Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der National Science Foundation Grants MCB-0718846 und Defense Advanced Research Projects Agency Contract N66001-12-C-4020 (zu JDB). LAM wurde durch ein Forschungsstipendium aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada finanziert. Veröffentlichung dieses Artikels wird von Roche gesponsert.

1. Bereiten Sie genomischer Hefe-DNA (gDNA) <ol><li> Wird eine Stamm von Hefelyse Puffer 9, die mit 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% SDS enthält (w / v), 2% Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA pH 8,0. </li><li> Als Ausgangsmaterial Gebrauch ~ 2 x 10 6 Zellen, die in der Regel entspricht ~ 100 ul gesättigter Kultur für Laborstämme der BY4741 10 Hintergrund. Kultivierten Zellen sollten durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 3 min bei Raumtemperatur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt werden. Saugen Sie den Überstand. </li><li> Fügen Sie 200 ul Hefe Lysis Buffer und Zellpellet durch Pipettieren. </li><li> Hinzuzufügen ~ 300 ul säuregewaschene Glasperlen, so dass das Niveau der Perlen beträgt etwa 1 mm unter der Ebene der Zellaufschlämmung. </li><li> Unter einem Abzug mit 200 ul Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1). Verschließen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen und sicherzustellen, dass keine Kugeln werden zwischen der Kappe und dem Rohr stecken, da dies zu Undichtigkeiten beim Schütteln führen(Schritt 1.6). Invert 3 Mal zu mischen und zu überprüfen, die Kappe verschlossen. </li><li> Das Röhrchen wird 10 min bei Raumtemperatur unter Verwendung eines stationären Mischers, wie einer Eppendorf 5432. </li><li> Zentrifuge bei 20.800 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Transfer 75 ul der wässrigen Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 100% Ethanol. Kehren Sie 10-mal zu mischen. </li><li> Pellet die DNA durch Zentrifugation bei 20.800 xg für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren ohne Verdrängen der DNA-Pellet. Mit 500 ul 70% Ethanol Waschen des Pellets. </li><li> Zentrifuge bei 20.800 g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren ohne Verdrängen der DNA-Pellet und der Luft trocknen das Pellet mit dem Mikrozentrifugendeckel geöffnet, bis überschüssiges Ethanol verdampft ist, die in der Regel rund 10 min. </li><li> Resuspendieren der DNA-Pellet in 75 ul 10 mM Tris pH 7,4 und Vortex mischen. Bewahren Sie die Probe bei -20 ° C auf unbestimmte Zeit. Messung der DNA-Konzentration in der Probe unter Verwendung einesLaborcytometer Fluorimeter wie das Qubit, das DNA aus RNA unterscheidet. Sicherzustellen, dass die Endkonzentration von gDNA ~ 1-2 ng / ul. </li><li> Bereiten Sie eine 1:10 Verdünnung von genomischer DNA mit Wasser und Wirbel zu mischen. </li><li> Aliquote von 30 ul verdünnt gDNA in die entsprechende Vertiefung einer Quellenplatte, die mit einem nanoskaligen akustischen Flüssigkeitsspender (Schritt 3) kompatibel ist. Bei Verwendung eines Labcyte Echo 550, mit einem 384-Well-Polypropylenplatte (384PP Platte). HINWEIS: Wenn in geeigneter Weise versiegelt diese Platte für mindestens einen Monat bei -20 ° C gelagert werden. </li></ol> 2. Bereiten Sie und Dispense qPCR Master Mix in eine Multiwell-Platte 1536 <ol><li> Vorzubereiten 850 ul qPCR Mastermix wie LightCycler 1536 DNA Grün Master in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Vortex zu mischen. Zentrifugieren Sie die qPCR-Mastermix für 2 min bei 20.800 xg bei Raumtemperatur, um alle Luftblasen zu entfernen. Die Komponenten der qPCR-Mastermix für eine einzelne 1536 Multiwellplatte erforderlich sind wie folgts: <ol><li> Kombinieren Sie 170 ul der Enzym-Mastermix (Grün Meister Rohr 1, 5-fach konzentriert), 42,5 ul SYBR (Grün Meister Röhrchen 4, 20x konzentriert) und 637,5 ul Wasser. </li></ol></li><li> Dispense 500 nl / Vertiefung