Diese Arbeit wurde durch den Staat Florida zu Bankhead-Coley Teams Wissenschaft Grant (2BT03), den National Institutes of Health / National Cancer Institute (1R21CA164322-01) und Moffitt Cancer Center-Team Wissenschaft Grants finanziert. Diese Arbeit wurde teilweise bereits von der Translational Research Core Facility am H. Lee Moffitt Cancer Center &amp; Research Institute, einem NCI Bezeichnung Comprehensive Cancer Center (P30-CA076292) unterstützt. Zugang zu Primärzellen möglich durch die Gesamt Cancer Care Protokoll am Moffitt Cancer Center gemacht wurde.

<ol>
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The authors have no conflict of interest to disclose.

Zusammenfassend, es ist eine leistungsfähige und hohem Durchsatz Methode Chemosensitivität von primären Myelomzellen und ex vivo Pharmakodynamik von Medikamenten in einer Rekonstruktion des Knochenmarks zu quantifizieren. Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind die richtige Aussaat der Brunnen und eine angemessene Fokussierung (siehe Abbildung 2 für erwartete Ergebnisse): sicherzustellen, dass MM und Stromazellen gleichmäßig verteilt sind, bestehen darin, dass Stromazellen Anhän...

Das Ziel dieser Methode ist es, die Arzneimittelempfindlichkeit von multiplem Myelom (MM) zu charakterisieren primären Zellen zu einer Gruppe von Mitteln ex vivo, so nahe wie möglich zu physiologischen Bedingungen, und mit ausreichender Präzision, die diese Ergebnisse verwendet werden, um zu identifizieren chemoresistant sub- werden Populationen innerhalb des Tumorlast und letztlich um Rechenmodelle entwickelt, um das klinische Ansprechen schätzen parametrieren. Rechenmodelle sind leistungsfähige Werkzeuge, um komplexe Systeme, wie Krebs-host-Therapie Wechselwirkungen zu analysieren. Jedoch sind Modelle nur so gut wie die Daten verwendet, um sie zu parametrieren. Leider können die meisten Daten in der Literatur noch nicht in seiner gegenwärtigen Form verwendet werden, um diese Modelle zu parametrisieren, da sie oft in gegenseitig exklusiven experimentellen Bedingungen erhalten werden. Somit werden neue Versuche oft mit dem Ziel, den Erhalt der benötigten Menge von Versuchsparametern erforderlich. Die meisten Lebensfähigkeitstests sind jedoch destruktiv und thuns auf eine kleine Anzahl von Zeitpunkten, die oft nur eine beschränkt. Diese stark behindert die Verwendung von Chemosensitivitätstests Rechenmodelle zu parametrieren, da solche Versuche fehlschlagen, um Informationen über die zeitliche Dynamik des Systems sorgen. Dies gilt vor allem mit primären Krebszellen, die oft auf wenige Millionen pro Probe begrenzt sind, und haben eine kurze Lebensdauer nach Biopsie, wodurch die Anzahl der Versuchsbedingungen verfügbar einschränkend. Zudem sind die meisten Lebensfähigkeitstests erfordern die Trennung der Krebs aus der Nicht-Krebs (Stroma) -Zellen bei der Quantifizierung, die zusätzliche Arbeit zum Protokoll hinzugefügt, weiterhin beeinflusst die Zellen und begrenzt die Anzahl der Experimente, die durchgeführt werden können . Vor 40 Jahren, Lachs und Mitarbeiter 1 vorgeschlagenen ihren berühmten In-vitro-Koloniebildungstest für die Bewertung der Chemosensitivität von Tumorzellen. Leider ist dieser Assay gefunden gemischtem Erfolg aufgrund der geringen Anzahl der Mehrfach myeLoma (MM) Patientenproben, die zur Bildung von Kolonien unter Kontrollbedingungen waren: Es wurde geschätzt, dass nur eine kleine Untergruppe von 0,001% bis 0,1% MM-Zellen zur Replikation fähig sind, wobei das multiple Myelom-Stammzellen 2 bezeichnet. Diese deutlich eingeschränkt die Erfolgsrate des Assays und der Anzahl von Arzneimitteln, die gleichzeitig getestet werden konnten, auch in der neueren Modellen 3. Dieses Problem ist jetzt viel wichtiger, wenn MM Mittel (Standard oder experimentell) sind zahlreicher als vor vier Jahrzehnten. Eine große Einschränkung dieser frühen Assays ist ihre dichotomisiert Ausgang entweder ein Patient &quot;empfindlich&quot; oder &quot;resistent&quot; auf ein bestimmtes Medikament. Es werden keine Informationen über den Grad der Empfindlichkeit und Heterogenität des Tumors Bevölkerung zur Verfügung gestellt. So würden Patienten mit kleinen Subpopulationen von schnell wachsenden resistenten Zellen als &quot;sensibel&quot; eingestuft werden, die Therapie, aber in Kürze zurückfallen und damit nicht beneFit von Behandlung. Angesichts der Bedeutung der Dauer der Reaktion im Gesamtüberleben (OS) von Krebspatienten 4,5, ist es klar, wie diese Tests waren nicht in der Lage, richtig zu schätzen OS konsequent. Um diese Einschränkungen zu umgehen, und um patientenspezifische Rechenmodelle die personalisiert klinische Antwort auf eine Gruppe von Medikamenten abschätzen würde erzeugen zu können, haben wir ein Verfahren zur zerstörungsfreien Prüfung Arzneimittelempfindlichkeit von multiplem Myelom (MM) Zelllinien entwickelt und primären MM-Zellen in einem ex vivo Rekonstruktion des Knochenmark-Mikroumgebung, einschließlich der extrazellulären Matrix und Stroma 6. Dieser Test hatte jedoch die Begrenzung sich auf eine bestimmte kommerzielle mikrofluidischen Rutsche, deren Abmessungen und Kosten begrenzt die Anzahl von Experimenten oder Medikamente, die auf einmal in einem bestimmten Teil der Ausrüstung ausgeführt werden können. Das hier beschriebene System erweitert diese ursprüngliche Test in einen Hoch-throughput organotypischen Dosis-Antwort-Plattform, für die in vitro-Screening von Drogen, bezogen auf ein digitales Bildanalysealgorithmus zerstörungs Quantifizierung der Lebensfähigkeit der Zellen. Jede Vertiefung 384 oder 1536-Well-Platten ist eine 3D-Rekonstruktion des Knochenmark-Mikroumgebung, einschließlich primären Myelomzellen, extrazelluläre Matrix, und vom Patienten stammende Stromazellen und Wachstumsfaktoren. Live-Mikroskopie und digitale Bildanalyse verwendet werden, um Zelltod Ereignisse in verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen, die verwendet werden, um die Dosis-Wirkungsflächen erzeugen detektieren. Aus der in-vitro-Daten, identifiziert ein mathematisches Modell der Größe und Chemosensitivität von Subpopulationen innerhalb der Tumorbelastung des Patienten, und kann verwendet werden, um zu simulieren, wie der Tumor würde zum Wirkstoff (e) unter physiologischen Bedingungen in einer klinischen Therapie 6 reagieren (BE Abbildung 1). Die wichtigsten Neuerungen dieser Plattform sind: (a) kleine Anzahl von Krebszellen notwendig (1.000-10.000 pro Medikament concentration); (B) Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten in physiologischen Bedingungen (extrazelluläre Matrix, Stroma, Patienten stammende Wachstumsfaktoren); (C) keine Toxizität von Lebensfähigkeit Markierungen 7, da nur Hellfeldabbildung verwendet wird, also keine Notwendigkeit, Zellen mit Fluoreszenz 8 oder 9 Biolumineszenz transfizieren; (D) kontinuierliche Bildgebung bietet Arzneimittelwirkung in Abhängigkeit von Konzentration und Einwirkzeit (Pharmakodynamik); und (e) die Integration von in vitro und Rechen evolutionäre Modelle, um das klinische Ergebnis 6 (Silva et al., in Vorbereitung) zu schätzen. Der Schlüsselfaktor, der die digitale Bildanalyse-Algorithmus, um Krebs von Stromazellen zu erkennen erlaubt, ist ihre unterschiedliche Affinität zu dem Boden der Vertiefung: MM Zellen nicht haften und verbleiben in Suspension in der Matrix, während die Stromazellen an der Unterseite der haften gut und dann dehnen. Diese Trennung geschieht, obwohl MM und Stroma einWieder gleichzeitig ausgesät und während der O / N Verfahren Inkubation auftritt. Der Stillstand kommen, in der Zentrifuge folgenden Aussaat der Platte weiter beschleunigt diesen Prozess. Als Folge erscheinen MM-Zellen in dem Bild als helle runde Scheiben von einem dunklen Ring umgeben, während das Stroma ein niedriges Profil und einem dunkleren Farbton (Abbildung 2) unterhält. Daher ist der Assay in seiner gegenwärtigen Form am besten geeignet für nicht-adhärente Krebszellen, wobei Anpassungen in der Algorithmus könnte getrennte Krebs und Stroma durchgeführt werden, die auf anderen morphologischen Eigenschaften, wie Größe und Form. In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Typen von extrazellulären Matrix (Kollagen und Basalmembran-Matrix) sowie zwei Arten von Co-Kulturen mit (Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen) BMSC und HUVECs, die die interstitielle und perivaskuläre Nischen des Knochenmarks verbunden. Mit Hilfe eines 384-Well-Platte, 5 Konzentrationen pro Wirkstoff und zwei Wiederholungen, konnten wir test bis zu 31 verschiedene Medikamente mit der Probe eines einzelnen Patienten. In 1.536-Well-Platten ist diese Zahl 127. Figur 3 zeigt die Anordnung zur Zeit für die manuelle Zellbesiedelung verwendet, während Supplemental 1 stellt die optimale Verteilung mit einem Pipettierroboter. In der Gestaltung von Figur 3 kann jeder 384-Well-Platte 3 Patientenproben mit 7 verschiedenen Medikamenten oder einer Patientenprobe mit 21 getesteten Medikamente tragen. Jedes Medikament wird durch 5-Konzentrationen dargestellt, und jeder Zustand ist in Duplikate ausgesät. 4 Kontroll-Wells (kein Medikament hinzugefügt) werden für jeden Satz von 7 Medikamente (zB Bohrlöcher 36-39, 126-129 und 200-203) ausgesät. Um die Wirksamkeit der verwendeten Medikamente zu gewährleisten, ist auch eine menschliche Myelom-Zelllinie (zB H929 oder MM1.S) ausgesät und in Duplikaten bei der höchsten Konzentration von jedem der verwendeten (Brunnen 76-89) Drogen betäubt. Die positive Zelllinie Kontrolle sichergestellt, dass die verwendeten Medikamente eine ausreichende Wirksamkeit, da die Dosis-Wirkungs-Kurven sind vergleichbar across Experimente. Zwei Vertiefungen werden mit einer Myelomzelllinie, das als Kontrolle für die Umgebungsbedingungen ausgesät, in anderen Worten, um mögliche Probleme bei der Tischplatte Inkubator während der Bilderzeugung zu detektieren (Vertiefungen 75 und 90). Die Aufzählung der Vertiefungen folgt einem Zickzack-Muster, um den Abstand von der motorisierten Objekttisch des Mikroskops, die Erfassungszeit reduziert und reduziert den Verschleiß der Ausrüstung bedeckt reduzieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EVOS FL AUTO</td>
			<td>AMG</td>
			<td>AMAFD1000 + AMC1000</td>
			<td>Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate CellBind</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CLS3683 SIGMA</td>
			<td>Corning CellBIND 384 well plates 
			384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,536-well plate CellBind</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>CLS3832 ALDRICH</td>
			<td>Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-1440-02 SIGMA</td>
			<td>For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD138 magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>130-051-301</td>
			<td>Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>&#160;130-042-401</td>
			<td>Column for separation of cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Magnet for separation column.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6909 SIGMA</td>
			<td>ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Getrex</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C-003-25P-B</td>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Heat inactivated</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.1mg/mL Bovine collagen type I</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision XS</td>
			<td>BIOTEK</td>
			<td>PRC3841</td>
			<td>Robotic pipettor system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an organotypic high throughput system for characterization of drug sensitivity of primary multiple myeloma cells

In dieser Arbeit beschreiben wir einen neuen Ansatz, der ex vivo Arzneimittelempfindlichkeit Assays und digitale Bildanalyse kombiniert, um Chemosensitivität und Heterogenität der Patienten stamm multiplem Myelom (MM) Zellen zu schätzen. Dieser Ansatz besteht darin, Impfen primären Myelomzellen frisch aus Knochenmarkabsaugungen in mikrofluidische Kammern in Multi-Well-Platten durchgeführt, die jeweils aus einer Rekonstruktion der Knochenmarkmikroumgebung, einschließlich der extrazellulären Matrix (Kollagen oder Basalmembran-Matrix) und Stroma (extrahierten patienten Mesenchymale Stammzellen) oder vom Menschen stammenden Endothelzellen (HUVECs). Die Kammern werden mit verschiedenen Mitteln und Konzentrationen betäubt und sequentiell für 96 h durch Hellfeldmikroskopie visualisiert, in einem motorisierten Mikroskop mit einer Digitalkamera ausgestattet. Digitale Bildanalyse-Software erkennt lebenden und toten Zellen von Vorhandensein oder Fehlen der Membranbewegung und erzeugt Kurven der Veränderung der Lebensfähigkeit als Funktion of Wirkstoffkonzentration und Belichtungszeit. Wir benutzen ein Computermodell, um die Parameter der Chemosensitivität des Tumors Bevölkerung zu jedem Medikament, als auch die Anzahl der als Maß für die Tumorheterogenität vorliegenden Teilpopulationen zu bestimmen. Diese Patienten zugeschnittene Modelle können dann verwendet werden, um Therapieschemata zu simulieren und zu schätzen, das klinische Ansprechen werden.

Die Strömung des Experiments wird kurz in 1 beschriebenen Wenn alle Schritte erfolgreich abgeschlossen wurde, die durch das Mikroskop erhaltenen Bilder sind gleichwertige sein. Abbildung 2: Live MM-Zellen sollten klar als helle Platten und BMSCs oder HUVECs sollte kaum sichtbar sein, gesehen werden und auch im Hintergrund verteilt. Wie in 2A zu sehen ist, reichen MM-Zellen in der Größe von einem Patienten zum anderen, aber im allgemeinen kleiner als Zelllinien sind. ...

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An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Ein organ High Throughput-System zur Charakterisierung von Arzneimittelempfindlichkeit von Primary Multiple Myelomzellen

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

an-organotypic-high-throughput-system-for-characterization-drug

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Medicine

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