This work was performed under the auspices of the U.S. Department of Energy by Lawrence Livermore National Laboratory under Contract DE-AC52-07NA27344, and partially supported by LLNL&#8217;s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) program, 14-LW-077. The authors thank Michael Wilson, Mark Stenglein and Joe DeRisi at the Univeristy of California, San Francisco for generously providing GGV and Boa cell samples. EJF acknowledges support from the LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS acknowledges support from the UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

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The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll stellt die System-Level-Integration von mikrofluidischen Vorrichtungen zur Makroskala Ausrüstung, automatisierte biologische Probe Verarbeitung durchzuführen. Die Modularität dieser Plattform ermöglicht es, anpassungsfähig an jede Durchflussvorrichtung sein, und als Beispiel wird der Fokus der dargestellten Protokoll auf die Charakterisierung und Optimierung der Leistung einer acoustofluidic Partikeltrennvorrichtung. Drei wesentliche Vorteile dieses Protokolls werden hervorgehoben: (i) Modularität und Span-zu-Welt Anbindung, (ii) robuste Charakterisierung der Geräteleistung, und (iii) die automatisierte Verarbeitung von genau dosierten Probenvolumina zur Partikelabscheidung. ich. Modularität und Span-zu-Welt Schnittstelle Wie in Abbildung 2 dargestellt, ist der Mikrofluid-Chip auf einem kundenspezifischen Steckbrett, leicht auf einen Mikroskoptisch für die direkte Beobachtung passen montiert. Das Steckbrett enthält # 6-40 UNF Gewindebohrungen auf einem 5 mm-Pitch-Gitter, enabling der Chip befestigt ist, und Fluidverbindungen vorgenommen werden. Die Fluidanschlüsse sind Rohre mit bearbeiteten Enden, PEEK, die Abdichtung gegen die Fluidik-Chip mit einem Gummi-Gesicht-Dichtung und einem Edelstahl-Halsband. Diese Schnittstelle Schema sorgt für eine einfache und schnelle Chip-Ersatzgerät Redesign, erfordern einige oder gar keine Änderungen an anderen Systemkomponenten, sofern Chip Fußabdrücke an das Netz-Format entsprechen. Beispielsweise haben wir diese Plattform mit mikrofluidischen Chips für Durchfluss-Elektrophorese thermische Zelllyse 29 schnellen Vermischung der Reagenzien für die chemische Synthese, und Einzelzellen-Abscheidung und die Abfrage benutzt. ich ich. Robuste Charakterisierung der Leistung der Vorrichtung Um die Leistung jeder Mikrofluidik-Trennvorrichtung zu optimieren, müssen ihren Betrieb zunächst gründlich charakterisiert werden. Das hier beschriebene System unterstützt die Entwicklung von schnellen und automatisierten Protokollen, dies zu tun. Zum spezifischen Blutzuckerwerle der akustischen Fokussierungseinrichtungen, der Fokussierungsqualität, Betriebsfrequenz, und die Position der fokussierten Teilchen in dem mikrofluidischen Kanal muss für jede einzelne Vorrichtung bestimmt werden. Diese Messungen erfordern fegt durch eine Reihe von piezokeramischen Antriebsfrequenzen, Spannungen und Durchflussraten, um die optimalen Parameterkombinationen für hochwertige Trennung zu identifizieren. Die dargestellte Protokoll automatisch variiert diese abstimmbare Parameter und nimmt den entsprechenden Daten- dh Fluoreszenzbilder von Teilchen in den Kanal strömt, die nachbearbeitet, um die erforderlichen Messungen der Partikelfokussierungsqualität, Frequenz und Position (3) zu erzeugen. Vollständige Charakterisierung der akustischen Leistung der Vorrichtung erfordert Wiederholung der Schritte 4.4 und 4.5, wie unter verschiedenen Versuchsbedingungen notwendig. Zum Beispiel ist der absolute Fokusposition eines Chips, indem Sie den Frequenz-Scan bei relativ niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten und hohe Spannung gefundens, um die vollständige Migration auf die Knotenstandort zu gewährleisten. Zusätzlich kann eine solche Frequenzabtastungen die Qualität der Vorrichtungsanordnung (bei Verwendung mit Polystyrolkügelchen bekannter Größe ausgeführt wird) zu beurteilen oder zu bestimmen, wie eine zuvor unbekannte Teilchensorte im System verhalten (nachdem ein Chip mit Perlen untersucht). Ein Chip mit einer guten Energietransfer von der Piezokeramik an den mikrofluidischen Kanal wird in engen Fokussierung bei hohen Flussraten (&gt; 1 ml / min) und Niederspannung (12-15 V pp) zur Folge haben, während diejenigen mit schlechten