이 연구는 플로리다의 BANKHEAD - 콜리 팀 과학 그랜트 (2BT03), 건강 / 국립 암 연구소 (1R21CA164322-01) 및 모 피트 암 센터의 팀 과학 부여의 국립 연구소의 국가가 투자되었다. 이 작품은 H. 리 모 피트 암 센터 연구원, NCI 지정 종합 암 센터 (P30-CA076292)에서 중개 연구 핵심 시설에 의해 부분적으로 지원하고있다. 일차 전지에 대한 액세스는 모 피트 암 센터에서 전체 암 관리 프로토콜을 통해 가능하게되었다.

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	<li>Salmon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+differential+sensitivity+of+human-tumor+stem+cells+to+anticancer+drugs.">Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs.</a> N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).</li><li>Suggitt, M., Bibby, M. 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The authors have no conflict of interest to disclose.

요약하면, 이것은 골수 재건 차 MM 세포 및 약물의 생체 약력학의 감수성을 정량화하는 강력하고 높은 처리량 방법이다. 이 프로토콜 내에서 중요한 단계는 우물의 적절한 파종하고 적절한 (예상 결과에 대한 그림 2 참조) 초점 : MM과 기질 세포가 균일하게 분포되어 있는지 확인, 그 기질 세포는 우물의 바닥에 부착되어 MM 모든 세포는 MM 세포 어두운 링으로 둘러싸인 밝은 디스?...