in eine 1.536 Multiwellplatte mit einem großen Flüssigkeitsspender, wie die Art Robbins Cobra. (Beachten Sie, dass 2.2.1-2.2.4 beziehen sich speziell auf die Cobra Schritte.) <ol><li> Erstellen Sie einen Ausgabeprogramm mit folgenden Einstellungen: flüssig Klasse, Wasser; absaugen Volumen, 800 &amp; mgr; l; Abgabevolumen, 500 nl; Waschzeit, 20 sec. In den Ausgabeeinstellungen, überprüfen die Ausgabegeschwindigkeit auf 49,6 mm / s eingestellt wird, ist die Abgabe Offset 0,25 mm, und die überschüssige aufgenommene Flüssigkeit wird auch wieder in die Quelle verzichtet werden. </li><li> Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen, das die qPCR Mastermix in Vertiefung A1 des Mikrozentrifugenröhrchen Halter, die in Liegeposition 1 befindet, die Kappe des Mikrozentrifugenröhrchen Schneiden oder einfach offen lassen. Stellen Sie die &quot;Saugen Sie auch &#39;zu A1 durch Bearbeiten der aspirate-Einstellungen. </li><li> Führen Sie einen Waschschritt vor der Abgabe qPCR Mastermix von ersten Abwahl der ansaugen und abgeben Schritte des Programms in Schritt 2.2.2 zu setzen und dann schlagen Sie &quot;Ausführen&quot;. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie die Wieder ansaugen und abgeben Schritte vor dem Ausführen des vollständigen Programm zur qPCR Mastermix verzichten. Wenn der Cobra wurde im Leerlauf für weniger als 10 Minuten die anfängliche Waschschritt, der prime Systems dient, ist nicht notwendig. </li><li> Hit &#39;run&#39; bis qPCR Mastermix in jede Vertiefung zu verzichten. </li></ol></li><li> Sammeln Sie die qPCR Mastermix am Boden jeder Vertiefung durch kurze Zentrifugation von der 1536 Multiwellplatte (30 sec mit einem Low-Speed-PCR-Platte Spinner). </li></ol> 3. Geben Sie Template-DNA und Primer in die 1536 Multiwellplatte <ol><li> Verzichtet 5 nl verdünntem gDNA (Schritt 1.3) in die gewünschten Vertiefungen der Multiwellplatte 1536 unter Verwendung eines akustischen Flüssigkeitsübertragungssystem, wie das Echo 550. <ol><li> Für die Echo 550, verwenden Sie die Platte formatieren Software oder alternativ eine benutzerdefinierte Excel-Tabelle, um die Übertragung zu programmieren. Sicherstellen, dass die gewählte Quelle und für die gDNA in das Programm passt die Quelle auch in die Sie körperlich verzichtet haben die gDNA (Schritt 1.3). Quelle auswählen Plattentyp &#39;384PP_AQ_BP2&#39;, was anzeigt, die Flüssigkeit in dem 384PP Platte ein Puffer ohne Tenside. </li></ol></li><li> Verzichtet 10 nl Primer, vorwärts vorgemischt und umgekehrt zu einer Endkonzentration von jeweils 50 &amp; mgr; M zu den gewünschten Vertiefungen 1536 Multiwell-Platte unter Verwendung eines akustischen Flüssigkeitsübertragungssystem, wie das Echo 550. <ol><li> Für die Flüssigkeitsübertragungssystem, verwenden Sie die Platte formatieren Software oder alternativ eine benutzerdefinierte Excel-Tabelle, um die Übertragung zu programmieren. HINWEIS: Hier ist es möglich, Primer verzichtet werden, so dass das Layout auf dem 1536 Multiwellplatte entspricht der chromosomalen Reihenfolge der Primer so ist es einfach, eine Sichtprüfung, die Echtzeit-PCR-Ergebnissespäter (Schritt 6). </li><li> Fertigmischfutter der Primer in einer Platte, die mit der akustischen Flüssigkeitsspender kompatibel ist. Für das Echo 550, verwenden Sie ein Labcyte 384LDV (geringes Totvolumen) Platte und wählen Sie die Quellplatte Typ &#39;384LDV_AQ_B &quot;bei der Programmierung des Echo, um anzuzeigen, die Flüssigkeit ist ein einfacher Puffer ohne Proteine. </li></ol></li></ol> 4. Seal und die Centrifuge 1536 Multiwellplatte <ol><li> Verwendung eines Mikroplatten Versiegelsystem wie die PlateLoc Thermal Microplate Sealer, sofort abdichten 1536 Multiwellplatte mit optisch klare Dichtung, die mit der Heißsiegelgerät Instrument kompatibel ist. Die Oberfläche nicht berühren, der Dichtung zu Schmierflecken zu vermeiden. <ol><li> Bei Verwendung des