Energieübertragung werden nicht einmal zu konzentrieren bei niedrigen Strömungsgeschwindigkeiten (&lt;100 &amp; mgr; l / min) und hohen Spannungen (&gt; 20 V pp). Wir haben gefunden, dass ein enger Kontakt zwischen der Mikrofluid-Chip und der Piezokeramik ist kritisch für eine effiziente Energieübertragung in die Flüssigkeit. Weitere Untersuchungen der optimalen Verfahren zum Verbinden der Mikrofluid-Chip und der Piezokeramik wird zuverlässige Produktion von High-Performance-Geräte ermöglichen. Schließlich eine vollständigeBild der Betrieb eines acoustophoretic Gerätes kann durch die Kombination der bildbasierten Frequenz-Scan Messungen der Stufe 4 (und Abbildung 3) mit Partikelzählungen von der SPO und LPO als Funktionen der relevanten Betriebsparameter gesammelt, erhalten werden kann, von mit Mikrokügelchen durchgeführt Trennversuche wird, wie in Schritt 5. Wie in Figur 6 gezeigt ist, beschrieben, kann eine solche Reihe von automatisierten Experimente schnellen Charakterisierung Leistung und Abstimmbarkeit eines einzelnen Gerätes, Informieren des Benutzers über die optimale Parameterraum, die Vorrichtung zur Partikelabscheidung zu betreiben. iii. Automatisiertes Kleinprobenaufbereitung zur Partikelabscheidung Für eine erfolgreiche und genaue Mikrofluid-Chip-basierte Probenverarbeitung, ist es wichtig, sicher und präzise meter, Last, zu liefern, zu sammeln und die Volumina der Flüssigkeit, während sie passieren. Diese Genauigkeit ist besonders wichtig, wenn das Probenvolumen klein ist(~ 0,1-1 ml), die in der klinischen oder Forschungslabor Einstellungen gemeinsam ist. 30 Präzise Probenhandling ist eine Herausforderung in traditionellen mikrofluidischen Experimente, die manuelle Rücknahme der Probe in einer Spritze und Infusion in einem Gerät ohne Feedback der bei der Probe zu beschäftigen wurde abgetrennt und, wenn es gesammelt werden sollten. Das vorgestellte Protokoll beschäftigt automatisierte Probenspule Laden und Abgeben gekoppelt mit Echtzeit-Feedback von Durchflusssensoren, um reproduzierbare Trennungen von kleinen Probenvolumina zu ermöglichen. Abbildung 5 zeigt die Strömungsprofile, gemessen an der SPO und LPO aus einer typischen Trenn Experiment. Zuerst führt Puffer von mindestens 35 &amp; mgr; l geladen, um eine stabile Strömung zu gewährleisten, bevor die Probe das akustische Chip erreicht. Probenvolumina von weniger als 100 &amp; mgr; l werden für diese Systemkonfiguration zu empfehlen, da die Probenverdünnung aufgrund der führenden Puffer zu groß wird. Ein Stecker der Luft zu Beginn des th verwendete Injektion vor der Vorderpuffer, um die Probe Stecker aus der folgenden Beschreibung wird verhindert Vermischung und Verdünnung der Probe und als Indikator für die Durchflusssensoren dienen Flüssigkeit zu trennen. Nach einer ersten transienten als Flüssigkeit beginnt, durch das System bewegen, scharf spitze Signale in beiden Filialen zeigen den Durchgang der ersten Luftblase. Diese Transienten werden durch einen langen Zeitraum stabile Strömung folgen, während die Probe fließt durch das System dann eine andere Spitze, wenn die zweite Luftblase durchläuft und schließlich eine eventuelle Verringerung der Strömungsrate auf Null, nachdem die Spritzenpumpe stoppt. Der Durchgang der Luft-Stecker durch die Durchflusssensoren wird als Triggerpunkte verwendet werden, um die Ventile zu schalten zum Starten und Stoppen Probensammlung und minimiert so verlorenen Probe und Verdünnung durch nicht-Probenflüssigkeitsvolumina. Closed-Loop-Dosierung von Probenvolumina verarbeitet beseitigt die Notwendigkeit, vor dem Beginn des Experiments jedesmal, wenn die Eingangsabtastung geändert umprogrammieren diese Werte. Diese Funktion istbesonders wichtig, wenn Probenvolumen ist begrenzt, beispielsweise im Fall von vielen klinischen Proben. Echtzeit-Durchflussüberwachung hilft auch bei der Fehlersuche; eine schlechte Lauf (beispielsweise eine Verstopfung bildet in einem der Ausgänge) ist unmittelbar ersichtlich aus den resultierenden Strömungsprofile, wie in 5b. Um die Flexibilität und Effizienz der acoustofluidic Trennung unter Verwendung des dargestellten Systemarchitektur gereinigt DENV und GGV Virusstämme zu demonstrieren, wurden in Zellvorräte durch den mikrofluidischen Chip versetzt, und durch die Verarbeitung getrennt. 