이 방법의 목적은 이들 결과 chemoresistant 서브 식별 할 수있는 충분한 정밀도로, 생리 학적 조건에 가능한 한 가깝게, 생체 에이전트 패널 일차 전지를 다발성 골수종 (MM)의 약물 감수성을 특성화하는 것이다 종양 부담하고, 집단 내의 궁극적 임상 응답을 추정하기위한 계산 모델 파라미터 화. 전산 모델은 암 호스트 치료의 상호 작용과 같은 복잡한 시스템을 분석 할 수있는 강력한 도구입니다. 그러나 모델은 데이터를 매개 변수화하는 데 사용되는만큼 좋다. 불행하게도, 문헌에서 사용할 수있는 대부분의 데이터는 종종 상호 배타적 실험 조건에서 수득 된 바와 같은 모델을 파라미터 화하는 현재의 형태로 사용될 수 없다. 따라서, 새로운 실험은 종종 필요한 실험 파라미터 세트를 얻는 것을 목표로해야한다. 대부분의 생존 분석은, 그러나, 파괴적이고 일이다우리는 시간 지점 소수 종종 단지 하나에 제한. 이것은 크게 이러한 실험은 시스템의 시간적 동역학에 관한 정보를 제공하지 못한다 감수성 때문에 분석의 사용은, 계산 모델을 매개 변수화 장애. 이것은 종종 따라서 가능한 실험 조건의 수를 제한하는, 샘플 당 몇 백만에 한정 생검 후 짧은 수명을 갖는다 일차 암세포, 특히 사실이다. 또한 대부분의 생존력 분석법은 상기 세포를 교란하고 행할 수 실험의 수를 제한하는, 프로토콜의 추가 작업을 추가 정량의 시간에 비 - 암 (기질) 세포에서 암의 분리를 필요 . 전에 40 년, 연어와 공동 작업자 1은 종양 세포의 감수성의 평가에 대한 시험 관내 콜로니 형성 분석에서 그 유명을 제안했다. 불행하게도,이 분석은 여러 MYE 인해 소수로 혼합 성공을제어 조건에서 콜로니를 형성 할 수 있었다 로마 (MM) 환자 샘플 : 그것은, MM 세포의 0.1 %로 0.001 %의 작은 서브 그룹은 복제 할 수 있다고 추정은 다발성 골수종 줄기 세포를 2로 지칭된다. 이로 인해, 심지어 더 최근의 모델 3에서, 분석의 성공률과 동시에 시험 할 수있는 약물의 수를 제한. (표준 또는 실험) MM 에이전트 사 년 전보다 더 많은 경우이 문제가 훨씬 더 중요하다. 두 환자는 특정 약물에 대한 &quot;민감한&quot;또는 &quot;내성&quot;이다 : 이러한 초기 분석의 주요 한계는 이분법 출력된다. 어떤 정보는 종양 인구의 감도와 이질성의 정도에 대한 제공되지 않습니다. 따라서, 빠르게 성장하는 내성 세포의 작은 하위 집단 환자가 치료에 &quot;민감한&quot;로 분류 될 수 있지만, 곧 재발 것입니다, 따라서하지 벤치료의 혜택을 받고 있습니다. 암 환자의 생존율 4,5- (OS)에서의 응답 시간의 중요성을 감안할 때, 이러한 분석이 올바르게 일관 OS를 추정 할 수 없었다 얼마나 명확하다. 순서 이러한 한계를 회피하고, 약물의 패널 맞춤 임상 응답을 추정 할 환자 별 계산 모델을 생성 할 수 있도록, 우리는 다발성 골수종 (MM) 세포 라인의 비파괴 시험 약물 민감성 방법을 개발 및 세포 외 기질과 기질 6 포함한 골수 미세 환경의 생체 재건 일차 MM 세포. 이 분석은, 그러나, 그 크기 및 비용 장비의 특정 부분에서 한 번에 수행 될 수있는 실험이나 약물의 수를 제한 특히 상업용 마이크로 유체 슬라이드에 의존하는 한계가 있었다. 여기에 설명 된 시스템은 높은으로이 원래의 분석을 확장비파괴 세포 생존율을 정량화하는 디지털 이미지 분석 알고리즘에 기초하여 약물의 시험 관내 스크리닝의 Organotypic 용량 반응 플랫폼, -throughput. 도 384 또는 1536 웰 플레이트의 각 차 MM 세포 외 기질 및 간질 환자 유래 성장 인자를 포함하여 골수 미세 환경의 3D 재구성이다. 라이브 현미경과 디지털 영상 분석은 용량 - 반응 표면을 생성하는 데 사용되는 다른 약물 농도에서 세포 사멸 이벤트를 검출하기 위해 사용된다. 시험 관내 데이터로부터 수학적 모델은 환자의 종양 부담 내의 크기 및 하위 집단의 감수성을 식별하고, 종양 (임상 처방 6에서 생리 학적 조건에 약물 (들)에 반응하는 방법을 시뮬레이션하기 위해 사용될 수있다 그림 1). 이 플랫폼의 주요 혁신은 다음과 같습니다 약물 승낙 당 필요한 암 세포의 () 작은 수 (1,000 ~ 10,000배급); (b) 약물 효능의 생리적 조건 (세포 외 매트릭스, 간질 환자 유래 성장 인자)의 평가; (c) 만 명 시야 촬상 보낸 생존 마커 (7)로부터는 독성, 생물 발광 형광 8 또는 9 세포를 형질 감염시키는 것이 필요도 사용되지 않는다; (d)는 연속 화상 농도 및 노출 시간 (약물 동력학)의 함수로서 약물의 효과를 제공한다; 및 (e) 시험 관내 및 전산 진화 모델과의 통합, 임상 적 결과 (6) (실바 외., 준비)를 추정한다. 디지털 이미지 분석 알고리즘이 간질 세포에서 암을 분별할 수 있도록 핵심 요소 중 바닥에 서로 다른 친 화성이다 웰 : MM 세포 부착, 및 간질 세포의 바닥에 부착하면서, 매트릭스에 현탁 유지하지 잘하고 스트레칭. 이러한 분리는 MM 및 심지어 기질에도 발생동시에 접종 및 배양 O / N 프로세스 중에 발생 재. 플레이트의 원심 분리기에서 스핀 다운 시딩 다음은이 과정을 더욱 가속. 기질이 낮은 프로파일과 어두운 그늘 (그림 2)을 유지하면서 결과적으로, MM 세포는 어두운 링으로 둘러싸인 원형 밝은 디스크와 같은 이미지에 나타납니다. 알고리즘의 조정 등의 크기 및 형상과 같은 다른 형태 적 특징에 기초하여 별도의 암과 기질로 할 수 있지만 이와 같이, 현재의 형태에서의 분석은, 비 - 부착 암세포에 가장 적합하다. 이 프로토콜에서 우리는 (골수 유래 중간 엽 줄기 세포) BMSC와 HUVEC를, 골수 간질 및 혈관 주위의 틈새를 대표로, 세포 외 기질 (콜라겐 및 기저막 매트릭스)의 두 종류뿐만 아니라 공동 배양 두 가지 유형을 서술 각각. 384- 웰 플레이트를 사용하여 약물 농도 및 당 5 개의 복제, 우리는 TES 수 있었다단일 환자의 샘플 (31) 다른 약물에 T 최대. 기업도 1은 로봇을 이용한 피펫 최적 분포를 나타낸다 1536 웰 플레이트에서이 수는, 3은 수동 세포 시딩 사용되는 레이아웃 (127)을 도시도이다. 그림 3에서 디자인, 각 384 웰 플레이트 (21) 약물 테스트 (7) 다른 약물, 또는 한 환자 샘플 3 환자 샘플을 수행 할 수 있습니다. 각각의 약물 농도는 5로 표시되고, 각각의 상태는 중복 접종된다. 4 제어 우물은 (어떤 약물이 추가되지 않습니다) (7) 약물 (예, 우물 36-39, 126-129 및 200-203)의 각 세트에 대한 씨앗을 품고있다. 사용되는 약물의 효능을 확인하기 위해 인간 골수종 세포주 (예, H929 또는 MM1.S)도 시딩하고 (웰 76-89)를 사용 약제의 각각의 가장 높은 농도에서 중복 마취이다. 양 세포주 제어는 투여 량 반응 곡선을 비교 AC 때문에 사용 약물, 충분한 효능을 가질 수 있습니다로스 실험. 두 개의 웰 (75 웰, 90) 촬상시 벤치 탑 인큐베이터에서 발생할 수있는 문제를 검출하는, 즉, 환경 조건에 대한 제어와 같은 골수종 세포주로 접종된다. 웰 열거 획득 시간을 감소시키고, 장비의 마모를 감소 현미경 동력 스테이지에 의해 덮여 거리를 감소시키기 위하여 지그재그 패턴을 따른다.

