Diese Arbeit wurde von der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development, NIH / DHHS unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt, teilweise von der Wayne State University in Perinatal Initiative von Müttern, Perinatal-Kind-Gesundheit. Wir danken Maureen McGerty (Wayne State University) für ihre kritische Messwerte des Manuskripts.

Dieses Protokoll wird für Leukozyten isoliert von den Decidua basalis und Dezidua parietalis in der Vorbereitung für Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie geeignet. Weiterhin können die isolierten Zellen für die Zellsortierung, Zellkultur, RNA-Isolierung und der Zytologie verwendet werden. Vor der Arbeit mit den in diesem Protokoll genannten Proben müssen menschliche ethische Genehmigung durch die lokalen Forschungsethikkommission und Institutional Review Boards erhältlich. Die Sammlung und Nutzung der menschlichen Proben zu Forschungszwecken wurden von den Institutional Review Boards der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Department of Health and Human Services (DHHS genehmigt , Bethesda, MD, USA) und der Wayne State University (Detroit, MI, USA). Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen schwangeren Frauen vor der Entnahme von Gewebeproben erhalten. HINWEIS: Während der Arbeit mit Tierblut, Zellen oder GefahrenGehilfen, wie in diesem Protokoll erwähnt, ist es wichtig, dass die richtige biologische Sicherheit und Laborsicherheitsmaßnahmen eingehalten werden. 1. Dissection der Menschen Deziduale Tissues HINWEIS: Die Basalplatte ist die Basis unterhalb und Plazenta befestigt und stellt die mütterliche Oberfläche. Die chorioamniotic Membranen sind das Amnion und Chorion. Die Basalplatte umfasst die Decidua basalis und das Chorion umfasst die Decidua parietalis (Abbildung 1). <ol><li> Decidua Basalis <ol><li> Sezieren ein Stück der Basalplatte von einem Keimblatt der Plazenta (1A und 1B). </li><li> Legen Sie sie auf einem sterilen Schneidebrett mit den Plazentazotten nach oben zeigt. Die Seite, die die Plazentazotten ist in der Regel blutig rot mit behaarten Gewebe in Erscheinung. Die Basalplatte ist glatt und blass in der Farbe rot. </li><li> Verwenden Sie scharfe, feine Punkt Schere und Pinzette, um die vill entfernenous Gewebe und Blutgefäße. Halten Sie das Gewebe in 1x PBS eingeweicht während des Prozesses (Abbildung 1c) (Ca 2+ - kostenlos - und Mg 2+). Sammeln Sie 2 bis 3 dieser Stücke und spülen Sie sie gründlich mit 1x PBS, das Blut (1D) zu entfernen. </li></ol></li><li> Decidua parietalis <ol><li> Sezieren ein Stück der chorioamniotic Membranen (ungefähr 10 cm x 10 cm, 1E). Legen Sie sie auf dem Brett mit dem Chorion nach oben zeigt. Das Chorion-Seite enthält blutigen Klumpen und ist in der Regel leicht gelblich gefärbt. </li><li> Verwenden Sie fein Punkt Pinzette möglichst viele der von Blutgerinnseln wie möglich (1E) zu entfernen. Spülen Sie die Membran in sterile 1x PBS, um das überschüssige Blut aus der Membran zu reinigen, bis die 1x PBS klar ist. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Zellschaber sanft kratzen die dezidualen Schicht von der Membran. Bewerben sterile 1x PBS auf der memBrane während Abschluss dieses Prozesses (1F). Sammeln Sie die dezidualen Gewebe und legen Sie sie in einem 50 ml-Kunststoffröhrchen mit sterilem 1x PBS (1G). </li></ol></li></ol> 2. Mechanische Disaggregation und enzymatische Verdauung <ol><li> In einem 50 ml-Kunststoffrohr waschen das Gewebe aus der Dezidua basalis (aus Schritt 1.1.3) seziert oder Dezidua parietalis (aus Schritt 1.2.3) mit sterilem 1x PBS. Sammeln Gewebepellets durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Saugen Sie den Überstand über dem Gewebepellet befinden vorsichtig, ohne das Pellet aufzurühren. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt werden die Pellets sehr locker, da sie rote Blutzellen enthalten. Wenn das Volumen des Pellets beträgt etwa oder weniger als 3 ml, resuspendieren das Pellet in 6 ml Zellentfernungslösung auf 37 ° C vorgewärmt. Wenn die Pellets größer als 3 ml Volumen, fügen Sie mehr Zellablösung Lösung (fügen Sie etwa 2 mal the Volumen der Gewebeproben). </li><li> Übertragen Sie die homogenisierte Gewebe (Decidua basalis + Zellablösung Lösung oder Dezidua parietalis + Zellablösung Lösung) zu einem C-Rohr. </li><li> Legen Sie das C-Rohr in der automatischen Dissociator und führen Sie das entsprechende Programm. HINWEIS: Das Programm für die Decidua basalis läuft für 17 sec mit 668 Gesamt Schuss pro Lauf. Das Programm für die Decidua parietalis läuft für 37 sec mit 235 Gesamt Schuss pro Lauf. Diese Programme wurden angepasst, um Leukozyten