Microplate Sealer PlateLoc Thermal, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: versiegeln Zeit 2,0 sec, Siegeltemperatur 162 ° C, Luftdruck 82 psi. Dieses Instrument nimmt ca. 5 min zu erwärmen und so sollte vorher eingeschaltet werden. </li><li> Bei Verwendung des Microplate Sealer PlateLoc Thermal, ein adapter verwendet, um die Höhe der 1536-Multiwellplatte auf der Bühne des Instruments zu erhöhen, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. HINWEIS: Zwar ist es vorzuziehen, eine Bühnenplatte für die Thermal Microplate Sealer PlateLoc kaufen, ist eine alternative Lösung zu vier ~ 2 mm dick Standardscheiben erhältlich in jedem Baumarkt in den Ecken einfügen, um die Höhe der 1536 Multiwellplatte zu erhöhen. </li></ol></li><li> Die versiegelte 1536 Multiwellplatte sofort Zentrifugation bei 2.000 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur, um alle Reagenzien an der Unterseite jeder sammeln auch. </li></ol> 5. Real Time PCR <ol><li> Programm A 1.536 qPCR Instrument, wie dem LightCycler 1536 mit einem zweistufigen Amplifikationsprotokoll gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse. Mit Hilfe der LightCycler 1536 Software ein Programm einzurichten, wie folgt: <ol><li> Vorinkubation: 95 ° C, 1 min halten, Anstiegsrate 4,8 ° C / s, keine Übernahme. </li><li> Zwei-Schritt-Amplifikation: 30 Zyklen von [95 ° C, keine halten,Anstiegsrate 4,8 ° C / s, keine Übernahme; 64 ° C, 30 Sek halten, Anstiegsrate 2,5 ° C / s, Einzelaufnahme]. </li><li> Die Schmelzkurve: 95 ° C, 10 sec, Anstiegsrate 4,8 ° C / s, keine Übernahme; 60 ° C, 1 min, Aufheizgeschwindigkeit 2,5 ° C / s, keine Erfassung; 97 ° C, Anstiegsrate von 0,1 ° C / s, 5 Akquisitionen / ° C (Dauerbetrieb). </li><li> Cool: 40 ° C, 30 sec, Anstiegsrate 2,5 ° C / s, keine Übernahme. </li></ol></li><li> Stellen Sie die Erkennung Format zu &#39;Green Interkalationsfarbstoff &quot;in der Registerkarte Start Definition. </li><li> Setzen Sie die Pipettensteuer zu &quot;Master Control&quot; in der Registerkarte Start Definition. Diese Eigenschaft dient als interne Kontrolle und erkennt das Vorhandensein qPCR Mastermix in jede Vertiefung der Multiwell-Platte 1536, die nützlich für putative falsche Negative identifizieren. </li><li> Legen Sie die 1536 Multiwellplatte in Schritten 2-4 in den 1536 qPCR Instrument vorbereitet und das Programm auszuführen. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Perform visuelle Inspektion der Daten innerhalb der qPCR Software. HINWEIS: Die 1536-Software ermöglicht die Visualisierung sowohl von Amplifikation und Schmelzkurven sowie einem Wärme zeigt den Aufruf (positiv, negativ, ungültig ist, N / A, Abbildung 2), der Kreuzungspunkt-Wert (Schiebefarbskala für positive oder grau für negative; Abbildung 3) oder ein Endpunkt Fluoreszenz (EPF) Wert (Schiebefarbskala). </li><li> Exportieren von Daten aus dem 1536 Software in Form einer TXT-Datei (Ergebnistabelle) oder .xml-Datei entweder mit den Rohdaten oder berechneten Daten für die Bearbeitung offline aus dem Instrument. HINWEIS: Die teilnehmerautomatisierten Kreuzungspunkt (Cp) Aufruf Algorithmus in die 1536-Software gebaut berücksichtigt die Form und Steigung der Verstärkungskurve, während die Bestimmung positiv / negativ und Cp Wert Anrufe mit hohen Vertrauen, bei niedrigen Untermikroliter Reaktionsvolumina mit vergleichsweise niedrigen Fluoreszenzwerte. </li><li> Wenn der LightCycler DNA Grün Meister war Gebrauchd für qPCR, sicherzustellen, dass alle Vertiefungen bestand die &quot;Master-Steuerung&quot;. A fail weist auf die auch nicht erhalten qPCR-Mastermix und der fehlenden Datenpunkt sollte als möglicher falsch negativ sein. Überprüfen Sie, dass alle Vertiefungen bestand die &quot;Master-Steuerung&quot;. A fail weist auf die auch nicht erhalten DNA Mastermix und betrachten den fehlenden Datenpunkt ein Potential falsch negativ. </li></ol>