7a zeigt, daß Raji-Zellen wurden gut getrennt von Viren, wie 97 % der Raji-Zellen Verlassen des Chips wurde gefunden, dass in der LPO werden, wodurch eine hoch angereicherte Probe DENV im SPO verlassen. Im Vergleich dazu war die Effizienz der DENV Trennung unteren, mit 70% der DENV Verlassen der Chip in der SPO gefunden. Dies kann zu einer leichten Konvektionsmischung durch die Windungen des separati induzierte zurückzuführenauf dem Kanal, aber eher zu einigen DENV Partikel migrieren mit den Raji-Zellen in das LPO. Zellen seitlich Migration über Stromlinien ziehen etwas Flüssigkeit mit ihnen, auch bei niedrigen Reynolds-Zahl. Durch diesen Mechanismus sowie unspezifische Oberflächenadsorption übertragen Viruspartikeln in das LPO. Dennoch ist das hoch angereicherte Probe DENV im SPO ein bedeutender Vorteil, beispielsweise wenn die de novo-Sequenzierung wird verwendet, um zu erkennen und zu identifizieren Viren. 7B zeigt, daß in einer Testreihe werden nur etwa 70% der Zellen Boa Verlassen des Chips wurden passgenau in der LPO gefunden, verglichen mit fast 100% Abscheidegrad für Raji-Zellen. Der Unterschied in der Trennleistung zwischen den beiden Zelltypen die auf eine kleinere mittlere Größe oder eine geringere Dichte an Boa Zellen im Vergleich zu Raji-Zellen, was daher zu kleineren akustische Kräfte. Um zu bestätigen oder zu widerlegen diese Vermutungen, die Größe, Dichte und Morphologie der BoaZellen in Suspension (das normalerweise wachsen haft) Boa Zellen muß genau gemessen werden, ein Aufwand für weitere Untersuchungen. In den gleichen Experimenten, ähnlich wie bei den Versuchen mit DENV, der Hauptteil der gewonnenen GGV verlassen vom SPO, was eine Anreicherung der Virusfraktion. Die dargestellten Daten unterstreichen die inhärenten Herausforderungen der Technik breit anwendbar Plattformen für die Verarbeitung einer Vielzahl von biologischen Proben. Wichtig ist, dass die biologischen Interaktionen beginnen, eine ebenso große Rolle wie die physikalischen und mechanischen Effekte spielen. Allerdings sind diese Vorversuche auch die Kraft und die Verheißung der Verwendung dieser Systemarchitektur für die Probenverarbeitung in der klinischen und Forschungsanwendungen zu demonstrieren. Als robust, gut charakterisiertes System entwickelt, bietet diese Plattform die Möglichkeit, Antworten auf neue wissenschaftliche Fragen zu suchen.

Probentrennung und Fraktionierung ist eine der vielversprechendsten Anwendungsgebiete für Mikrofluidtechnik. Eine solche Probenhandhabungsschritte sind integrale für effektive klinische Diagnose, Therapie Entwicklung, biosurveillance Bemühungen und Fortschritte in der Life-Science-Forschung und Technologie. Eine Myriade Mikrofluidik-Trenn Strategien für Fluid suspendierten Partikeln und Kolloiden, sowie für chemische und biologische Spezies nachgewiesen worden; mehr Bewertungen bieten Übersichten über die jüngsten Fortschritte und Entwicklungen in diesen Bereichen 1-9. Obwohl viele dieser mikrofluidische Trenntechnologien (im Folgenden als &quot;Core-Geräte&quot; genannt) wurden ausführlich charakterisiert, haben einige Berichte die Probentrennproblem auf Systemebene betrachtet. Die Core-Geräte sind in der Regel einzelne Zentimeter-Skala-Chips, eine Schnittstelle zu Fluorpolymer-Schläuche, mit durch eine Verschiebung oder Druckpumpe geförderten Flüssigkeit.Und doch, wenn das Versprechen der Mikrofluidik - einschließlich der erhöhten Automatisierung, Zuverlässigkeit und Verringerung der Probenmengen - ist, Wirklichkeit zu werden, zumindest eine gleichwertige Anstrengungen unternommen werden müssen, um das Design einer vollständigen Trennung System, in das die Kernvorrichtung integriert gewidmet werden . Darüber hinaus ist eine große Herausforderung für die Mikrofluidik-Ansätze zur Lebenderkennung ist das Makro bis Mikro-Schnittstelle. Dies bezieht sich nicht nur auf die physische &quot;Welt-to-chip&quot; Verbindungen einer mikrofluidischen Vorrichtung zu makroskopischen Komponenten und der Fehlanpassung zwischen typischen klinischen oder analytischen Probenvolumina (~ 0,1-10 ml) und das Innenvolumen des Mikrofluidik-Chips (~ 0,01-10 &amp; mgr; l), sondern auch auf die statistischen Stichprobenbegrenzungen aus Überbrückung dieser Größenskalen. Diese Probleme beitragen, die Wahrnehmung, dass die Probe vor der Verarbeitung und Zubereitung sind die &quot;schwache Glied&quot; der Biodetektion. 