aus der Dezidua basalis oder der Dezidua parietalis mit guter Ausbeute und Lebensfähigkeit der Zellen zu isolieren. </li><li> Nach der mechanischen Disaggregation der Gewebe zu verdauen die Gewebe mit einer im Handel erhältlichen Zellablösung Lösung wie Accutase; (Ein Cocktail, der proteolytischen und kollagenolytische Enzyme enthält) für 45 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. </li></ol> 3. Isolierung der Leukozyten <ol><li> Nach der Inkubation mit 10 ml 1x PBS auf die DIGElierte Gemischs und führt es durch einen 100 um Zellsieb in einen 50 ml Kunststoffrohr. In Abhängigkeit von der Klebrigkeit des Verdauungsgemisch, kann man brauchen, um mehrere Zellsiebe für eine Mischung zu verwenden. </li><li> Füllen Sie den Schlauch mit 1x PBS und Zentrifuge bei 300 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die 1x PBS über den Zellpellets sorgfältig und resuspendieren der Pellets mit 5 ml eiskaltem FACS-Puffer. HINWEIS: Um die polymorphkernigen und mononukleären Leukozyten zusammen lernen, gehen Sie zu Schritt 6.1; um die mononukleären Leukozyten zu untersuchen, gehen Sie zu Schritt 3.3. </li><li> 5 ml 20% Dichtegradientenmedien (1,077 + 0,001 g / ml) in ein 15 ml-Kunststoffrohr und langsam lagern die Zellsuspension auf der Oberseite des Dichtegradientenmedien. Während Schichtung der Probe ist es wichtig, nicht die Dichtegradientenmedien mit der Zellsuspension gemischt. </li><li> Zentrifuge mit einem Ausschwingrotor bei 500 xg für 30 min bei 4 ° C ohne Bremse. Es ist sehr wichtig, schalten Sie die Bremse, um zu vermeiden, indem die Zellen und lOsing die Steigung. Leukozyten werden in der Schnittstelle zwischen dem Dichtegradienten Medien und der FACS-Puffer gefunden werden. </li><li> Die obere Schicht, die die FACS-Puffer und Zelltrümmer enthält sehr vorsichtig mit einer Pipette. Das Band an der Schnittstelle enthält die decidual mononukleären Zellen und einen Teil der polymorphkernigen Leukozyten. </li><li> Übertragen der Zellen an der Grenzfläche vollständig auf eine neue 15-ml-Plastikröhre. Fügen mindestens 3 mal mehr Volumen FACS-Puffer. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. Den Überstand aspirieren und waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer. Pelletisieren der Zellen mit einem weiteren Zentrifugation bei 300 g für 5 min bei RT. HINWEIS: Um die Zellkultur durchführen, finden Sie in Schritt 4. Zum Zellsortierung durchführen, finden Sie unter Schritt 5. Um Immunphänotypisierung durchführen, finden Sie in Schritt 6. </li></ol> 4. Anwendungen - Zellkultur <ol><li> Resuspendieren der Zellen aus Schritt 3.7 in 1 ml RPMI 1640 Kulturmedium Zählen der lebensfähigen Zellen using eine automatische Zellzähler oder einer Zählkammer und Trypanblau-Lösung 0,4%. </li><li> Addieren der Menge an RPMI-Kulturmedium, um eine Zellkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml zu ergeben. Die Zellen sind nun bereit für Kultur. </li></ol> 5. Anwendungen - Isolierung von Makrophagen für Primärzellkultur <ol><li> CD14 + Zellen zu isolieren, magnetisch zu markieren, die Zellen aus Schritt 3.7 mit CD14 Microbeads (20 ul Perlen pro 10 7 Zellen), die Proben für 15 min bei 4 ° C und separate CD14 + Zellen aus anderen Arten von Zellen, die durch Anlegen eines Magnetfeldes. Nach 2 Waschvorgängen mit MACS-Puffer und Entfernen des Magnetfelds eluieren magnetisch gehalten CD14 + Zellen mit MACS-Puffer. </li><li> Nach der Zentrifugation resuspendieren die Zellpellets in RPMI 1640 Kulturmedium werden die Zellen bereit für die Beschichtung (2). </li></ol> 6. Anwendungen - Immunphänotypisierung <ol><li> Um die Zellen auf immunophenot verwendenyping, resuspendieren der Zellen aus Schritt 3.7 in 1 ml 1 × PBS. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines automatischen Zellzähler oder einer Zählkammer und Trypanblau-Lösung 0,4%. </li><li> Beschriften Sie die Zellen mit einem fixierbaren Lebensfähigkeit Farbstoff (Abbildung 3). Wasche die Zellen zweimal mit FACS-Puffer und Resuspension der Zellen in Puffer Fleck. Inkubieren mit einem FcR-Blocker für 15 min bei 4 ° C. </li><li> In der extrazellulären Antikörpern gegen Fluorochrome konjugiert. Zum Beispiel wird in diesem Protokoll verwendet anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 und anti-CD56-Antikörpern (Tabelle 1). Inkubieren für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Nach 2 Waschvorgängen mit 1x PBS werden die Zellen in 500 ul Puffer Fleck unter Verwendung eines Durchflusszytometers analysiert. Eine Darstellung der Gating-Strategie verwendet, um die Leukozyten-Subpopulationen in der Dezidua-Geweben zu analysieren, ist in 4 gezeigt. </li></ol>