<table><tbody><tr><td>EVOS FL AUTO</td><td>AMG</td><td>AMAFD1000 + AMC1000</td><td>Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.</td></tr><tr><td>384-well plate CellBind</td><td>CORNING</td><td>CLS3683 SIGMA</td><td>Corning CellBIND 384 well plates&lt;br/&gt; 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid</td></tr><tr><td>1,536-well plate CellBind</td><td>CORNING</td><td>CLS3832 ALDRICH</td><td>Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-02 SIGMA</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; isolation of lymphocytes from human peripheral blood.</td></tr><tr><td>CD138 magnetic beads</td><td>Miltenyi&amp;nbsp;</td><td>130-051-301</td><td>Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.</td></tr><tr><td>LS columns</td><td>Miltenyi&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;130-042-401</td><td>Column for separation of cells.</td></tr><tr><td>MidiMACS Separator</td><td>Miltenyi&amp;nbsp;</td><td>130-042-302</td><td>Magnet for separation column.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6909 SIGMA</td><td>ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma</td></tr><tr><td>Getrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1413201</td><td>LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Life Technologies</td><td>C-003-25P-B</td><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )</td></tr><tr><td>RPMI-1640 media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td>RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red</td></tr><tr><td>FBS Heat inactivated</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td></tr><tr><td>3.1 mg/ml Bovine collagen type I</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td>Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>Precision XS</td><td>BIOTEK</td><td>PRC3841</td><td>Robotic pipettor system</td></tr></tbody></table>

an organotypic high throughput system for characterization of drug sensitivity of primary multiple myeloma cells