10 Die in dieser Arbeit beschriebenen ta-Plattformkes wichtige Schritte in Richtung der Bewältigung dieser Herausforderungen. Einen Ansicht auf Systemebene, dieses Protokoll beschreibt die sichere Verarbeitung von genau dosierte analytischen Maßstab Volumina (Bereich von 0,15 bis 1,5 ml) auf ~ 10 min Zeitskalen. Dies ist eine &quot;Ein-Knopf&quot; Operation: Sobald die Quelle Fläschchen mit der Probe und Ziel-Fläschchen für Fraktionssammlung in das System gelegt, den Befehl &quot;Ausführen&quot; startet den Vorgang, und alle Schritte sind computergesteuert. Am Ende eines Durchlaufs können die Sammelfläschchen aus dem System für nachgeschaltete Analyse der getrennten Fraktionen entfernt werden. Der Core-Gerät in diesem System ist ein acoustophoresis Chip, der Säugetierzellgroße (5-20 &amp; mgr; m) Partikel aus der Probe extrahiert. Acoustophoretic Trennung wird hier gewählt, vor allem, weil es Hochdurchsatz (bis zu 100 s von &amp; mgr; l / min), markierungsfreie und berührungslose und bietet damit Vorteile bei der Trennung von lebensfähigen Viruses von Zellen, die nur wenige andere mikrofluidische Techniken entsprechen. Die Physik der Schallpartikel Fokussierung wurden ausführlich beschrieben ist, 11 bis 13 und sind nicht der Schwerpunkt dieses Protokoll, sondern eine kurze Zusammenfassung der zugrunde liegenden Konzepte folgendermaßen vor, um das Verständnis der Anwendung auf Mikrofluidik-Trenn unterstützen. Ultraschall-Stehwellen in Resonanz in flüssigkeitsgefüllten Mikrokanälen zu erzeugen Druckfelder, die zu Kräften, die Partikel in Richtung Knoten des Niederdruck-Antrieb zu geben. Die Kraftgröße ist abhängig von Volumen des Teilchens, und 14 als solche auf einem akustischen Kontrastfaktor von den relativen Dichten und Kompressibilität des Teilchens abgeleitet und der Suspensionsflüssigkeit., Akustische Fokussierung ist ideal gelegen, um die Trennung von Zell-Größe (~ 15.7 geeignet mgr; m) von Virus-Größe (~ 50-200 nm) Teilchen. Die größeren Partikel wandern zu einem Druck-Knoten; da jedoch die Kraftgröße sehr klein ist fürPartikel, die kleiner als 2-3 um, diese kleinen Teilchen oder gelösten Spezies kaum bewegen. Unsere spezielle Implementierung akustische Trennung, wie zuvor beschrieben, 15 enthält eine dünne Wand, um den Fluidkanal zu unterteilen und ermöglicht abstimmbaren asymmetrische Anordnung der Fokussierungsposition. Dies erhöht die Flexibilität im Gerätedesign und die Leistungsvorteile, einschließlich der erhöhten Trennqualität und Geschwindigkeit-vollständig an anderer Stelle beschrieben. 16,17 Allerdings ist ein großer Vorteil der in dieser Arbeit beschriebenen System-Level-Design-Ansatz, dass sie anpassungsfähig zu einer großen Vielfalt von Mikrofluid-Core-Geräte ist. Beispielsweise können die meisten anderen Durchfluß-Trennungen, einschließlich Trägheits- Strömungsfeld-Fraktionierung, deterministische seitliche Verschiebung (DLD), und verschiedene Arten von elektrokinetische Vorrichtungen ohne weiteres eingebaut werden, mit entsprechenden Anpassungen vorgenommen, um Änderungen der Einlass / Auslass-Konfigurationskonto , Fließraten,und Probenvolumina. Geräte mit verschiedenen Arten von On-Chip-Bereichen (elektrisch, magnetisch) oder Gradienten (thermische, chemische) können zusätzliche Verbindungen mit dem Chip oder die Integration zusätzlicher Hardware, die diese Plattform bietet Platz benötigen. Dieses Protokoll sieht die erforderlich ist, um eine mikrofluidische Trenneinrichtung zu gestalten, und Silizium-Glas-Chips in vielen Mikrofertigungseinrichtungen herzustellen durch tiefe reaktive Ionenätzen (DRIE, ein Plasma-Ätzprozess zur Verfügung, die alternierenden Zyklen von Ätzen und Passivieren tief zu erreichen nutzt Schritte Funktionen mit vertikalen Seitenwänden 18). Als nächstes beschreiben wir die Charakterisierung der acoustofluidic Einrichtung, um die optimalen Betriebsparameter für die Trennung bestimmen, und schließlich Detail den vollintegrierten Trennsystem und das Verfahren für die Verarbeitung von biologischen Proben. Typische Bauteilcharakterisierung Ergebnisse und Probenverarbeitung Daten werden dann vorgestellt und diskutiert und die wichtigsten Vorteile dieser approach markiert sind, einschließlich Modularität, Robustheit, Präzision und Automation.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Polished Silicon Wafer</td>
			<td>Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td>100 mm &#60;100&#62;&#160; prime wafer</td>
			<td>1-20 ohm-cm, 495 +/- 25&#181;m Double-side polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wafer</td>
			<td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td>