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	<li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li><li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design.">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li><li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization.">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li><li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit.">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li><li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-A-Gene+with+GeneDesign.">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li><li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes.">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li><li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome:+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast.">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li><li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li></ol>

LAM, NAP, Marmelade und JDB haben nichts zu offenbaren. RC und AL werden von Roche Life Science beschäftigt, den USA und arbeitete an der Entwicklung der Anwendung mit LAM als Teil eines proof of principle experiment.

Der Einbau von Echtzeit-PCR-Nachweis in den PCRTag Genotypisierungsassay ist eine wichtige Entwicklung für die Sc2.0 Projekt, da es ermöglicht deutlich höhere Durchsatzleistung. Der bisherige Workflow angegebenen 2,5 ul Reaktionen in 384-Well-PCR-Platten, 1,5 h Temperaturwechsel Laufzeit, Agarose-Gelelektrophorese, und manuelle Annotation des Gels. Die hier vorgestellte Workflow, genannt qPCRTag Analyse überwindet mehrere große Engpässe. Zunächst kondensiert ein qPCRTag Lauf 4 x 384-Well-Platten in einem einzigen Experiment die verarbeitet werden können, von Anfang bis Ende (Platte eingerichtet und Laufzeit), in etwa eine Stunde. Es ist wichtig zu beachten, dass die Kosten pro Reagenz gut für qPCRTag Analyse ist auf Augenhöhe mit dem geringeren Durchsatz Agarose-Gel-basierten Ansatz. Unter Umgehung Gelelektrophorese und manuelle Annotation, bietet jedoch die qPCRTag Workflow erhebliche Einsparungen bei Zeit und Arbeit, die die wichtigsten Vorteile sind. Wichtig ist die qPCRTag Workflow entirely kompatibel mit Automatisierung. Ein Hauptproblem bei der Verwendung von Echtzeit-Erkennung als die Ausgabe des PCRTag Assay ist die Rate der falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse. Da die PCRTag Primer wurden ursprünglich nicht für die Verwendung in Echtzeit-PCR entwickelt, wird erwartet, dass nicht alle Primerpaare für die Verwendung mit diesem Ausgang geeignet. Zu diesem Zweck ist es wichtig, die Funktion und Spezifität aller PCRTag Primerpaare zu validieren, um die Untergruppe, die nicht in den Echtzeit-basierten Assay vorne nicht funktionieren auszuschließen. Zum Beispiel sind Chromosom 3 PCRTag falsche Positive und Negative nach und große reproduzierbar in der Echtzeit-PCR-Daten (Abbildungen 2 und 3) und diese können von weiteren Analysen ausgeschlossen werden. Ferner Primerpaare bekannt fehl (durch Gelelektrophorese bewertet und in den Fig S6 und S7 von Annaluru et al. 1 gezeigt) kann ebenfalls ausgeschlossen werden. Dies ist leicht einfach erreicht excluding die fehlerhaften Primerpaare bei der Einrichtung des akustischen Übertragungsprotokoll. Wie die meisten Assays mit hohem Durchsatz, beabsichtigen wir, Echtzeit PCRTag Erkennung als primären Bildschirm verwenden, um Transformanten, die weiter stromabwärts Validierung verdienen zu identifizieren. Anschließend wird der Goldstandard für sekundäre Screening PCRTag Analyse mit Gelelektrophorese als Auslese bleiben. Über die Anwendung der PCRTag Analyse für Sc2.0, die Kombination von state-of-the-Art nanoskaligen Liquid-Handling-Systeme mit hohem Durchsatz Echtzeit-PCR-Technologie ermöglicht eine schnelle und automatisierte Analyse und hat das Potenzial, viele Bereiche auswirken. Beispielsweise könnte dieser Workflow, um einen hohen Durchsatz-Bibliothek-Screening, Infektionskrankheiten Diagnose, microbiome Analyse und innovative Genom Bearbeitung angewendet werden Ansätze versucht, mehrere Loci gleichzeitig ändern.