The authors disclose no conflicts of interest.

Charakterisierung der funktionellen und phänotypischen Eigenschaften der Infiltration von Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle ist wesentlich für das Verständnis der Immunmechanismen, um eine Schwangerschaft zu Störungen führen. Es wurden mehrere Techniken, um Leukozyten aus dem menschlichen mütterlich-fötalen Grenzfläche während der gesamten Schwangerschaft 10,14,25,28,37,42,43 isolieren beschrieben. Jedoch jede dieser Techniken unterscheidet, verwendet verschiedene Enzyme oder...

Schwangerschaft wird durch drei verschiedene immunologische Phasen gekennzeichnet: 1) der Implantation und der frühen Plazentation mit einer pro-inflammatorische Reaktion verbunden (dh der Implantation ähnelt eine &quot;offene Wunde&quot;); 2) dem zweiten Trimester und das meiste des dritten Trimesters der Schwangerschaft, wenn Immunhomöostase wird durch eine überwiegend anti-entzündlichen Zustand an der mütterlich-fötalen Grenzfläche erreicht; und 3) der Geburt, einer pro-inflammatorischen Zustand 1-7. Immunzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Entzündungsreaktion an der Mutter und Fötus-Schnittstelle, wo ihre Fülle und Lokalisierung Veränderung während der Schwangerschaft 6-9. Bei Menschen, die Mutter und Fötus-Schnittstelle stellt einen Bereich des direkten Kontakts zwischen mütterlichen (decidua) und fetale (Chorion oder Trophoblast) Gewebe. Diese Schnittstelle umfasst: 1) die Decidua parietalis, die Linien der Gebärmutterhöhle nicht von der Plazenta bedeckt und in Juxtapositionauf die Chorion laeve; und 2) der Dezidua basalis, in der Basalplatte der Plazenta, wo es durch interstitielle Trophoblasten 10 (1) eingedrungen entfernt. Die Intimität dieser Kontaktbereiche schafft die Voraussetzungen für die fetale Antigen-Exposition gegenüber dem mütterlichen Immunsystem 11-13. Nicht überraschend, umfassen Leukozyten bis zu 30-40% der Deciduazellen 8,9,14,15 neben typischen Stromazellen Typzellen und Drüsenzellen 8,14,16. Die Rolle der Leukozyten bei der mütterlich-fötalen Grenzfläche umfasst mehrere Prozesse, für die Begrenzung der Trophoblastinvasion 17, Umbau von Spiralarterien 18,19, Wartung der mütterlichen Toleranz 12,20 und Initiierung der Arbeits 21-26 enthalten. Leukozyten sowohl des adaptiven und angeborenen Schenkel des Immunsystems, dh T-Zellen, Makrophagen, Neutrophilen, B-Zellen, dendritische Zellen und NK-Zellen, sind in den decidual Geweben identifiziert worden, und ihreProportionen und Aktivierungsstatus wurde gezeigt, räumlich und zeitlich während der Gestation 6-10,12,14,24,27-30 variieren. Störungen in der Leukozyten-Population und / oder Funktion sind mit Spontanabort 31, Präeklampsie 32, intrauterine Wachstumsrestriktion 32,33 und Frühgeburt 7,24 verbunden. Daher wird die Untersuchung der phänotypischen Eigenschaften und Funktionen von Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle die Aufklärung der immunologischen Wege in Schwangerschaftsstörungen fehlreguliert zu erleichtern. Eine der leistungsfähigsten Werkzeuge verwendet, um den Phänotyp und funktionellen Eigenschaften der Leukozyten zu bestimmen, ist Durchflusszytometrie Technologie, die die quantitative Analyse von mehreren Parametern gleichzeitig 34-36 ermöglicht. Leukozyten durch Durchflusszytometrie analysiert, wird die Isolierung der Leukozyten in einer Einzelzellsuspension benötigt. Daher ist ein Verfahren zur Abtrennung infiltrierenden leukocytes von der Mutter und Fötus-Schnittstelle benötigt wird, um ihre phänotypischen und funktionellen Eigenschaften zu studieren. Es wurden mehrere Verfahren beschrieben worden, um Leukozyten aus dem menschlichen maternofetalen Schnittstelle 10,14,25,27,37-39 isolieren. Während einige gelten mechanische Aufschlüsselung 10,25,27,38, andere verwenden enzymatische Verdauung 37,40 für Gewebedissoziation. Da