			<td>100mmx0.5mm Boro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 1518</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 1518</td>
			<td>Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 4620</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 4620</td>
			<td>Photoresist to define fluidic and via mask patterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE plasma etcher</td>
			<td>STPS, Newport, NP, United Kingdom</td>
			<td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Bonder</td>
			<td>Electronic Visions Group,&#160; St.Florian am Inn, Austria</td>
			<td>EVG 501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicing saw</td>
			<td>Kulicke &#38; Soffa Industries, Singapore</td>
			<td>K&#38;S 982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy kit</td>
			<td>Epoxy Technology, Billerica, MA, USA</td>
			<td>EPO-TEK 301</td>
			<td>Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PZT piezoceramic&#160;</td>
			<td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td>
			<td>PSI-5A4E</td>
			<td>37.5 &#215; 10 &#215; 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 AWG Kynar-insulated solid wire</td>
			<td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td>
			<td>UL1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part silver epoxy&#160;</td>
			<td>MG Chemicals, Surrey, BC, Canada</td>
			<td>8331</td>
			<td>Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-edit</td>
			<td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td>
			<td>Ledit v15.1 64-bit</td>
			<td>CAD software for mask layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>PHD ULTRA Series, 703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringes</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer to Threaded port adapter</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-659</td>
			<td>Connects syringe to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-623</td>
			<td>Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.&#160; Can also use webbed&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160; 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-202</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; OD Fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1912L</td>
			<td>Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.&#160; Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03&#34; ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ID fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1476-20</td>
			<td>Used for Flow restrictors: 0.006&#34; ID, 1/16&#34; OD FEP&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connects from chip to fluoropolymer tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling fan</td>
			<td>Multicomp, Leeds, England</td>
			<td>MC19663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF amplifier</td>
			<td>ENI, Rochester, NY</td>
			<td>325 LA</td>
			<td>Must be able to amplify signals from &#60;1V&#160; in the range of 1-2MHz to 25 Vpp to the piezo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucscon, AZ, USA</td>
			<td>CoolSnap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axiovert S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Tech, VT, USA</td>
			<td>SP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, 10x</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>ACHROPLAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, OR, USA</td>
			<td>TDS3014B</td>
			<td>To monitor voltage output by RF amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks, Natick, MA, USA</td>
			<td>R2014a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW</td>
			<td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td>
			<td>SITK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 &#181;m Beads</td>
			<td>Bangs Laboratory, IN, USA</td>
			<td>FS06F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Additional materials required for Step 5: Automated Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiport valves</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>C25Z-3180EUHA</td>
			<td>In the current configuration 4 valves are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensors</td>
			<td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td>
			<td>SLI-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoropolymer tubing, .01 and .03&#34; ID</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1902L and 1912L</td>