Sc2.0 oder synthetische Hefe-Genom-Projekt ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ) hat sich zum Ziel gesetzt, entwerfen und bauen eine völlig synthetische eukaryotische Genom gesetzt. Unter Verwendung des hoch kuratiert Genomsequenz von Saccharomyces cerevisiae 3 als Ausgangspunkt, jeder der sechzehn lineare Chromosomen wurde neu entwickelt, um eine Reihe von Design-Prinzipien, die Aufrechterhaltung der Zell Fitness, Verbesserung der Genomstabilität und Erhöhung genetische Flexibilität angeben erfüllen. Zum Beispiel sind destabilisierende Elemente wie Wiederholungen von Sc2.0 Chromosomen gelöscht. Alle Instanzen TAG Stopcodons an TAA umcodiert zu &quot;frei&quot; ein Codon in der endgültigen Belastung für die Einführung von nicht genetisch codierte Aminosäure. Zusätzlich eine induzierbare Evolution System, Scramble, durch die Cre-lox-System aktiviert ist, ermöglicht beispiellose Fähigkeit, derivative Genome mit neuartigen Strukturen 4 zu erzeugen. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Eine weitere große Design-Element in Sc2.0 Genom ist die Einführung von PCRTags, die als DNA Wasserzeichen dienen der Verfolgung von synthetischen und Wildtyp-DNA zu ermöglichen. PCRTags sind kurz, re-codierten Segmente in ORFs auf synthetischen Chromosomen; während die PCRTag Sequenzen sich auf DNA-Ebene zwischen synthetischen und Wildtyp-Chromosomen sind die kodierten Proteine ​​in der Aminosäuresequenz und daher vermutlich Funktion identisch. PCRTag Sequenzen spezifisch als Primerbindungsstellen zur selektiven Amplifikation (Figur 1A) erleichtert gestaltet. PCRTag Entwurf wird unter Verwendung des &#39;unterschiedlichsten&#39; Algorithmus in GeneDesign 5,6 durchgeführt, wodurch man umcodiert synthetische Sequenzen, die in der Regel ca. 60% anders als die nativen Sequenzen (mindestens 33%) mit Schmelztemperaturen zwischen 58 ° C und 60 ° C und sind Amplicon Längen zwischen 200-500 Basenpaaren 2. Neukodierung nicht innerhalb der ersten 100 bp jedes ORF erlaubt, da diese Bereiche mit bekanntenhaben spezielle Einstellungen in Bezug auf die Codon-Nutzung 7. Gemeinsam begünstigen diese Designregeln Hochleistungs fast aller PCRTags unter einem einzigen Satz von PCR-Bedingungen, bei denen synthetische und Wildtyp PCRTag Primerpaare ausschließlich zu binden und zu verstärken, synthetische und native DNA, bzw. (1B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Abb. 1: schematische PCRTag (A) PCRTags neu kodiert Sequenzen innerhalb offenen Leserahmen (ORF) der Gene auf Sc2.0 Chromosomen. (B) synthetische (SYN) und Wildtyp (WT) PCRTag Primer ausschließlich zu binden und zu verstärken und synthetischen Wildtyp-Genom-DNA (gDNA) sind. Dargestellt ist hier eine Analyse einer ~ 30 kb-Segment des linken Arms von Chromosom sechs Testen dreizehn PCRTag Primerpaare entweder mit WT oder halb synVIL2 gDNA als Template. In vielen Fällen wird ein einziges ORF codiert für mehr als eine PCRTag. Vorhandensein / Fehlen PCRTag Amplikons über Agarose-Gelelektrophorese beurteilt. PCRTag Amplikons in der Größe von 200 bp auf 500 bp. Die schneller wandernden Spezies an der Unterseite der Platten sind Primerdimere. PCRTag Analyse hat sich als ein wichtiges Werkzeug bei der Montage der Sc2.0 Chromosomen. In einem typischen Experiment 30-50 kb synthetischer DNA, 20-30 PCRTags codiert, wird in Hefezellen transformiert, um die entsprechenden Wildtyp-DNA-1,2,8 ersetzen. PCRTag Analyse wird dann verwendet, um Transformanten, die synthetische, aber nicht Wildtyp PCRTags überspannt das Segment der DNA kodieren zu identifizieren, oder so genannte &quot;Gewinner&quot;. Es ist normalerweise notwendig, mehrere Trans testen &quot;Gewinner&quot; identifizieren, so dass der Durchsatz und die Kosten der PCRTag Analyse sind wichtige Überlegungen. Derzeit sind zwei Sc2.0 Chromosomen sind abgeschlossen (synIII 1 und synIXR 2), die weniger als 10% des Genoms Sc2.0, although mehr als die Hälfte der übrigen Chromosomen befinden sich derzeit in der Synthese und Montage. Die Skala der PCRTag Analyse für dieses Projekt erforderlich ist schnell übertraf die Fähigkeit, Gele laufen und manuell punkten die Anwesenheit von synthetischen DNA-und Abwesenheit von Wildtyp-DNA. Um den Durchsatz des PCRTag Test haben wir einen Workflow mit Echtzeit-PCR, die Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese umgehen entwickelt zu verbessern. Der Arbeitsablauf macht Gebrauch von einer großen Flüssigkeitsspender zur qPCR Mastermix in jedes Well einer Multiwell-Platte 1536, ein nanoskaliges akustischen Flüssigkeitsspender zur Matrizen-DNA und Primer übertragen zu verteilen, und eine 1.536 qPCR Thermocycler, so dass wir, um Reaktionen zu 500 nl miniaturisieren und Durchsatz zu maximieren. Außerdem Analyse automatisiert werden kann. Diese Art von Hochdurchsatz-Genotypisierung Protokoll sollte verallgemeinerbar für jedes Projekt Analyse vieler Klone erfordern an mehreren Loci sein.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Yeast gDNA prep</td></tr><tr><td>yeast gDNA</td><td>custom</td><td>custom</td><td>template for real time PCR</td></tr><tr><td>Acid-washed glass beads (0.5 mm)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>5432 Mixer</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>yeast cell lysis</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>gDNA quantification</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>gDNA quantification</td></tr><tr><td>Labcyte 384PP plate</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>gDNA source plate</td></tr><tr><td colspan="4">DNA Green Mastermix prep and dispensing</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 DNA Green</td><td>Roche</td><td>5573092001</td><td>real time PCR mastermix</td></tr><tr><td>1.5 ml Microfuge Tube Holder</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>microfuge tube holder for deck of Cobra</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td><td>Roche</td><td>5358639001</td><td></td></tr><tr><td>Cobra liquid handling system</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>630-1000-10</td><td>dispense qPCR master mix into 1536 plate</td></tr><tr><td>PCR Plate Spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>cenrifugation of 1536 plate</td></tr><tr><td colspan="4">Template and primer dispensing</td></tr><tr><td>PCRTag primers</td><td>IDT</td><td>custom</td><td>premixed forward and reverse, 50 &amp;mu;M each</td></tr><tr><td>TempPlate pierceable sealing foil, sterile</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>temporary seal for PCRTag primer plates</td></tr><tr><td>Labcyte LDV 384 well plate</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td><td>pre-mixed primer source plate</td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte</td><td></td><td>transfer 2.5 nl drops of primer and template DNA into 1536 plate</td></tr><tr><td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td><td>Agilent</td><td>G5402-90001</td><td>heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run</td></tr><tr><td>Clear Permanent Seal</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td><td>can substitute ~2 mm thick washers</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>centrifuge heat sealed 1536 plate</td></tr><tr><td>Industrial Air Compressor</td><td>Jun Air</td><td>1795011</td><td>to run the Echo and Heat Sealer</td></tr><tr><td colspan="4">Real Time PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td><td>requires 220 V outlet</td></tr></tbody></table>