본 연구에서 우리는 환자 유래 다발성 골수종 (MM) 세포의 감수성 및 이질성을 추정 생체 약물 민감성 분석 및 디지털 이미지 분석을 결합한 새로운 접근법을 설명한다. 이 방법은 환자 - 갓 외 기질 (콜라겐 또는 기저막 매트릭스)과 간질 (각각 포함하는 골수 미세 환경의 재구성 구성된 멀티 웰 플레이트에서 구현 미세 유체 챔버 내로 골수 흡 인물에서 추출 일차 MM 세포를 시드로 이루어져 유래 중간 엽 줄기 세포) 또는 인간 유래 혈관 내피 세포 (HUVEC를). 챔버는 다른 에이전트 및 농도로 마취하고, 디지털 카메라가 장착 된 전동식 현미경, 명 시야 현미경을 통해 96 시간 동안 순차적으로 촬상된다. 디지털 영상 분석 소프트웨어가 존재 또는 멤브레인의 움직임의 유무를 라이브 및 사균을 검출하고, 함수 O로 생존의 변화 곡선을 생성F 약물 농도와 노출 시간. 우리가 각각의 약물에 대한 종양의 감수성 인구의 파라미터뿐만 아니라 종양 이종 척도로서 본 하위 집단의 수를 결정하는 연산 모델을 사용한다. 이러한 환자 맞춤형 모델은 치료법을 시뮬레이트 및 임상 응답을 추정하는데 사용될 수있다.

실험의 흐름은 간단히도 1에서 설명하는 모든 단계가 성공적으로 완료되는 경우, 현미경에 의해 얻어지는 화상이도 2와 동등해야한다 :. MM 세포 명확 밝은 디스크 및 BMSCs 또는 HUVEC를 거의 볼 수 있어야 보지되어야 라이브 잘 배경 분포. 도 2a에 도시 된 바와 같이, MM 세포는 한 환자로부터 다른 크기가 다양하지만, 일반적으로 그들은 세포주보다 작다. 그들이 ...

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An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

an-organotypic-high-throughput-system-for-characterization-drug

Research

JoVE Journal

Medicine

8.6K 조회수.  H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute. We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

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Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular interactions that exist within this microenvironment. Yet the BM microenvironment cannot be easily replicated in vitro, which potentially limits the physiologic relevance of many in vitro and ex vivo experimental models. These issues can be overcome by utilizing a xenograft model in which luciferase (LUC)-transfected 8226 MM cells will specifically engraft in the mouse skeleton. When these mice are given the appropriate substrate, D-luciferin, the effects of therapy on tumor growth and survival can be analyzed by measuring changes in the bioluminescent images (BLI) produced by the tumors in vivo. This BLI data combined with positronic-emission tomography/computational tomography (PET/CT) analysis using the metabolic marker 2-deoxy-2-(18F)fluoro-D-glucose (18F-FDG) is used to monitor changes in tumor metabolism over time. These imaging platforms allow for multiple noninvasive measurements within the tumor/BM microenvironment.

Here we use bioluminescent, X-ray, and positron-emission tomography/computed tomography imaging to study how inhibiting mTOR activity impacts bone marrow-engrafted myeloma tumors in a xenograft model. This allows for physiologically relevant, non-invasive, and multimodal analyses of the anti-myeloma effect of therapies targeting bone marrow-engrafted myeloma tumors in vivo.

다 발성 골 수 Xenografts 노 그 쥐에서의 복합 발광 및 양자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 영상

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

연구

암 연구학

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

유전학

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture models. PDOs have been successfully generated from a variety of human tumors to recapitulate the architecture and function of tumor tissue accurately and efficiently. However, PDOs are unsuitable for an in vitro high-throughput assay system (HTS) or cell analysis using 96-well or 384-well plates when evaluating anticancer drugs because they are heterogeneous in size and form large clusters in culture. These cultures and assays use extracellular matrices, such as Matrigel, to create tumor tissue scaffolds. Therefore, PDOs have a low throughput and high cost, and it has been difficult to develop a suitable assay system. To address this issue, a simpler and more accurate HTS was established using PDOs to evaluate the potency of anticancer drugs and immunotherapy. An in vitro HTS was created that uses PDOs established from solid tumors cultured in 384-well plates. An HTS was also developed for assessment of antibody-dependent cellular cytotoxicity activity to represent the immune response using PDOs cultured in 96-well plates.

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

A highly accurate in vitro high-throughput assay system was developed to evaluate anticancer drugs using patient-derived tumor organoids (PDOs), similar to cancer tissues but are unsuitable for in vitro high-throughput assay systems with 96-well and 384-well plates.

환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하여 시험관 분석에서 높은 처리량

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and treatment response to targeted inhibitors in cancer. Pioneering work in gastrointestinal and pancreatic cancers has highlighted the promise of patient-derived organoids (PDOs) as a patient-proximate culture system, with an increasing number of models emerging. Similarly, work in other cancer types has focused on establishing organoid models and optimizing culture protocols. Notably, 3D cancer organoid models maintain the genetic complexity of original tumor specimens and thus translate tumor-derived sequencing data into treatment with genetically informed targeted therapies in an experimental setting. Further, PDOs might foster the evaluation of rational combination treatments to overcome resistance-associated adaptation of tumors in the future. The latter focuses on intense research efforts in non-small-cell lung cancer (NSCLC), as resistance development ultimately limits the treatment success of targeted inhibitors. An early assessment of therapeutically targetable mechanisms using NSCLC PDOs could help inform rational combination treatments. This manuscript describes a standardized protocol for the cell culture plate-based assessment of drug sensitivities to targeted inhibitors in NSCLC-derived 3D PDOs, with potential adaptability to combinational treatments and other treatment modalities.

This protocol describes a standardized evaluation of drug sensitivities to targeted signaling inhibitors in NSCLC patient-derived organoid models.

EGFR 돌연변이 NSCLC 환자 유래 오가노이드에서 표적 치료법에 대한 민감도 프로파일링

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위한 게놈 규모 스크리닝

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1), MPNSTs are the most common malignancy and the leading cause of death. These rare and aggressive soft-tissue sarcomas offer a stark future, with 5-year disease-free survival rates of 34-60%. Treatment options for individuals with MPNSTs are disappointingly limited, with disfiguring surgery being the foremost treatment option. Many once-promising therapies such as tipifarnib, an inhibitor of Ras signaling, have failed clinically. Likewise, phase II clinical trials with erlotinib, which targets the epidermal growth factor (EFGR), and sorafenib, which targets the vascular endothelial growth factor receptor (VEGF), platelet-derived growth factor receptor (PDGF), and Raf, in combination with standard chemotherapy, have also failed to produce a response in patients. 
In recent years, functional genomic screening methods combined with genetic profiling of cancer cell lines have proven useful for identifying essential cytoplasmic signaling pathways and the development of target-specific therapies. In the case of rare tumor types, a variation of this approach known as cross-species comparative oncogenomics is increasingly being used to identify novel therapeutic targets. In cross-species comparative oncogenomics, genetic profiling and functional genomics are performed in genetically engineered mouse (GEM) models and the results are then validated in the rare human specimens and cell lines that are available. 
This paper describes how to identify candidate driver gene mutations in human and mouse MPNST cells using whole exome sequencing (WES). We then describe how to perform genome-scale shRNA screens to identify and compare critical signaling pathways in mouse and human MPNST cells and identify druggable targets in these pathways. These methodologies provide an effective approach to identifying new therapeutic targets in a variety of human cancer types.

저자 스포트라이트: 게놈 스케일 shRNA 스크리닝을 통한 악성 말초 신경초 종양에 대한 새로운 치료 표적 찾기 

We have developed a cross-species comparative oncogenomics approach utilizing genomic analyses and functional genomic screens to identify and compare therapeutic targets in tumors arising in genetically engineered mouse models and the corresponding human tumor type.

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

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악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구