymphknoten (MLN) Umfragen. Die Effektor-Seiten bestehen aus der Lamina Propria (LP), die das Bindegewebe unterhalb der Basalmembran und das Darmepithel, eine einzelne Zelle Schicht oberhalb der Basalmembran, die intraepitheliale Lymphozyten (IEL) enthält. Lymphozyten sind wichtige Akteure der adaptiven Immunität, die Schutz gegen Infektionen und Krebs zu vermitteln und auch zu Immunpathologie bei entzündlichen Erkrankungen beitragen können. Es ist wichtig und hochaktuellen Lymphozyten in diesen unterschiedlichen studieren anatomische Schleimhaut Fächer besser verstehen ihre Induktion und Effektor-Funktionen.
Eine relativ einfache und einheitliche Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus diesen Fächern ist erforderlich, da die Anzahl der Ermittler erkunden immun Ereignisse im Darm beschleunigt werden. Mehrere Forschergruppen haben Protokolle veröffentlicht, die mehrere ähnliche Prozesse für die Isolierung von Immunzellen aus dem Maus kleine Darm Fächer3,4,5,6,7 Teilen . Allerdings gibt es mehrere technische Unterschiede zwischen ihnen je nach Schwerpunkt des einzelnen Protokolls. Zum Beispiel mit dem Fokus auf Immunzellen aus der LP zu isolieren, untersucht ein Protokoll die Auswirkungen der verschiedenen enzymatischen Verdauung im Zellviabilität, Zelle Oberfläche Marker Ausdruck und die Zusammensetzung der isolierten Immunzellen5. Ein anderes Protokoll zeigt eine schnelle und reproduzierbare Methode zur Isolierung von Lymphozyten ohne Dichte Zentrifugation6. Schließlich gibt es spezifische Protokolle auch zur Isolierung von mononukleären Phagozyten aus verschiedenen Gewebeschichten des Dünndarms7. Hier ist ein hoch reproduzierbare Protokoll, sequentielle Isolation der Lymphozyten-Populationen aus dem MLN, PP, LP und IEL Fach des Dünndarms ermöglicht, präsentiert.
Wir konzentrieren uns auf hochgereinigte Populationen aus der LP und IEL Fächer, die weitgehend frei von Verunreinigungen aus anderen Darm Fächer sind zu isolieren. Dies verbreitete Protokoll erzeugt eine hohe Ausbeute an maximal rein und lebensfähige Lymphozyten innerhalb vertretbarer Zeit Einschränkungen4,8,9,10,11,12. Dieses Protokoll sorgt dafür auch die Isolation der Lymphozyten aus dem LP und IEL Fach mit minimalen wohnzimmertaugliche Kreuzkontamination, eine bona fide Möglichkeit zum Lymphozyten in diese unterschiedliche Fächer studieren. Die isolierten Lymphozyten können weitere Manipulationen wie durchflusszytometrischen Analyse oder funktionelle Analyse unterzogen werden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf die Isolation der Lymphozyten aus die Maus-Dünndarm und Dickdarm bei bakteriellen Infektionen wie Listeria Monocytogenes, Salmonella Typhimuriumund Yersinia Pseudotuberculosis angewendet Infektionen und entzündlichen Erkrankungen wie z. B. chemische und Pathogen-induzierten Kolitis. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um angeborene immune Zellen wie dendritische Zellen, Makrophagen, Neutrophilen und Monozyten aus die Maus-Dünndarm und Dickdarm zu isolieren.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G3126-100G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>10x Hanks&#039; balanced salt solution</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H4641-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithioerythritol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9680-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Calsium chloride hexahydrate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>21108-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>DG gradient stock solution (Percoll)&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>70-&amp;micro;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>26500R-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Thermo Fisher</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-148</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

Der intestinalen Immunsystems spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion des Magen-Darm-Trakt durch die Generierung von toleranten Responses to diätetische Antigene und Kommensalen Bakterien bei der Montage effektiv Immunantworten auf enteropathogenic Mikroben. Darüber hinaus ist es deutlich geworden, dass lokale Darm Immunität eine profunde Auswirkung auf fernen und systemische Immunität hat. Daher ist es wichtig zu untersuchen, wie eine intestinale Immunantwort induziert wird und was das immunologische Ergebnis der Reaktion ist. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus Dünndarm induktive Seiten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und die mesenterialen Lymphknoten und Effektor Websites wie die Lamina Propria beschrieben und die Darmepithel. Diese Technik sorgt für Isolierung von einer großen Anzahl von Lymphozyten aus kleinen intestinalen Gewebe mit optimaler Reinheit und Lebensfähigkeit und minimale wohnzimmertaugliche Kontamination innerhalb vertretbarer Zeit Einschränkungen. Die technische Möglichkeiten zum Isolieren von Lymphozyten und anderen Immunzellen aus den intestinalen Geweben ermöglicht das Verständnis der immunen Antworten zu Magen-Darm-Infektionen, Krebs und entzündliche Erkrankungen.

Eine schematische Darstellung des Protokolls dargestellt (Abbildung 1). Lymphozyten in der Darmschleimhaut induktive und Effektor Websites sind deutlich organisiert. Peyer ist Patches (PP) und mesenterialen Lymphknoten (MLN) enthalten Lymphozyten in gut organisierten Bereichen der T-Zellen und B-Zell-Follikel, während das Darmepithel Lymphozyten enthält, die mehr diffus verteilt werden. Die Lamina Propria (LP) enthält sowohl diffus verteilte Lymphozyten un...

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Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

52.4K Aufrufe.  Stony Brook University. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Serie: Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Forschung

Biologie

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

Entwirren Key Player der humoralen Immunität: erweiterte und optimierte Lymphozyten isoliert Protokoll von Murine Peyer Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Krebsforschung

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Immunologie und Infektion

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...