qpcrtag analysis - a high throughput, real time pcr assay for sc2.0 genotyping

Die synthetische Hefe-Genom-Projekt (Sc2.0) zielt darauf ab, 16 Designer Hefechromosomen aufbauen und kombinieren sie zu einem einzigen Hefezelle. Einem synthetischen Chromosom, synIII 1, und ein synthetisches Chromosomenarm, synIXR 2 stammen, wurden konstruiert, und ihre in vivo-Funktion in der Abwesenheit von den entsprechenden Wildtyp-Chromosomen validiert. Ein wichtiges Designmerkmal Sc2.0 Chromosomen ist die Einführung von PCRTags, die kurze, re-kodierten Sequenzen innerhalb offenen Leserahmen (ORFs), die Differenzierung von synthetischen Chromosomen von ihren Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen sind. PCRTag Primer lagern selektiv entweder synthetischen oder Wildtyp-Chromosomen und der Gegenwart / Abwesenheit jeder Art von DNA kann unter Verwendung eines einfachen PCR-Assay getestet werden. Die Standard Auslesen des PCRTag Assay ist, um die Anwesenheit / Abwesenheit des Amplicons durch Agarose-Gelelektrophorese beurteilt. Jedoch mit einer durchschnittlichen PCRTag Amplikon Dichte von einem pro 1,5 kb und agenome Größe von ~ 12 Mb, wird die fertig Sc2.0 Genom rund 8.000 PCRTags kodieren. Um den Durchsatz zu verbessern, haben wir eine Echtzeit-PCR-basierten Nachweistest für PCRTag Genotypisierung, die wir qPCRTag Analyse nennen entwickelt. Der Arbeitsablauf gibt 500 nl Reaktionen in einer Multiwellplatte 1536, so dass wir mit sowohl synthetische als auch Wildtyp-Primerpaare in einem einzigen Experiment testen, bis zu 768 PCRTags.