			<td>High purity PFA preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160;</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZN1PK-10</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and valves.&#160; Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZGF1PK-10</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and valves.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td>LabVIEW Professional Development system</td>
			<td>Laboratory Automation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Teknova, Hollister, CA, USA</td>
			<td>P0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raji Cells</td>
			<td>ATTC, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CCL86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boa Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DENV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Jose Pena at LLNL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter Z2</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td>Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td>
			<td>0267151B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for precision small-volume sample processing and its use to size separate biological particles with an acoustic microdevice

Ein großer Vorteil der mikrofluidischen Systemen ist die Fähigkeit, kleine Probenvolumina zu manipulieren, damit Reagenz Abfälle reduzieren und die Erhaltung wertvollen Probe. Allerdings ist eine robuste Probenmanipulation zu erzielen es notwendig, die Geräteintegration mit dem Makroumfeld anzugehen. Wiederholbare, sensible Partikelabscheidung mit mikrofluidischen Systemen zu realisieren, stellt dieses Protokoll eine komplette automatisierte und integrierte mikrofluidische Plattform, die präzise Verarbeitung von 0,15 bis 1,5 ml Proben unter Verwendung von mikrofluidischen Bauteilen ermöglicht. Wichtige Aspekte dieses Systems sind modulare Geräte Layout und robuste Vorrichtungen was zu zuverlässigen und flexiblen Welt, um Verbindungen Chip und vollautomatische Fluid Handling, die Closed-Loop-Probensammlung, System Reinigung und Grundierung Schritte zur wiederholbaren Betrieb zu gewährleisten erreicht. Unterschiedliche Mikrofluidvorrichtungen können austauschbar mit dieser Architektur verwendet werden. Hier übernehmen wir eine acoustofluidic Gerät, Detail ihrer dadurch gekenn¬ zeichnetation, Performance-Optimierung, und zeigen ihre Verwendung für Größe-Trennung von biologischen Proben. Durch die Verwendung von Echtzeit-Feedback während der Trennung Experimenten wird Probensammlung optimiert, um zu erhalten und zu konzentrieren Probe. Obwohl die Integration von mehreren Geräten erfordern, Vorteile dieser Architektur umfassen die Fähigkeit, unbekannte Proben ohne zusätzliche Systemoptimierung, einfache Geräteaustausch und exakte, robuste Probenverarbeitung verarbeiten.

Schlüsselmerkmale des akustischen mikrofluidischen Vorrichtungskonstruktion sind in Abbildung 1 15 markiert ist, und an anderer Stelle beschrieben ist. Kurz gesagt, zwei Fluidströme Strömungsseite-an-Seite in einen Trennkanal, von einem parallelen Bypasskanal von einer dünnen Siliziumwand getrennt. Da die primäre Strahlungskraft Magnitudenskalen mit Partikelvolumen wandern große Partikel aus der Mischprobe Eingangsstroms in Richtung auf die Schalldruckknoten in den benachbarten Rückgewinnungsfluidstrom entfernt, während die kleinen Teilchen in der Ausgangsstrom (1B, C) ​​zu bleiben. Die unterteilten Zweikanal-Architektur verbessert Partikeltrennung 17 und ermöglicht die Einstellung der Knotenposition durch die Verwendung unterschiedlicher Bypasskanal Flüssigkeiten. 16 Die fluidischen Steckbrett und Armaturen bietet eine robuste Plattform für die Welt, um Verbindungen Chip und der modulare Aufbau ermöglicht einen schnellen Wechsel zwischen fluidischen Chips (Abbildung 2). Dies cONFIGURATION ermöglicht ebenfalls reversible Fluidverbindungen, die Dichtung bis zu 1000 psi, um schnell und zuverlässig (2B, E) hergestellt werden. Die Resonanzfrequenz f res eines Chips mit einfachen 1D analytischen Berechnungen geschätzt werden (siehe Schritt 1.1.1). Aus einer vollständigeren 2D Finite-Elemente-Modells der Vorrichtung im Querschnitt, 16 die erwartete Brennpunktposition für 2-Knoten-Resonanz 225 um von der Wand und der erwarteten Frequenz 1,68 MHz. Jedoch kann f res reale Geräte von ± 100 kHz variieren, abhängig von der Betriebstemperatur und Kopplung der Längs- und Querresonanzen. Deshalb wird nach Gerätemontage, f res muss empirisch relevanten Flussraten und Piezo-Antriebsspannungen überprüft werden, wie in Schritt 4 des Protokolls beschrieben. 