mechanische Zerlegung erzeugt eine geringere Ausbeute und verminderte Lebensfähigkeit 41 und enzymatische Dissoziation kann Lebensfähigkeit und Zelloberflächenmarker Retention 42 beeinflussen, die hier beschriebene Methode kombiniert sanfte mechanische Dissoziation mit enzymatische Vorbehandlung, die Ausbeute an isolierten Leukozyten, ohne dabei die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Eine ähnliche Kombination von Methoden nachgewiesen wurde als wirksam bei der Isolation von Leukozyten aus der Dezidua-Gewebe an der mütterlich-fötalen Grenzfläche 39 ist. Daher sind die hierin beschriebenen Protokoll beinhaltet mechanische Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, die Konsistenz erhöht und spart Zeit und Arbeit, wenn die traditionellen Fleischwolf gegenüber gegnerischen Skalpelle, Rasierklingen, oder chirurgische Scheren 10,28. Die für Gewebedissoziation gewählten Enzym war Accutase. Anders als häufig verwendete Kollagenase 43, Dispase 44 und Trypsin 45, Accutase (a Zellablösung Lösung) kombiniert sowohl allgemeine proteolytischen und kollagenolytische Aktivitäten, die für eine effiziente und dennoch schonende Dissoziation 46,47 beizutragen. Nach Dissoziation werden die Leukozyten aus der Gesamtbevölkerung der Deciduazellen durch Dichtegradientenzentrifugation angereichert. Verschiedene Dichtegradientenmedien zuvor verwendet worden, von denen die häufigsten sind Percoll (eine Suspension von kolloidalen Siliciumdioxidteilchen) 48 und Ficoll (ein Polymer aus Saccharose mit einem hohen synthetischen Molekulargewicht) 49. Die überlegene Effizienz der Trennung von der Saccharose Polymer wurde previonuierlich 50 gezeigt, und die hierin weiter beschriebenen Protokoll beweist, dass diese Dichtegradientenmedien erzeugt eine ausreichend hohe Reinheit von mononukleären Leukozyten. Daher ist das hier beschriebene Protokoll verbindet die mechanische Gewebe Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, enzymatische Verdauung mit einer Zellentfernungslösung und Leukozyten-Trennung mit einem Dichtegradientenmedien (1,077 + 0,001 g / ml), um Leukozyten aus menschlichen Dezidua-Gewebe zu isolieren. Dieses Protokoll ist nachgewiesen worden, Zelloberflächenantigene zusammen mit Zelllebensfähigkeit zu bewahren. Die isolierten Leukozyten kann für mehrere Anwendungen, die Immunphänotypisierung mit der Durchflusszytometrie und funktionelle Untersuchungen in vitro zählen verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers&#160;</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>(1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small Petri dishes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>(cell detachment solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 2 mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>FALCON/Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI culture medium 1640&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22400-089</td>
			<td>(1X) (10% FBS and 1% P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic chamber slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>HEPA Class 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ISOTEMP 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexelcom</td>
			<td>Cellometer Auto2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre-separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>(Fc Block)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human cell surface antigen antibodies&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>346202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>20% density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MAXQ 4450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSR-Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SpinChron DLX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface

Schwangerschaft wird durch die Infiltration von Leukozyten in der reproduktiven Gewebe und an der Mutter und Fötus-Schnittstelle (Decidua basalis und Dezidua parietalis) gekennzeichnet. Diese Schnittstelle ist der anatomischen Stelle der Kontakt zwischen Mutter und Fetus Gewebe; es ist daher ein immunologisches Wirkort während der Schwangerschaft. Infiltrieren Leukozyten an der Mutter und Fötus Schnittstelle spielen eine zentrale Rolle bei der Implantation, Schwangerschaft Wartung, und der Zeitpunkt der Lieferung. Daher werden phänotypische und funktionelle Charakterisierung dieser Leukozyten Einblick in die Mechanismen, die zu Schwangerschaftsstörungen führen werden. Verschiedene Protokolle haben, um zu isolieren infiltrierenden Leukozyten aus der Dezidua basalis und Dezidua parietalis beschrieben; Jedoch macht der Mangel an Übereinstimmung in den Reagenzien, Enzyme und Inkubationszeiten es schwierig, diese Ergebnisse zu vergleichen. Hierin wird ein neuartiger Ansatz, der die Verwendung von sanften mechanischen und enzymatischen diss kombiniertereinigung Techniken, um die Lebensfähigkeit und Integrität der extra- und intrazellulären Markern in Leukozyten aus den menschlichen Geweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle getrennt zu bewahren. Abgesehen von Immunphänotypisierung, Zellkultur und Zellsortierung, die zukünftige Anwendungen dieses Protokolls sind zahlreich und vielfältig. Nach diesem Protokoll können die isolierten Leukozyten verwendet werden, um DNA-Methylierung, die Expression von Zielgenen, in vitro Leukozyten Funktionalität (dh die Phagozytose, Zytotoxizität, T-Zellproliferation und Plastizität, etc.), und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies zu bestimmen an der Mutter und Fötus-Schnittstelle. Zusätzlich mit dem beschriebenen Protokoll wurde dieses Labor in der Lage, neue und seltene Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zu beschreiben.

. Die Präparation von menschlichen Geweben auf der mütterlich-fötalen Grenzfläche (Dezidua basalis und Dezidua parietalis) ist in Abbildung 1 dargestellt Dieses Verfahren umfasst die Präparation der Grundplatte, die Decidua basalis (1A - D) enthält. Decidua basalis wird durch Entfernen des Plazentazotten (fötales Seite) von der basalen Platte (1C) erhalten. Decidua parietalis wird durch leichtes Abkratzen der Chorionmembran (1E -...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

isolation-of-leukocytes-from-the-human-maternal-fetal-interface

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.9K Aufrufe.  NICHD/NIH/DHHS. Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis. 

Serie: Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...