Wir testeten synthetischen und Wildtyp-Chromosom 3 PCRTag Primerpaare 1 mit genomischer Hefe-DNA (gDNA) aus vier verschiedenen Stämmen extrahiert. Chromosom 3 hat 186 PCRTag Primerpaare, die die Länge des Chromosoms überspannen (synIII ist ~ 270 kb und Wildtyp-Chromosom 3 ~ 315 kb). Zu jeder der vier Stämme mit beiden Sätze von Primern zu testen, teilten wir die Multiwellplatte in vier Quadranten, eine für jede Art von gDNA, Zuweisen synthetischen PCRTag Primer an der oberen Hälfte jedes Quadranten und Wildtyp auf der unteren Hälfte. Genomische DNA wurde aus den Hefestämmen, von denen zwei zu kodieren Wildtyp-Chromosom 3 (Wildtyp, synIXR 2) extrahiert, während die übrigen zwei kodieren synthetischen Chromosom 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR Mastermix wurde mit einem großen Flüssigkeitsspender, gefolgt von gDNA und PCRTag Primer mit den Echo 550. Die Primer wurden identisch in aufgereiht in jede Vertiefung einer Multiwell-Platte 1536 abgegebenjeder Quadrant der Multiwellplatte für einfachen visuellen Vergleich. Die Multiwell-Platte wurde dann Hitze mit optisch klare Dichtung abgedichtet und auf Echtzeit-PCR-Analyse unterzogen. In diesem qPCRTag Experiment beobachteten wir, zum größten Teil, Verstärkung, wie erwartet, wobei ausschließlich synthetische Primer amplifiziert synthetische DNA und umgekehrt (Figuren 2 und 3). Allerdings beobachteten wir auch einige Abweichungen von dem erwarteten Muster, was darauf hindeutet, falsch-negative und falsche Positive in der Datenmenge. In diesem Experiment wurde die Mastersteuerung in 100% der Vertiefungen nachgewiesen, was auf die großen Flüssigkeitsspender erfolgreich in jede Vertiefung der Platte verzichtet Mastermix (Daten nicht gezeigt). Dies schließt eine mögliche Quelle für falsche Negative. Zusätzlich werden einige Chromosom 3 PCRTags bekannt fehl (in den Figuren gezeigt S6 und S7 von Annaluru et al. 1), darunter mindestens 2 SYN und 1 GewPrimerpaare; somit können diese Vertiefungen kann in jedem Quadranten ignoriert. Wahr falsch negative könnte aus einem Mangel an Transfer von template gDNA oder Primer in unserer Erfahrung ergeben sich jedoch angesichts der korrekten Kalibrierung von der Echo 550 sowie die Vorbereitung von gDNA und Primern, wie beschrieben, ist dies nicht eine Hauptfehlerquelle. Insgesamt in diesem Experiment die falsch-negative Rate war für WT Primer mit WT-Vorlage (~ 2%), obwohl für SYN SYN Primer mit DNA (~ 8%) etwas höher extrem niedrig. False Positives, die Erkennung von Signal in Brunnen, wo SYN Primer werden mit WT gDNA (und umgekehrt) gemischt werden, kann von Querverstärkung oder Primer-Dimere entstehen. Tatsächlich sind Primerdimere oft durch Gelelektrophorese (1B) sichtbar sind und eine angemessene Fehlerquelle. Für die Anwendung der qPCR kann die Untersuchung der Schmelzkurven von Nutzen sein, um zu bestimmen, ob verschiedene Arten, wie Primer-Dimere, in ein Signal beitragen. Ferner performing ein Kontrollexperiment, wobei Primer in Abwesenheit von Template-DNA entfallen kann zur Identifizierung von Primern mit einer Neigung zu dimerisieren. Quer Amplifikation durch Gelelektrophorese beobachtet werden, insbesondere, wenn zu viele PCR-Zyklen durchgeführt werden, oder wenn die Glühtemperatur zu niedrig ist. Wir haben durch die Optimierung dieser beiden Parameter für die qPCRTag Protokoll versucht, die Anzahl an Fehlalarmen zu minimieren durch Querverstärkung. Schließlich Prüfung der Übergangsstelle (Cp) Werte für jede Vertiefung kann dazu beitragen, Primer, die nicht in Echtzeit-basierte Erkennung geeignet sind (Abbildung 3, zum Beispiel BB22, Fb22, BB46, FB46). Insgesamt in diesem Experiment die False Positive Rate war gering für SYN-Primer mit WT-Vorlage (~ 5%) und höher für WT Primer mit SYN-Vorlage (~ 10%). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Abbildung 2: Plattenwärme Karte Anzeigen Gegenwart / absence halber qPCRTag Experiment. Vier verschiedene Typen von genomischer DNA (Quadranten durch feste weiße Linien getrennt) wurden unter Verwendung von synthetischen (SYN) zu PCRTag Analyse unterzogen und Wildtyp (WT) Chromosom 3 PCRTag Primer (gestrichelte weiße Linien zu trennen SYN (top ) und WT (unten) in jedem Quadranten). WT und synIXR gDNA kodieren Wildtyp-Chromosom 3, wodurch Amplifikation mit WT PCRTag Primer. SynIII und synIII synIXR gDNA kodieren synthetischen Chromosom 3, wodurch Amplifikation mit SYN PCRTag Primer. Primer werden nach ihren links-nach-rechts chromosomalen Positionierung angeordnet und in den vier Quadranten zum Vergleich positioniert identisch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Abbildung 3: PlattenwärmeKarte Anzeigen Kreuzungspunkt (Cp) Wert für eine qPCRTag Experiment. Das ist die gleiche Datenmenge wie in Abbildung 2 und die Platte Layout ist daher identisch. N / A bezieht sich auf &quot;keine Verstärkung.&quot; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.0K Aufrufe.  Institute for Systems Genetics. Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Serie: qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Forschung

