Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

Hinweis: Lesen Sie CLSI Dokumenten M7-A10 und M100-S25 und / oder ISO / FDIS 20776-1 für weitere Informationen des Referenz Bouillon-Mikroverdünnungsverfahren für antimikrobielle Empfindlichkeit 2, 3, 4 Die Referenzmethoden ermöglichen die Optionen in einigen der. spezifischen Inokulumzubereitung und MIC-Panel-Produktion Verfahren das gleiche Endergebnis zu erzielen. Die hier gezeigten Verfahren bezieht sich auf ein antimikrobielles Mittel, Dalbavancin und einige der Schritte stellen eine potentiell mehrere Möglichkeiten der Referenzverfahren durchgeführt werden kann. Enden Sicherheitsvorkehrungen (im Einklang mit der biologischen Sicherheitsstufe 2) sollten genutzt 10 werden. Die MIC-Panel-Format für die Zwecke dieses Video Publikation ist in Tabelle 1 dargestellt. 1. Bewahren Dalbavancin Powder <ol><li> Nach Erhalt der Diagnosegrad Dalbavancin Pulver, bei -20 ° C in einem trockenen Umgebung in einer nicht-Abtauen Gefrierfach. Vor der Verwendung sollte das Pulver äquilibrierenerreichen RT vor dem Öffnen. </li></ol> 2. Bereiten Sie MIC Steuerung Verdünnungen <ol><li> Bereiten Sie eine Stammlösung nicht höher als 1.600 &amp; mgr; g / ml Dalbavancin in saubere (reine) DMSO in sterile Glas- oder Kunststoffröhrchen, und verwenden Sie am selben Tag der Vorbereitung oder bei -20 bis -60 ° C oder darunter für die zukünftige Verwendung in ein nicht-Abtauen Gefrierfach. Berücksichtigen Sie die Potenz Dalbavancin wie auf der mit dem Pulver erhielt Dokumentation, bei der Abwägung des Pulvers (siehe Gleichung 1 beispielsweise 800 &amp; mgr; g / ml Stoffaufbereitung). </li><li> Von der Stamm Verdünnung ähnlich dem Schema wie in Spalte 1 (&quot;Source Konzentration&quot;) in der Tabelle 2 mit reinem DMSO in sterile Glas- oder Kunststoffröhrchen dargestellt ist. Verwenden Sie eine Pipette zur Messung Verdünnungsmittel und andere Pipette für das Hinzufügen der ersten Dalbavancin Lager mit dem ersten Rohr. Für jede nachfolgende Dalbavancin Stammkonzentration verwenden Sie eine neue Pipette. </li><li> Bereiten 100X endgültigen MIC Panel concentRation Verdünnungen (Zwischen Konzentrationen) mit reinem DMSO. Wie dies in den Spalten 2-4 der Tabelle 2 gezeigt, zu verbinden und geeignete Mengen von Quelle und DMSO in gewünschte Zwischenkonzentration zu erreichen (um verwendet wird, hängt Anzahl von MIC Platten abhängen Volumina vorgenommen werden). </li><li> Bereiten 0,004% P80: Bereiten Sie eine frische Arbeitsstammlösung von 2% P80 durch Zugabe von 0,1 ml bis 4,9 ml P80 dH 2 O Sterilisiert, indem sie durch ein 0,22-Mikron-Filter und Gebrauchslösung am gleichen Tag der Herstellung. Vorbereitung 0,004% P80 Verdünnungsmittel, indem eine 1: 500-Verdünnung von 2% P80 (zB 0,3 ml 2% P80 149,7 ml CAMHB). </li><li> Weiter verdünnen die mittleren Konzentrationen in Schritt 2.2 1 hergestellt: 100 in Kation eingestellt Mueller Hinton-Brühe (CAMHB) mit 0,004% ergänzt (v / v) Polysorbat 80 (P-80) P-80 und / oder LHB (Streptokokken) hinzugefügt 2 Verdünnung: mit der doppelten Endkonzentration weil Zugabe von Impfgut (Schritt 4.3) werden in einem 1 führen. Siehe Spalten 6 und 7 in Tabelle 2 </strong&gt;. </li></ol> 3. Bereiten Sie MIC Panels <ol><li> Geben Sie 50 ul jeder in Schritt 2.3 vorbereitet Dalbavancin Lösung in die entsprechenden Wells der MIC-Panel und schließen Medien nur in einem gut (Wachstumskontrolle). Ein Mehrkanal-Pipette mit einer sterilen Pipettenspitzen können für diesen Schritt verwendet werden. </li><li> Verwenden Platten sofort oder Dichtung mit Kunststofffolie, in Plastiktüten und sofort in einem nicht-Abtauen Gefrierfach legen bei ≤-20 ° C (vorzugsweise bei ≤-60 ° C), bis sie benötigt. Wenn gefrorene Platten verwendet werden, entfernen Sie Dichtungen und legen einzelnen Platten auf Labortisch für 15-30 min (bis weit Inhalts aufgetaut werden), bevor Sie mit Panel Inokulation. </li></ol> 4. Impfen MIC Panels, Führen Reinheit und Setup Koloniezahl <ol><li> Wählen Sie mehrere gut isolierte Kolonien von einer 18-24 h Blutagar oder andere nicht-selektiven Agar-Platte. Tippen Sie auf die oben auf jeder Kolonie mit einer sterilen Schleife oder Tupfer und Transfer zum 1-5 ml CAMHB oder saline bis eine Trübung entspricht einem 0,5-McFarland-Standard. Beurteilen Trübung durch visuellen Vergleich mit dem 0,5 McFarland oder mit einem photometrischen Gerät. </li><li> Innerhalb von 15-30 min Vorbereitungs verdünnt das Inoculum 1: 100 in CAMHB (100 ul in 10 ml CAMHB). Für die meisten Bakterien, gegen Dalbavancin getestet, mit der Ausnahme von S. pneumoniae wird diese Verdünnung einen Abschluss gut Konzentration von 5 × 10 5 CFU / ml (akzeptierbare Bereich 2-8 × 10 5 CFU / ml). Für S. pneumoniae ist die bakterielle Konzentration basierend auf dem Vergleich der Trübung, um eine 0,5 McFarland typischerweise wesentlich weniger daher verdünnt das Inokulum 1.25 (400 ul in 10 ml CAMHB + 10% + LHB). </li><li> Innerhalb von 15 Minuten nach der Inokulumzubereitung, Transfer 50 ul der endgültige Inokulum in jede Vertiefung (mit Ausnahme der Sterilitätskontrolle auch) der MIC-Panel in Schritt 3 vorbereitet Ein Mehrkanal-Pipetten mit sterilen Spitzen können für diesen Schritt verwendet werden. </li><li> Führen Sie eine Reinheitskontrolledurch die Übertragung und Verbreitung einer 1-10 ul-Aliquot aus der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung mit einer sterilen Schleife zu einer nicht-selektiven Agar (zB Trypticase-Soja-Agar mit 5% Schafblut). </li><li> Setup-Koloniezahl, indem 10 &amp; mgr; l aus der Wachstumskontrolle mit einem einzigen Kanal Pipette und sterile Spitze und Transfer in 10 ml Kochsalzlösung (1: 1000 Verdünnung). Mischen Sie und Transfer 100 ul mit einem Einkanal-Pipette und sterile Spitze an eine geeignete, nicht-selektiven Agar-Medium (zB Trypticase-Soja-Agar mit 5% Schafblut) und über die gesamte Agaroberfläche verteilt mit einer sterilen Schleife, wiederholen zweimal in verschiedenen Richtungen um eine gleichmßige Verteilung des Inokulums (1:10 Verdünnung) zu gewährleisten. </li></ol> 5. Inkubieren MIC Panels, Koloniezählung und Reinheit Teller <ol><li> Dichten Sie jeden MIC Tafel oder Stapel von nicht mehr als 4 Platten in einem Plastikbeutel, mit Kunststoffband oder mit einem eng anliegenden Kunststoffabdeckung vor der Inkubation. Alternativ platzieren leere MIC-Panel auf der top der Stapel von nicht mehr als 4 MIC-Panels, legen Sie einen feuchten Papiertuch in einem Kunststoffbehälter, Ort, MIC-Panels in den Kunststoffbehälter und in der Nähe Behälter sicher mit Deckel. </li><li> MIC Platten in einem Umgebungsluft-Inkubator bei 35 ° C ± 2 ° C für 16-20 h (Staphylokokken und Enterokokken) und 20-24 h (Streptokokken) innerhalb von 30 min der Inokulation. Inkubieren Sie die Koloniezahl und Reinheit Platten unter den gleichen Bedingungen, außer Inkubat Streptokokken in einer 5% CO 2 Inkubator. </li></ol> 6. Lesen Sie den MIC und Colony Count Plates; Überprüfen Reinheit Teller <ol><li> Lesen des MIC als die niedrigste Konzentration, die vollständig hemmt das Wachstum von Bakterien in den Vertiefungen durch das bloße Auge erkannt. </li><li> Graf Kolonien auf der Koloniezahl Platte. Multiplizieren jede Kolonie durch Verdünnungsfaktor (1: 10.000) (zB 50 Kolonien äquivalent zu 5 x 10 &amp; sup5; CFU / ml). Ein akzeptabler Bereich 20-80 Kolonien (2-8 x 10 5 CFU / ml) und wird als ein appro verwendetximate Leitlinie. </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit Platte. Wenn alle Kolonien ähnlich wie die in Schritt 4.1 verwendet Kolonien sind, dann können das Inokulum als rein angesehen werden. Wenn es irgendwelche anderen vorhandenen Kolonien, dann gibt es Potenzial für eine Verunreinigung in dem MIC-Panel vorhanden sein, und der Test sollte wiederholt werden. </li></ol> 7. Prüfen Ergebnisse der Qualitätskontrolle. <ol><li> Siehe Tabelle 3 für die erwarteten Bereiche der CLSI Qualitätskontrollstämme. Nur Bericht Ergebnisse der Test-Isolaten, wenn Dalbavancin MIC-Ergebnisse für die Qualitätskontrolle Organismus (en) sind im erwarteten Bereich. </li><li> Wenn eine MIC von ≥0.25 ug / ml für jede klinische S erhalten aureus zu isolieren, wiederholen Sie den Dalbavancin MIC-Tests und / oder zu senden an ein Referenzlabor für die Prüfung. </li></ol>

<ol>
	<li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once-weekly+dalbavancin+versus+daily+conventional+therapy+for+skin+infection.">Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection.</a> The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+laboratory+testing+and+in+vitro+diagnostic+test+systems+--+Susceptibility+testing+of+infectious+agents+and+evaluation+of+performance+of+antimicrobial+susceptibility+test+devices+--+Part+1:+Reference+method+for+testing+the+in+vitro+activity+of+antimicrobial+agents+against+rapidly+growing+aerobic+bacteria+involved+in+infectious+diseases.">Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases.</a> ISO/FDIS. 20776-1, (2006).</li><li>Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surrogate+analysis+of+vancomycin+to+predict+susceptible+categorization+of+dalbavancin.">Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).</li><li>Turnidge, J., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+and+revising+antibacterial+susceptibility+breakpoints.">Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints.</a> Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).</li><li>Rennie, R. 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Poster 132.</a> ASM. , (2012).</li><li>Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+dalbavancin+MIC+values+determined+by+Etest+(AB+BIODISK)+and+reference+dilution+methods+using+gram-positive+organisms.">Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).</li><li>Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dalbavancin+against+staphylococci+and+streptococci,+assessed+by+BSAC+and+NCCLS+agar+dilution+methods.">Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).</li><li>Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+dalbavancin+potency+and+spectrum+in+the+United+States+(2012).">Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012).</a> Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).</li></ol>

Sandra McCurdy ist Mitarbeiter von Durata Therapeutics; Laboratory Specialists, Inc., Arbeitgeber von Laura Koeth und Jeanna Fisher, wurde von Durata Therapeutics unter Vertrag, das Manuskript vorzubereiten. Publikationskosten für diesen Artikel wurden vom Labor Specialists, Inc. bezahlt

Die folgenden Verfahren Details werden für zusätzliche Überlegungen bei der Vorbereitung für Dalbavancin MHK-Bestimmung. Das Design des MIC Panel wird abhängig von der Anzahl von antimikrobiellen Mitteln zu prüfenden (das heißt., Dalbavancin allein oder mehrere Agenten) und die Bakterienspezies getestet werden kann. Die Dalbavancin Konzentrationen sollten die interpretative Haltepunkte für alle für mindestens eine QC-Stamm erwartet Bakterienarten getestet werden und den gesamten Bereich der Verdünnungen zu umfassen. Die antimikrobielle Verdünnungsreihe entweder in Zeilen oder Spalten, je nach Anzahl antimikrobieller Mittel und / oder isoliert / Platte und das Verfahren der Inokulation durchgeführt werden. Das Volumen des Pulvers und Dalbavancin Brühe berechnet werden sollte, um sicherzustellen, daß optimale Mengen produziert und Abfall ist gering. Für die in dieser Publikation verwendeten Beispiel werden die Umsätze auf Herstellung von zwei MIC-Panels basiert. Kation eingestellt Mueller-Hinton-Brühe sollte nach Mann vorbereitet und autoklavierbarsteller Anweisungen und Sterilität der Medien überprüft. MIC-Panels hergestellt und am selben Tag der Herstellung verwendet werden oder sie können mit entsprechenden Qualitätskontrollorganismen und der validierten Platten gefroren gelagert für die zukünftige Verwendung zu prüfen. Es ist wichtig, sterile Techniken in dem Verfahren zu verwenden. Es gibt keine strengen Kriterien für die Überprüfung der Inokulumkonzentration mit Koloniezahlen. Koloniezählungen kann zunächst für jede getestete und / oder in regelmäßigen Abständen, um den Verdünnungsschritt in Schritt 4.2 durchgeführt zu validieren Arten überprüft werden. Es ist wichtig, dass die Gültigkeit des 0,5 McFarland Standard wird auch routinemäßig mit E. geprüft coli ATCC 25922 mit einem Verfahren ähnlich wie in Schritt 4.5. Wenn die Ergebnisse nicht gleichwertig sind 1-2 x 10 8 KBE / ml, ein neuer 0,5-McFarland-Standard sollte erhalten werden. Wenn die Koloniezählungen von MIC Vertiefungen außerhalb des akzeptablen Bereichs (2-8 × 10 5 CFU / ml und MIC-Ergebnisse für die klinische Isolat (e) variieren von the erwarteten Normalverteilung (z. 0,03 bis 0,12 ug / ml für S. aureus) und / oder MIC-Ergebnisse für die Qualitätskontrolle Isolat (n) außerhalb des erwarteten Bereiche ist Validierungstests notwendig und Verfahren Änderung gerechtfertigt sein. Es wird vorgeschlagen, dass eine validierte 0,5 McFarland-Standard verwendet, um die Koloniezahl (n) zu wiederholen und wenn die Ergebnisse wieder außerhalb der erwarteten Ergebnisse sollte das Inokulum Verdünnung wie in Schritt 4.2 durchgeführt entsprechend angepasst werden, und die MIC wiederholt. Beachten Sie, dass eine Reinheitskontrolle ist notwendig, auch wenn eine Koloniezahl wird durchgeführt, weil die Koloniezahl Prozedur verwendet eine verdünnte