3 zeigt repräsentative Frequenz-Scans bei 200 &amp; mgr; l / min aufgenommen,<html> mit Wasser in den Haupt- und Bypasskanäle und 20 V pp zugeführt, um das piezo. Beim Koppeln zwischen dem piezo und Mikrofluidik-Vorrichtung gut ist, wird Partikel dicht bei der Resonanzfrequenz zu konzentrieren, was zu einem klaren Peak in der Fluoreszenzintensität und Migration auf die erwartete Brennpunktposition (3A). Im Gegensatz dazu, wenn es schlechte Kopplung Teilchen nicht gut konzentrieren, und die Frequenz-Scan-Ergebnisse ähnlich auf 3B werden. Bei derartigen Vorrichtungen muss der Piezo-Wandler erneut montiert werden kann, wenn eine reversible Klebstoff verwendet wurde; Ansonsten ist diese Vorrichtung ungeeignet, wenn hochwertige Fokussierung oder schnelle Strömung kritisch für die gewünschte Anwendung geeignet sind. Die Daten in Abbildung 3 informiert die Wahl der Betriebsfrequenz für nachfolgende Experimente und die Spannungs- und Strombereich für eine effiziente Partikel Trennung zur Verfügung. Dateien / ftp_upload / 53.051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Automatisierte Probenverarbeitung. (A) Schematische Darstellung der Probe in der Probenspule geladen. (B) Repräsentative Strömungsprofil für eine erfolgreiche Trennung Experiment. (C) Durchflussprofil von einer Trennung führen, während der der SPO Auslass an etwa 220 sec verstopft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Nach dem Identifizieren Chips, die wirksam Separatoren sind, werden sie in der in Figur 4 dargestellten Systems integriert. Gesamtsystem Hubvolumen durch Verwendung Rohr mit 0,01 &quot;Innendurchmesser entlang der Hauptströmungspfad minimiert (blaue Linie). 5A zeigt das Make-up einer typischen Probe Stecker durch das System infundiert. Eine kleine Menge von &quot;führende Puffer&quot; (~ 35 &amp; mgr; l) ist erforderlich, um Precede die Probe in dem Fluss zu Stromschwankungen zu beseitigen, während die Probe durch die Trenn Chip bewegt. 5B zeigt Flussdaten von einer erfolgreichen automatischen akustische Trennung Experiment ergibt. Hauptmerkmale einer erfolgreichen Lauf umfassen: (1) ein vorübergehender Anstieg der Strömungsgeschwindigkeit sowohl in der LPO und SPO als Druck aufbaut und Flüssigkeit beginnt, durch das System fließen, (2) eine scharfe Spitze, die den Durchgang einer Luftblase (die Einschub zeigt ein erweitertes Profil einer einzelnen Blase), die die SPÖ vor dem LPO erreichen sollte aufgrund der ungleichen Fluss aus den beiden Auslässen, (3) stabile Strömung durch beide Auslässe zwischen den beiden Luftblasen wie die Probe bewegt sich durch das System, und (4) eine stufenweise Verringerung der Fließgeschwindigkeit in beiden Auslässen, nachdem die volle Probenvolumen wird dem System zugeführt. Problematisch Läufe von Strömungsprofilen ähnlich 5C, wo es scheint, dass die SPO wurde nach etwa 220 Sekunden verstopft Abbildung sofort ersichtlich. In thi<html> s Fall wird ein Reinigungsverfahren ähnlich wie in Schritt 5.3 beschrieben ausgeführt werden soll, um den Kanal zu reinigen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> Abbildung 6. Vorrichtung Abstimmbarkeit: Teilchengröße und Spannungseffekte. Prozent Polystyrol-Mikrokügelchen in der LPO extrahiert, hängt von der Partikelgröße und Spannung an das piezokeramische geliefert. Jede Zeile entspricht einer anderen Betriebsspannung bei der Resonanzfrequenz, bestimmt, wie in Schritt 4. Gesamtdurchsatz durch die Vorrichtung beschrieben wird, ist 200 &amp; mgr; l / min, mit der angelegten Antriebs Frequenzen zwischen 1,62 und 1,64 MHz. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von mindestens drei getrennten Experimenten. Reproduziert und mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry aus http://pubs.rsc.org / en / Content / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j modifiziert.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Figur 6 zeigt die zusammenTrennErgebnisse unter Verwendung verschiedener Polystyrolpartikelgrößen und Piezotreiberspannungen, die die Betriebsparameter für eine wirksame Trennung notwendig zu demonstrieren. Im allgemeinen werden höhere Spannungen (dh mehr akustische Kräfte) erforderlich, um kleinere Teilchen zu extrahieren, wie erwartet. Antriebsspannungen kann nicht unbegrenzt erhöht werden, jedoch aufgrund der größeren Wärmeableitung und zunehmender Wirkung von akustischen Streaming. 