Biotechnik

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Genetik

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the traditional method of choice is 3&#39; rapid amplification of cDNA ends (3&#39; RACE). Protocols for 3&#39; RACE require the careful design and selection of nested primers within the 3&#39; untranslated region (3&#39; UTR) of the target gene of interest. However, with a few modifications the protocol can be used to include the entire 3&#39; UTR and sequences within the open reading frame (ORF), providing a more comprehensive picture of the relationship between the ORF and the 3&#39; UTR. This is in addition to identification of the polyadenylation signal (PAS), as well as the cleavage and polyadenylation site provided by conventional 3&#39; RACE. Expanded 3&#39; RACE can detect unusual 3&#39; UTRs, including gene fusions within the 3&#39; UTR, and the sequence information can be used to predict potential miRNA binding sites as well as AU rich destabilizing elements that may affect the stability of the transcript.

The two different 3&#39; rapid amplification of cDNA ends (3&#39; RACE) protocols described here make use of two different DNA polymerases to map sequences that include a segment of the open reading frame (ORF), the stop codon, and the entire 3&#39; UTR of a transcript using RNA obtained from different cancer cell lines.

Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

Kandidaten-Gen Tests in klinischen Kohortenstudien mit gemultiplexten Genotypisierung und Massenspektrometrie

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples from cancer patients often directly influences diagnosis, prognosis, and/or therapy selection. As a result, the accurate detection of gene fusions has become a critical component of clinical management for many disease types. Until recently, clinical gene fusion detection was predominantly accomplished through the use of single-gene assays. However, the ever-growing list of gene fusions with clinical significance has created a need for assessing fusion status of multiple genes simultaneously. Next generation sequencing (NGS)-based testing has met this demand through the ability to sequence nucleic acid in massively parallel fashion. Multiple NGS-based approaches that employ different strategies for gene target enrichment are now available for use in clinical molecular diagnostics, each with its own strengths and weaknesses. This article describes the use of anchored multiplex PCR (AMP)-based target enrichment and library preparation followed by NGS to assess for gene fusions in clinical solid tumor specimens. AMP is unique among amplicon-based enrichment approaches in that it identifies gene fusions regardless of the identity of the fusion partner. Detailed here are both the wet-bench and data analysis steps that ensure accurate gene fusion detection from clinical samples.

This article details the use of an anchored multiplex polymerase chain reaction-based library preparation kit followed by next-generation sequencing to assess for oncogenic gene fusions in clinical solid tumor samples. Both wet-bench and data analysis steps are described.

Onkogene Genfusionsdetektion mit verankerter Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Krebsforschung

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Medizin

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Simultane Quantifizierung von T-Zell-Rezeptor-Excision Kreis (TRECs) und K-Löschen Rekombination Excision Kreis (KRECs) durch Echtzeit-PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Immunologie und Infektion

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium-Assay für Groß SNP Genotypisierung Anwendungen

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Biologie

Chip-Based Digital PCR to Detect Rare Transcript Variants Using a Nanofluidic Chip

Source: Molinari, C., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57066">Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates chip-based digital PCR &#8212; a variation of the digital PCR technique that is useful in detecting rare transcript variants. The PCR reaction is partitioned into the chambers of a nanofluidic chip, each of which acts as an independent reaction. The detection of fluorescence signals from the chambers with amplified targets confirms the presence of rare transcript variants in the sample.

Chipbasierte digitale PCR zum Nachweis seltener Transkriptvarianten mit einem nanofluidischen Chip

Source: Molinari, C., et al. Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR. J. Vis. Exp. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

PCR Techniques

Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

Source: Kahyo, T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58199">Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the utility of digital PCR in a chip-in-a-tube format for the detection of single nucleotide variations in DNA samples. A single PCR reaction is partitioned into chambers that act as independent PCR reactions, and the detection of fluorescence signals from the amplified targets in the chambers is used to compute the frequency of the variant allele in the sample.

Chip-in-a-Tube-basierte digitale PCR zur Quantifizierung von Einzelnukleotidvarianten

Source: Kahyo, T., et al. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the ...