Volumen, das nicht unbedingt niedrigere Konzentrationen von kontaminierenden Organismen erkennen kann. Für eine MIC-Test als gültig betrachtet werden, müssen akzeptablen Wachstum in der Wachstumskontrolle erfolgen. Für die meisten Bakterien, die gegen Dalbavancin getestet werden (dh., Staphylokokken, Streptokokken und Enterokokken, Wachstum wird als Schaltfläche (in der Regel&gt; 2 mm) und weniger fr gesehen werdenequently kann das Wachstum als Trübung in der gut angezeigt. Im Gegensatz zu einigen antimikrobiellen Mitteln, die zeigen können nachlaufende Wirkung wie Konzentrationen zu erhöhen, werden Dalbavancin Endpunkte in der Regel gut definiert. Es gibt verschiedene Betrachtungsvorrichtungen vorgesehen, um das Lesen microdilution Tests zu erleichtern, die verwendet werden, um Dalbavancin enthaltenden Platten, solange es keinen Kompromiss in der Fähigkeit, das Wachstum in den Vertiefungen zu erkennen gelesen werden kann. Die kritischen Schritte im Rahmen des Protokolls sind die Teile des Verfahrens, das zur Löslichkeit Dalbavancin und Zugabe von P80 verbunden sind verwandt. Wichtig ist, daß die maximale Konzentration des Dalbavancin verwendet nicht größer ist als 1,600 &amp; mgr; g / ml, dass DMSO als Lösungsmittel, bevor die Brühe Verdünnungen verwendet wird und daß Zwischenkonzentrationen werden in DMSO hergestellt, daß die Endkonzentration von DMSO in dem MIC Platte Vertiefungen nicht größer ist als 1%. DMSO ist hygroskopisch und daher der Einsatz von älteren Flaschen DMSO war consideratIonen hinsichtlich Dalbavancin Löslichkeit. Doch während ein kleiner BMD-Studie mit Qualitätskontrollstämme hat gezeigt, nicht auf eine wichtige Variable sein (siehe Ergebnisteil), ist es gute Praxis, um neue oder kürzlich eröffnete Flaschen DMSO zu verwenden. Es ist auch wichtig, dass P80 ist mit der Brühe in dem letzten Schritt des Arzneimittelverdünnung Herstellung zugesetzt und in einer Endkonzentration von 0,002% in der MIC gut. Die BMD-Verfahren, die hier verwendet Vorbereitung der MIC-Panels mit 50 ul / Vertiefung in Dalbavancin und P-80-Konzentrationen zweimal die endgültige Konzentration und Zugabe von Impfgut mit 50 ul / Vertiefung, so dass Endvolumen / Vertiefung 100 ul. Dieses Verfahren ermöglicht eine MIC Tafelformat für das Testen von sowohl S. hergestellt werden aureus und S. pneumoniae weil die lysiertem Pferdeblut kann das Inokulum hinzugefügt. Alternative Methoden zur Herstellung von MIC Platten mit 100 ul / Vertiefung unter Zusatz von bis zu 10 ul / Vertiefung in der beschriebenenCLSI und ISO-Verfahren. Die Dalbavancin anfällig Haltepunkt für S. aureus ist ≤0.12 ug / ml (FDA Packungsbeilage). Wie es in den letzten Überwachungs gezeigt, sind die Mehrzahl der Isolate Dalbavancin in Konzentrationen von 0,06 ug / ml 15 gehemmt. Mit einem anfälligen Haltepunkt in der Nähe des modalen MIC kann jede Variation MIC infolge Verfahren Unterschiede Suszeptibilität Raten auswirken. Da der BMD Verfahren für Dalbavancin enthält einige einzigartige Schritte (genauer gesagt, die Verwendung von DMSO in Vorbereitung der Lager und Zwischenwirkstoffverdünnungen und 0,002% P80 in der MIC gut, ist es unerlässlich, dass das Verfahren genau befolgt werden. Die S. aureus QC Organismus (ATCC 29213) mit einer sehr klaren Dalbavancin modalen MIC von 0,06 ug / ml, ist ein guter Indikator für die Verfahrensvariante und sollte routinemäßig verwendet, um die BMD Methode zu bestätigen. Wenn MIC Ergebnisse werden mit dem erwarteten Bereich von 0,03-0,12 g / ml, sind aber tendiert entweder an den niedrigen oder high Seite dieses Bereichs liegt, wird eine weitere Validierung der Methode gerechtfertigt. Die Zugabe von 0,002% P80 wird für alle relevanten grampositive Organismen empfohlen (staphylococcci, Enterokokken und Streptokokken.) Es ist jedoch bemerkenswert, dass es wurde gezeigt, dass Pferdeblut lysiert wirkt ähnlich wie P-80, bezogen auf seine Anti-Bindungs Fähigkeit und daß die Zugabe von P-80 bis + CAMHB LHB keinen zusätzlichen Effekt auf Dalbavancin Streptokokken MIC-Ergebnisse. Es gibt derzeit keine Plattendiffusionsverfahren zum Testen Dalbavancin und wegen der schlechten Korrelation von BMD und AD Ergebnisse, Empfindlichkeitsprüfung von Dalbavancin mit dem AD-Verfahren wird nicht empfohlen, 12, 14. Der BMD-Methode sollte für die Zukunft Einschätzung Dalbavancin Anfälligkeit verwendet werden und als Goldstandard für die Entwicklung der kommerziellen antimikrobielle Empfindlichkeitstests.

Dalbavancin ist ein halbsynthetisches lipoglycopeptide die von der FDA Mai 2014 für die Behandlung von akuten bakteriellen Haut- und Hautstruktur-Infektionen durch grampositive Organismen 1 verursacht genehmigt wurde. Das primäre Ziel der Detaillierung diese Methode in einer Video-Format ist es, klare Leitlinien zu den klinischen Labors und Wissenschaftler für die Prüfung und Berichterstattung über genaue und reproduzierbare Dalbavancin Anfälligkeit Ergebnisse zu liefern. Die Bestimmung eines antimikrobiellen Mittels MIC durch kommerzielle Verfahren routinemßig in klinischen Laboratorien zur Beurteilung der in-vitro-Aktivität des Agenten gegen pathogene Bakterien durchgeführt. Die hier beschriebene Methode ist die Bouillon-Mikroverdünnungsverfahren, wie durch CLSI und ISO 2,3,4 empfohlen. Seit Dalbavancin kommerziellen Anfälligkeit Verfahren sind derzeit nicht erhältlich (zum Zeitpunkt dieser Veröffentlichung) und Disk Diffusion und Agar-Verdünnungsverfahren sind derzeit nicht empfohlen foder Dalbavancin, sind Referenzbouillonverdünnungsverfahren die gegenwärtigen Möglichkeiten 12,14. Da diese Referenzmethode ist keine kommerzielle und FDA in vitro-Diagnoseverfahren, klinische Labors in den USA, die dieses Verfahren für die Patiententests verwenden müssen von regulatorischen Anforderungen für ein Labor entwickelten Tests (LDT) einzuhalten. Es wird erwartet, dass, wie die Dalbavancin Nutzung steigt, mehr Labors wird eine Notwendigkeit, diese Verbindung zu testen. Vancomycin Testen als Ersatz für die Bestimmung der Empfänglichkeit von S. Dalbavancin aureus wurde validiert 5. Jedoch kann Dalbavancin gegen Vancomycin Zwischen S. aktiv sein aureus (VISA) und daher kann Kliniker Dalbavancin MIC Ergebnisse verlangen. Zusätzlich kann MIC-Ergebnisse für andere Bakterienarten angefordert werden. Die FDA anfällig Haltepunkt für Dalbavancin gegen S. aureus wurde auf ≤0.12 ug / ml festgestellt. FDA zugeordnet nur susceptible Kategorie, da der Mangel an Daten über resistente Isolate. Die normalen MIC Verteilung unter den Wildtyp-S aureus-Isolaten ist zwischen 0,03 bis 0,12 ug / ml, mit einem klaren modalen MIC von 0,06 ug / ml. Eine leichte Veränderung der MIC Ergebnisse durch Verfahren Differenz, zusätzlich zu der inhärenten BMD Variation ± eine Verdünnung, die möglicherweise haben könnte erhebliche Auswirkungen auf die Anfälligkeit Raten. 6 Ähnlich wie bei anderen lipoglycopeptide Mittel, können Dalbavancin Empfindlichkeitsprüfung anspruchs als Folge sein der Löslichkeit und der relativ großen Grße des Moleküls und seine Bindungseigenschaften 7.8.9. Die hier beschriebenen Referenz BMD Verfahren umfasst zwei spezifische Schritte, die einzigartig für unlösliche Wirkstoffe und / oder lipoglycopeptide Mittel sind: (1) die Verwendung von DMSO zur Herstellung von Stammlösungen und (2) Zugabe von 0,002% P-80 in der endgültigen MIC Panel Verdünnungen. Das Ziel dieser Veröffentlichung ist die Video Klarheit in den Dalbavancin BMD Verfahren und Spezifika bereitzustellenlly konzentrieren sich auf diese wichtigen Schritte, um genaue und reproduzierbare MIC Ergebnisse zu gewährleisten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dalbavancin</td>
			<td>Metrics, Inc.</td>
			<td>Greenville, NC</td>
			<td>BI-397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>St. Louis, MO</td>
			<td>C5793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Adjusted Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td>212322</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysed horse blood</td>
			<td>Cleveland Scientific</td>
			<td>Bath, OH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dose-it peristaltic pump</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipet (Viaflo II)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipet (Matrix)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channelpPipets (Ovation 10 &#181;L - 100 &#181;L)</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>Brewster, NY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>Monroe, NC</td>
			<td>650161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x125mm disposable glass tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x17mm snap cap, polystyrene tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL centrifuge tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>Kaysville, UT</td>
			<td>C-3394-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilelLoops (1 uL &#38; 10 uL)</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>Lenexa, KA</td>
			<td>65-0001,65-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar + 5% sheep blood</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (ambient)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (5% CO2)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td>52817</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically

Antimikrobielle Empfindlichkeitstests (AST) ausgeführt, um die in vitro-Aktivität von Antibiotika gegen verschiedene Bakterien zu beurteilen. AST-Ergebnisse, die als minimale Hemmkonzentration (MHK), ausgedrückt werden, werden in der Forschung zur Entwicklung und Überwachung antimikrobielle Resistenzentwicklung und bei der klinischen Einstellung für die antimikrobielle Therapie Führung verwendet. Dalbavancin ist ein halbsynthetisches lipoglycopeptide antimikrobielle Mittel, die Mai 2014 von der Food and Drug Administration (FDA) für die Behandlung von akuten bakteriellen Haut- und Hautstruktur-Infektionen durch Gram-positive Organismen verursacht genehmigt wurde. Der Vorteil Dalbavancin über aktuelle Anti-Staphylokokken-Therapien ist die lange Halbwertszeit, die für die Dosierung einmal pro Woche erlaubt. Dalbavancin eine Aktivität gegen Staphylococcus aureus (einschließlich Methicillin-empfindlichen S. aureus [MSSA] und Methicillin-resistente S. aureus [MRSA]), Koagulase-negative Staphylokokken, <em&gt; Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus Gruppe, β-hämolytischen Streptokokken und Enterokokken Vancomycin empfindlich. Ähnlich wie bei anderen bisherigen lipoglycopeptide Mittel, Optimierung CLSI und ISO Brühe Empfindlichkeits-Testverfahren umfaßt die Verwendung von Dimethylsulfoxid (DMSO) als Lösungsmittel bei der Herstellung von Stammlösungen und Polysorbat 80 (P80), um die Haftung des Mittels an Kunststoff zu vermindern. Vor den klinischen Studien und in der Anfangsphase der Entwicklung Dalbavancin wurden Anfälligkeit Studien nicht mit der Verwendung von P-80 durchgeführt und die MIC-Ergebnisse tendenziell 2-4-fach höher und entsprechend höheren MIC Ergebnisse wurden mit dem Agar-Verdünnungs Suszeptibilität Verfahren erhalten. Dalbavancin wurde erstmals im CLSI-Bouillon-Mikroverdünnungsmethode Tische im Jahr 2005 aufgenommen und im Jahr 2006 geändert, um die Verwendung von DMSO und P-80 zu klären. Die Brühe microdilution (BMD) hier gezeigte Verfahren ist spezifisch für Dalbavancin und ist in Übereinstimmung mit den CLSI und ISO-Verfahren, mit Schritt-für-Schritt-Detail und focuns auf die kritischen Schritte hinzugefügt für Klarheit.

Standardisiert MIC Methoden sind, um die Resistenzentwicklung, ein wichtiges Ziel der verschiedenen antimikrobiellen Überwachungsprogramme überwachen notwendig. Dalbavancin MIC Ergebnisse für Isolate in Europa und USA im Zeitraum 2011-2013 gesammelt wurden &lt;0,25 ug / ml für 99,9% der S. aureus und 100% der Streptokokken (Tabelle 4). Um die Bedeutung der Verwendung von frischem (versiegelt) DMSO, dreifacher Prüfung von Dalbavancin BMD MICs für QC-Stämme S. bewerten aureus ATCC 29213 und E. faecalis ATCC 29212 und Dublettenprüfung für S. pneumoniae ATCC 49619 wurde unter Verwendung von (1) DMSO von versiegelten Ampullen, (2) DMSO aus einer 1 l-Flasche, die in dem Ablaufdatum war und zuvor für 2 Jahre und verwendet worden (3) ein Aliquot des DMSO aus dem gleichen 1 l Flasche (Probe 2), der erlaubt wurde, in einem offenen Becherglas für 72 Stunden vor der Verwendung zu sitzen. Dalbavancin MIC Ergebnisse mit Platten mit allen drei DMSO Proben hergestellt waren ähnlich und wnnerhalb die akzeptablen QC Bereiche (Tabelle 5). Der Verlust Dalbavancin Aktivität nach Exposition der Stammlösung auf Kunststoff und ohne die Zugabe von P-80 wurde gut dokumentiert. 7 In 2 weiteren Studien wurde die Zugabe von P-80 in den anfänglichen und mittleren Stammlösungen (Tabelle 6) und die Verwendung von Glas oder Kunststoffrohre für die Herstellung der anfänglichen und mittleren Stammlösungen (Tabelle 7) keine Auswirkung auf haben die Dalbavancin MIC Ergebnisse. Es gab auch keinen Einfluss auf Dalbavancin MIC Ergebnisse, wenn Polypropylen und Polystyrol-Platten von drei Herstellern wurden verwendet (Tabelle 7). Die Anwesenheit von lysiertem Pferdeblut in die Brühe Medien zur Prüfung von Streptokokken wurde gezeigt, dass ein oberflächenaktives Mittel-artige Aktivität, vergleichbar mit P-80 7, 8 haben. Die Dalbavancin Referenzmethode für Streptokokken nicht schließen sowohl P-80 und mit lysiertem Pferdeblut .Jedoch anders als Staphylokokken und Enterokokken Dalbavancin MIC-Ergebnisse für Streptokokken sind ähnlich (innerhalb +/- 1 Verdünnung) mit und ohne die Zugabe von P-80. Wie zuvor dargestellt worden und in Figur 1 gezeigt, Dalbavancin Agarverdünnung (AD) MICs sind typischerweise 2-8 mal höher im Vergleich zum derzeitigen BMD Bezugszeichen 12, 13, 14. Im Gegensatz zu BMD, die Zugabe von 0,002% P-80 nicht beeinflussen Dalbavancin AD MIC führt 12. <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028eq1.jpg" /> Gleichung 1: Beispiel für Dalbavancin Stammlösung Vorbereitung Vorbereitung Schritte für 25 ml von 800 ug / ml Dalbavancin Lösung.. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vergleich der Dalbavancin und Vancomycin BMD AD. Die Ergebnisse der Studie, die im Vergleich dalbavancin und Vancomycin BMD und AD MIC Ergebnisse für ausgewählte Gram-positive bakterielle Isolate. Durchschnittlich (A) Dalbavancin und (B) Vancomycin Broth Mikrodilution und Agar-Verdünnungs MIC Ergebnisse in pg / ml für 15 Staphylococcus aureus, 8 Koagulase negative Staphylokokken (CNS), 5 Enterococcus faecalis und 14 Streptokokken (Gruppen A, B und C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53028/53028fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> EIN </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL; 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> B </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> C </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> D </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> E </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td&gt; <td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> F </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> G </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> H </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> DAL </td><td colspan="2"> Dalbavancin </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td&gt; </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="12"> Konzentrationen sind in ug / ml nach 50 ul / Vertiefung angegeben Inokulation </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 MIC-Platte-Format. Die 96-Well-Plattenformat, die Position der Dalbavancin Verdünnungen und positiven Kontrollvertiefungen als Beispiel in diesem Video-Veröffentlichung verwendet <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Quelle Conc. (ug / ml) </td><td> Volume Quelle (ml) </td><td> Volumen DMSO (ml) </td><td> Zwischen Conc. in DMSO (ug / ml) </td><td> Volume Intermediate Conc. (ml) </td><td> Volumen CAMHB + 0,004% P80 * (ml) </td><td> 2X Conc. Nach dem 1: 100 Verdünnung in CAMHB (ug / ml) </td><td> Schlusssteuerung Conc. Nach der Inokulation (ug / ml) </td></tr><tr><td> 800 </td><td> 1.0 </td><td>1.0 </td><td> 400 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 4 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 200 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 15 </td><td> 100 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 3.5 </td><td> 50 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 25 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,25 </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 15 </td><td> 12,5 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,125 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 3.5 </td><td> 6.25 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0,5 &lt;/ td&gt; <td> 0,5 </td><td> 3.13 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0,5 </td><td> 15 </td><td> 15 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0,5 </td><td> 3.5 </td><td> 0.8 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,008 </td><td> 0,004 </td></tr><tr><td> 0.8 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,4 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,004 </td><td> 0,002 </td></tr><tr><td colspan="5"> Diese Tabelle wurde von CLSI M100-S25, Tabelle 8B 3 geändert worden </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Schema zur Herstellung von Verdünnungen von wasserunlöslichen Antimicrobial Agents in Broth Verdünnungen Empfindlichkeitsprüfung angewendet werden. Volumes von Dalbavancin Arbeitslösungen und Verdünnungsmittel zur Herstellung der endgültigen MICDalbavancin Lösungen von 0,002-2 ug / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Qualitätskontrollstamm </td><td> Erwartete Dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,008-0,03 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Erwartete Dalbavancin MIC Ergebnisse für die Qualitätskontrolle Stämme 3, 11. CLSI Ergebnisse der Qualitätskontrolle für die vorgeschlagenen Stämme zusammen mit klinischen Isolaten, um die richtige Methode geprüft werden, ob <img alt="Tabelle 4" src="/files/ftp_upload/53028/53028table4.jpg" /> Tabelle 4. Verteilung Dalbavancin MIC Ergebnisse (Anzahl an jedem MIC) aus den USA und Europa 2011-2013 Surveillance Study 15. Dalbavancin MIC Ergebnisse aus einer veröffentlichten Studie von neuen klinischen Isolate als Indikator der aktuellen Dalbavancin in vitro Aktivität. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup></colgroup><tbody><tr><td rowspan="2"> Isolieren # </td><td colspan="3"> Dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> DMSO 1 </td><td> DMSO 2 </td><td> DMSO 3 </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0,12 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 0,12 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td rowspan="2"><em&gt; S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 1 = Ungeöffnete Flamme versiegelt 10 ml Ampullen </td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO 2 = häufig geöffnet 1L Flasche </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 3 = häufig geöffnet 1L bottle - saß auf der Bank im unbedeckten Becherglas 72 Stunden </td></tr></tbody></table> Tabelle 5. Dalbavancin MIC Ergebnisse (ug / ml) unter Verwendung von DMSO Lizenz und Intermediate Verdünnungen Vorbereitung mit DMSO aus 3 Quellen. Ergebnisse einer Dalbavancin MIC Studie, die Wirkung der Verwendung von verschiedenen DMSO Lösungsmittel bei der Herstellung der Dalbavancin Lager und Zwischen Verdünnungen verglichen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Isolieren Anzahl </td><td rowspan="2"> Replizieren Anzahl </td><td colspan="2"> Dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> DALB w / P80 in DMSO </td><td> DALB W / O-P80 in DMSO </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> S. aureus klinischen DP80-002SA </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 700699 </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td>S. pyogenes klinischen: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-004PY </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-005PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-006PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-007PY </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-008PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> S. agalactiae klinischen: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-009AG </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,12 </td></tr><tr><td> DP80-010AG </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-011AG </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> DP80-012AG </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> S. dysgalactiae clinical DP80-013DY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae klinisch: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-014SP </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> DP80-015SP </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-016SP </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-017SP </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td></tr></tbody></table> Tabelle 6. Dalbavancin MIC Ergebnisse unter Verwendung von DMSO Lizenz und Intermediate Verdünnungen Vorbereitung mit und ohne 0,002% P-80. Ergebnisse einer Dalbavancin MIC Studie, die Wirkung der Zugabe von 0,002% P-80 auf Lager und Zwischenverdünnungen Dalbavancin verglichen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="3"> Isolieren </td><td rowspan="3"> Replizieren Anzahl </td&gt; <td colspan="4" rowspan="2"> Auf Verdünnungsröhrchen </td><td colspan="4"> Mikrotiterplatte (Kunststoff Art) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Poly-Propylen, Greiner </td><td colspan="3"> Polystyrol </td></tr><tr><td> Scheibe </td><td> Plastic </td><td> Kunststoff 1 Stunde </td><td> Kunststoff 1 Std / 1 Std Intermediate </td><td> Greiner </td><td> Corning </td><td> Nunc </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td&gt; 1 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td rowspan="2"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td colspan="10"> Glass = Anfangsbestand in der Glasflasche hergestellt, verwendet sofort auf Zwischen Konzentration machens in Kunststoffröhrchen, sofort verwendet werden, um Brühe Verdünnungen zu machen. </td></tr><tr><td colspan="10"> Plastic = Anfangsbestand in Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff hergestellt, sofort verwendet werden, um Zwischenkonzentrationen in Kunststoffröhrchen, sofort verwendet werden, um Brühe Verdünnungen zu machen. </td></tr><tr><td colspan="10"> Kunststoff 1 hr = Anfangsbestand in Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff hergestellt, lassen Sie sich auf der Bank für 1 h dann verwendet, um Zwischenkonzentrationen in Kunststoffröhrchen, sofort verwendet werden, um Konzentrationen in der Brühe zu machen. </td></tr><tr><td colspan="10"> Kunststoff 1 h / Mittelstufe 1 hr = Anfangsbestand in Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff hergestellt, lassen Sie sich auf der Bank für 1 h dann verwendet, um Zwischenkonzentrationen in Kunststoffrohren zu machen, lassen Sie sich auf der Bank für 1 h dann verwendet, um Konzentrationen in der Brühe zu machen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 7. Dalbavancin MIC Ergebnisse unter Verwendung von Lizenz Verdünnungen Herstellung in Kunststoff und Glas-Tubes und MIC-Platte Kunststoff-Typen. Ergebnisse ofa Dalbavancin MIC-Studie, die Wirkung der Verwendung von Kunststoff- oder Glasrohren bei der Herstellung der Stammlösungen und Effekt der Verwendung von verschiedenen Quellen und Arten von Kunststoff für Mikrotiterplatten verglichen.

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A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Eine Referenz Broth Mikrodilutionsverfahren für Dalbavancin<em&gt; In-vitro-</em&gt; Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien, die wachsen aerob

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

a-reference-broth-microdilution-method-for-dalbavancin-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

28.7K Aufrufe.  Laboratory Specialists, Inc. Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology. 

Serie: A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis-Komplexes für die First und Second Line Drugs von Bouillon Verdünnung in einem Mikrotiterplatten-Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...