13 Das Grundstück dient als allgemeine Richtlinie zur Partikelabscheidung-Partikelgrößen, die deutlich unterschiedliche Recovery zu einem bestimmten Steuerspannung (zB 10- zeigen und 2-um-Teilchen bei 8,8 V pp) wird gut trennen. Allgemeiner Partikelpopulationen mit einem großen Grßenunterschied wie Viren (~ 100 nm) und Zellen (~ 10 &amp; mgr; m) kann schnell und wirksam getrennt werden, wie auch Zellen diffErent Größen (beispielsweise 6-8 &amp; mgr; m scheibenförmigen Erythrozyten und 8-15 &amp; mgr; m Leukozyten). Die erforderlich ist, um mit anderen Zelltypen funktionieren spezifischen Bedingungen müssen empirisch bestimmt werden, da die Zellform, Dichte und Kompressibilität auswirken seiner akustischen Kontrast zusätzlich zu Zellgröße. Zu diesem Zweck sind die Verfahren in Schritt 4 zur Bestimmung verwendbaren Trennbedingungen für jede neue Zelle oder Partikeltyp und nicht nur für die Beurteilung der Qualität einer bestimmten acoustophoresis Gerät. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> Abbildung 7. Trennleistung der Handy-Virus dotierter Proben. Die Trennung resultiert aus (A) Raji-Zellen mit Dengue-Virus (DENV) und (B) Raji-Zellen und Boa Nierenzellen mit Golden Gate Virus (GGV) versetzt versetzt. Prozentsätze werden gesammelt als die Fraktion von Viren oder Zellen zum Beenden eines bestimmten definiertenAuslass im Vergleich zu der Gesamtmenge Verlassen des Chips. Die Fehlerbalken für (A) sind die Standardabweichung von 3 Versuchen, während die Proben (B) wurden nur einmal wegen der geringen Mengen verarbeitet. 1x PBS wurde als Probenpuffer und Wiederherstellungsflüssigkeit in den Bypass-Kanal für alle Experimente verwendet wird, mit Wasser. Chip-Betriebsfrequenzen lagen zwischen 1,60 und 1,64 MHz, mit Antriebsspannungen zwischen 16 und 20 V pp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Um die Nützlichkeit dieser Plattform für biologische Partikeltrennung zu demonstrieren, haben wir zum ersten Mal verwendet es, um gut charakterisierte biologische Proben zu verarbeiten: menschliche Raji-Zellen (10 5 Zellen / ml, mittlerer Durchmesser 8-10 &amp; mgr; m 25), versetzt mit Dengue-Virus (DENV, 10 5 pfu / ml, ungefähren Durchmesser 50 nm 26). Abbildung 7A zeigt den Prozentsatz an Raji Zellen und DENV sowohl im SPO LPO gesammelt (definiert als Anteil der jede Teilchenart aus jedem Auslass im Vergleich zu der Gesamtmenge von jedem von dem Chip gesammelt Teilchen gesammelt). Das Experiment wurde dreifach wiederholt, und Raji-Zellen wurden unter Verwendung eines Coulter-Zählers quantifiziert, während DENV wurde unter Verwendung einer Umkehrtranskriptions quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) quantifiziert. Als nächstes wurde die Leistungsfähigkeit des Systems in einem Szenario, die realistischer für die Verarbeitung von klinischen Proben, in denen die exakte physikalische Eigenschaften der Partikel kann unbekannt sein wird geprüft, und die verfügbaren Probenmengen geringer sind. Hier untersuchten wir die Trennung des kürzlich identifizierten golden gate-Virus (GGV), eine Schlange Erreger infizieren Boa constrictor Nierenzellen. 27 Die Größe der GGV Viruspartikel noch nicht gemessen worden, aber da GGV gehört zur Familie Arenaviridae, es wahrscheinlich von einemähnlicher Größe zwischen 100 und 150 nm. 28. Wir verarbeiteten Proben mit GGV in Raji menschlichen Zellen (keine Infektion Ziel für das virus) und boa Nierenzellen (Infektion Ziel GGV ungefähren Größe 10 Spike (10 4 pfu / ml) &amp; mgr; m 27), wobei beide Zellarten bei 10 4 Zellen / ml. Da diese Proben in geringen Mengen waren, sind Trennergebnisse aus nur einer Versuchsreihe in dieser Arbeit berichtet. 7B zeigt den Prozentsatz der Raji-Zellen, Boa Zellen und GGV von der SPO und LPO gesammelt. Zellen wurden in diesen Experimenten durch Zählen auf einem Hämozytometer quantifiziert und Viren wurden durch RT-qPCR quantifiziert.

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A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K Aufrufe.  Lawrence Livermore National Laboratory. This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15–1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Serie: A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice