Die Autoren möchten sich Unterstützung von der National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 und NRF2015NRF-POC0001-19), der National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012) und Nanyang Technological University, um NJC bestätigen

1. Bildung der unterstützten Lipiddoppelschicht auf einer hydrophilen festen Träger <ol><li> Vorbereitung Lipidstammlösungen von 10 mg / ml 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) und 1 mg / ml 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (Lissamine Rhodamin B sulfonyl) (Rh-PE) durch Lösen der jeweiligen Lipidpulver (entsprechend vorher mit einem analytischen Massenbilanz) in Isopropanol-Lösung eingewogen. </li><li> Und mischen Sie die Stammlösungen in Isopropanol, um das gewünschte Lipidgemisch in der letzten Konzentration herzustellen. Für die Fluoreszenzmikroskopie und FRAP sollte 0,5 Gew% Rh-PE in der Lipidmischung enthalten sein. </li><li> Spritzen Sie das Lipidgemisch in Isopropanol in den mikrofluidischen Kanal, bis sie gefüllt ist. </li><li> Inkubieren der Lipidmischung auf der Glasoberfläche für etwa 10 min. </li><li> Allmählich die Lipid-Lösung mit Wasser oder Pufferlösung unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe bei einer sehr niedrigen Strömungsgeschwindigkeit(10-50 &amp; mgr; l / min). Alternativ, ersetzen Sie das Lipidgemisch durch wiederholtes Pipettieren. </li><li> Spülen Sie den Kanal gründlich mit überschüssigem Puffer, um die restliche Isopropanol zu entfernen. </li></ol> 2. Bildung von Cholesterin-angereicherten Unterstützte Membranen Hinweis: Die feste Oberfläche (SiO 2) unterstützt Vesikelfusion, aber die Membranzusammensetzung (hoher Cholesterinspiegel) hemmt Vesikelfusion weil Cholesterin angereicherte Vesikel haben eine hohe Biegesteifigkeit 30. <ol><li> Wird eine Stammlösung, die 10 mg / ml DOPC Lipid, 10 mg / ml Cholesterin und 1 mg / ml Rh-PE, indem zunächst die jeweiligen Pulver in Isopropanol. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,2 bis 1,6 unter Verwendung der Stammlösungen in Schritt 2.1 vorbereitet. </li></ol> 3. Membranfluidität Assay <ol><li> Tauchen Sie die Objektträger in Natriumdodecylsulfat (SDS) -Lösung (1%) für 10 Minuten. </li><li> Gründlich waschen Sie die Folien mit VE-Wasser und spülen with Ethanol. </li><li> Föhnen Dias mit einem leichten Stickstoffstrom. </li><li> Setzen Sie die Folien an Sauerstoffplasma für 30 s bei maximaler HF-Leistung in der Sauerstoffplasmakammer. </li><li> Entfernen Sie die Schutzbeschichtung aus dem bodenlosen kommerziellen Mikrofluidkammer (1A) mit einer Pinzette und befestigen Sie den Objektträger auf der Klebeseite der Kammer (1B). </li><li> Montieren Sie die Anschlüsse und Schläuche in die Ein- und Austrittspositionen der Kammer und legen Sie den mikrofluidischen Kanal auf dem Mikroskoptisch (Abbildung 1c). </li><li> Bilden einen fluoreszenzmarkierten unterstützten Lipiddoppelschicht in der mikrofluidischen Kanal [Wiederholen Sie Schritt 1 mit der gewünschten Lipidzusammensetzung (beispielsweise 0,5 mg / ml DOPC), einschließlich 0,5 Gew% Rh-PE in einem organischen Lösungsmittel]. </li><li> Suchen Sie den Doppelschicht-Ebene mit einem 60X Ölimmersionsobjektiv (NA 1,49), um Bilder zu erfassen. </li><li> Nehmen Sie zwei Vorbleichbad Bilder dann Foto-Bleichen 301; m breiten kreisförmigen Fleck mit einem 532 nm, 100 mW Laserstrahls. Vor dem Bleichen, Aufwärmen der Laser, bis seine Intensität stabil geworden ist. Unmittelbar nach Photobleaching, erfassen eine Reihe von Bildern alle 1 Sek 2 min, um die Erholung der Fluoreszenzintensität bei den gebleichten Stelle folgen. </li></ol> 4. Cholesterin Quantification Assay <ol><li> Aussetzen Siliciumdioxid beschichtete Quarzkristall-Sensorchip, um Sauerstoffplasma für 30 s bei maximaler HF-Leistung in der Sauerstoffplasmakammer. Entfernen Sie den Chip aus der Kammer und sofort montieren Sie den Chip in der Messkammer. </li><li> Vor dem Experiment wurde zunächst die Frequenz und die Verlustleistung des Sensorchips in der Luft, um eine ordnungsgemäße Montage sicherzustellen, zu erwerben. <ol><li> Für die kommerzielle Q-Sense E1 oder E4 QCM-D Gerät, führen Sie den Q-Soft-Software-Programm und klicken Sie auf &quot;Erwerb&quot; und wählen Sie &quot;Setup Measurement&quot;. </li><li> In dem neuen Fenster, das angezeigt wird, überprüfen Sie die 3, 5, 7, 9, 11 und 13 Obertöne und klicken Sie dann auf Find and Run, um die Resonanzspektren zu überprüfen. Stellen Sie die Temperatur auf 24 ° C. Wenn eine oder mehrere Resonanzfrequenzen nicht mit den erwarteten Werten übereinstimmen, überprüfen Sie die Chip-Montage und wieder führen Sie diesen Schritt, bis eine Einigung erzielt wird. </li></ol></li><li> Beginnen die peristaltische Pumpe und Durchflusspufferlösung (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) in die Messkammer mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 ul / min. </li><li> In der Software-Programm, klicken Sie auf &quot;Erwerb&quot; und wählen Sie &quot;Neu starten Measurement&quot;, um die Resonanzfrequenz und Energieverlust Signale aufzuzeichnen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis eine stabile Basislinie für die Frequenz und Verlustverschiebungen erhalten. Anmerkung: Für die Schritte nachfolgend erfolgt eine zusätzliche Frequenz und Dissipation Verschiebungen, die als Funktion der Zeit aufgezeichnet werden kann. </li><li> Injizieren Isopropanol (ohne Lipid) für 10 min. </li><li> Injizieren Sie die Mischung aus DOPC Lipid / Cholesterin bei dergewünschten Molverhältnis mit einer Gesamtlipidkonzentration von 0,5 mg / ml in Isopropanol für 10 min. </li><li> Injizieren Puffer für 20 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 100 ul / min. </li><li> Injizieren einer Lösung aus 1 mM Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) in Puffer (Fließgeschwindigkeit 100 ml / min), bis das Frequenzsignal einen stabilen Wert erreicht, hergestellt. </li><li> Messung der relativen positiven Frequenzverschiebungen, die durch die MßCD Behandlungsschritt hervorgerufen wird, und die Berechnung der Masse von Cholesterin und DOPC Lipide durch Umwandeln der Af cho und Af DOPC Werte Massewerte durch Verwendung des Sauerbrey Gleichung [&amp; Dgr; m = - (C / N) &amp; times; &amp; delta; f, wobei C = 17,7 ng / cm 2, n: Oberton]. </li><li> Berechnung der Molfraktion Cholesterin im SLB, unter Berücksichtigung der Molekulargewichte von DOPC Lipid (786,1 g / mol) und Cholesterol (386,6 g / mol). </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

In dieser Arbeit wird ein Lösungsmittel-Austausch-Protokoll, in dem Lipide in Alkohol (Isopropanol, Ethanol oder n-Propanol) mit einem festen Träger inkubiert werden präsentiert und dann wird der Alkohol nach und nach mit einer wässrigen Pufferlösung, um einen Antrieb der Serien ersetzt von Phasenübergängen schließlich produzieren Lamellenphasen Lipid-Doppelschichten 24. Es wird gezeigt, daß das Verfahren ermöglicht die Herstellung von unterstützten Lipiddoppelschichten auf Oberflächen, wie etwa Gold, die unlösbar an den Vesikelfusion Verfahrens geeignet ist. Eine optimale Lipid-Konzentrationsbereich (0,1 bis 0,5 mg / ml) wurde für die komplette Doppelschichtbildung in experimentellen Standardformate bisher getestet wurde bestimmt. Bei Lipidkonzentrationen von weniger als 0,1 mg / ml, diskrete, mikroskopische Flecken von Doppelschichten gebildet werden. Andererseits wird bei Konzentrationen über 0,1 mg / ml und weniger als 0,5 mg / ml, eine vollständige und einheitliche Doppelschicht gebildet wird. Bei Lipidkonzentrationen oberhalb dieses Bereichs wurde ein Fluid-Doppelschicht noch als verifi gebildetvon FRAP Analyse ed zeigt jedoch, Fluoreszenzmikroskopie auf das Vorhandensein weiterer Lipidstrukturen auf der Oberseite der Doppelschicht. Auffällig ist, die Morphologie dieser zusätzlichen Lipidstrukturen, wie durch QCM-D-Analyse bestimmt, hing von dem Alkohol, der während der Inkubation Schritt verwendet wurde. Im Fall von Ethanol, die relativ hohen Δ f und Δ D verschiebt ähneln der QCM-D Signatur für ein adsorbiertes Vesikel Schicht erhalten. Wenn Isopropanol oder n-Propanol wurde stattdessen verwendet, war der Δ f etwas höher als der Wert für eine Doppelschicht (final Δ f von -30 bis -40 Hz) erwartet, während der Δ D war erheblich höher. Solche QCM-D Antworten würde ausgestreckte Lipidstrukturen (zB wurmähnliche Micellen) nach außen von der Membranoberfläche vorstehenden erwarten (wie durch Fluoreszenzmikroskopie in einigen Fällen sichtbar). Die Rate der Lösungsmittelaustausch ist ein weiterer wichtiger Parameter, der entscheidend sein kann, especmathematisch bei geringeren Lipidkonzentrationen (zB 0,1 mg / ml) verwendet werden. Schnelle Lösungsmittelaustausch bei niedriger Lipidkonzentration kann zur Bildung von unvollständigen Doppelschichten führen. In der Standard-Messkammer für QCM-D-Messungen in diesem Papier (Q-Sense E4 Messkammer), Durchflussraten von etwa 100 &amp; mgr; l / min verwendet wird, waren geeignet für hoch reproduzierbare komplette Doppelschichtbildung. Für Durchflusszellen mit anderen Geometrien und Volumen kann die optimale Durchflussrate variieren und muss empirisch auf der Grundlage der hier vorgeschlagenen Schritte bestimmt werden. Zusätzlich zum unterstützten Lipiddoppelschichten auf Oberflächen, die unhandhabbar Vesikelfusion sind, kann die SALB eingesetzt werden, um die Notwendigkeit von Lipidvesikeln, die zerreißen kann, wodurch die Tür zur Herstellung dieser Membranen mit komplexen Zusammensetzungen Öffnung zu umgehen. Als illustratives Beispiel Zusammensetzung wurden Lipidmischungen mit einem hohen Anteil von Cholesterin untersucht. Cholesterin ist ein wichtiger Bestandteil der mammalian Zellmembranen und ihre Bruch nähern können 45-50 Mol-% der Membranlipidzusammensetzung (beispielsweise in Erythrocyten). So sollte auch ein einfaches Modell einer Lipid-Doppelschicht, die eine menschliche Zelle Membran schließen Cholesterin. Während Vesikelfusion könnte zur fluidischen Lipiddoppelschichten nur 10-15% Cholesterin enthält, herzustellen, können die Verfahren SALB Bildung fluidischen Lipiddoppelschichten, die hohe Anteile von Cholesterin (bis zu 57 mol%, bestimmt durch QCM-D-Messungen quantifiziert) 36. Wenn jedoch das Niveau des Cholesterins wurde weiter erhöht (bis zu 63 mol%) wurden streifenförmigen Bereichen beobachtet 37. Die Co-bestehenden Domains waren flüssig, erinnern an die im Phasendiagramm des Cholesterin / Phospholipide Monoschicht an der Luft-Wasser-Grenzfläche in der β-Region beobachtet. Insgesamt ist die SALB Methode gezeigt, um eine einfache und effiziente Vorgehensweise sein, unterstützten Lipiddoppelschichten zu bilden, insbesondere in Fällen würde den Rahmen der herkömmlichen Vesikelfusion Methode. Bisher wurden die QCM-D Technik und Fluoreszenz-Mikroskopie hauptsächlich verwendet, um die unterstützten Lipiddoppelschichten durch die SALB Verfahren gebildet charakterisieren. Wir freuen uns, eine breite Palette von oberflächensensitiven analytischen Messungen Techniken, einschließlich der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) 38, Rasterkraftmikroskopie (AFM) 39,40, Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie 41, X-ray 42 und Neutronenreflexionsvermögen 43, kann verwendet werden, um weiter zu charakterisieren und untersuchen einfache und komplexe Doppelschicht-Konfigurationen vorbereitet durch die SALB Verfahren werden. Diese neuen Möglichkeiten öffnen die Tür zu einer größeren Anzahl von Wissenschaftlern, die künstliche Zellmembranen durch die Nutzung eines einfachen und robusten Versuchsprotokoll zu erkunden.

Der Feststoff-unterstützten Lipiddoppelschicht 1 (SLB) ist eine vielseitige Plattform, die die grundlegenden Eigenschaften von Biomembranen wie die Dicke der Doppelschicht, zweidimensionalen Lipiddiffusionsvermögen und die Fähigkeit, membranassoziierten Biomolekülen Host bewahrt. Aufgrund der Komplexität von natürlichen Zellmembranen wurde dieses einfache Plattform wurde gezeigt, als eine effiziente Plattform für in vitro-Untersuchungen von Membranbezogenen Prozesse wie Floßbildung 2, Proteinbindungs ​​3, Viren und virusartige Partikel Bindungs ​​4,5 funktionieren und Zellsignal 6. In unmittelbarer Nähe zu einem festen Träger gebildet ist, ist der SLB-Plattform mit einer Vielzahl von Oberflächen-empfindliche Messungen Techniken kompatibel wie Gesamtreflexionsmikroskopie (TIRF), Quarzkristall-Mikrobalance-Dissipation (QCM-D) und die Impedanz-Spektroskopie. Mehrere Verfahren wurden entwickelt, um verschiedene Arten von SLBs einschließlich Luftblase zu erzeugenZusammenbruch 7 und Dip-Pen-Nanolithographie 8 für Submikrongröße Lipidflecken, Spin-Beschichtung 9 für Doppelschicht-Stacks und Langmuir-Blodgett (LB) 10 und Vesikelfusion (VF) 11 für die vollständige übergreifende, einzelne Lipiddoppelschichten. Die VF-Methode besteht aus der Adsorption von kleinen unilamellaren Vesikeln mit einem festen Träger und nachfolgender spontaner Bruch und Fusion, um eine kontinuierliche Lipid-Doppelschicht zu bilden. Jedoch unter physiologischen Bedingungen spontan Vesikel Bruch hauptsächlich auf Silizium basierende Materialien wie Siliziumdioxid, Glas und Glimmer beschränkt. Zusätzlich Vesikel Bruch nicht spontan Vesikel komplexer Lipidzusammensetzungen wie solche, die hohe Anteile an Cholesterin oder negativ geladenen Lipiden auftreten. Je nach System kann Vesikel Bruch durch weiteres Maßschneidern der experimentellen Bedingungen wie Temperatur 12 Lösung pH 13, und der Salzgehalt 14, osmotischen Schock 15 induziert werden </sauf&gt; oder Druck 16 oder die Zugabe von zweiwertigen Ionen, wie Ca 2+ 17. Alternativ kann das membranaktive Peptid AH, um eine Schicht von adsorbiertem Vesikel destabilisieren eingeführt werden, was zu einer Vesikel Bruch und die Doppelschichtbildung auf einer Strecke der Flächen 18-22. Außerdem ist eine erfolgreiche Doppelschichtbildung Herstellung einer gut kontrollierten Population von kleinen unilamellaren Vesikeln, die zeitaufwendig und schwierig, die für bestimmte Membranzusammensetzungen zu erreichen sein kann. Daher ist trotz seiner hohen Effizienz bei der optimalen Fällen (beispielsweise nach umfangreichen Gefrier-Auftau-Vorbehandlung von Vesikeln 23), deren allgemeine Anwendung Vesikelfusion wird durch den Umfang der geeigneten Substrate und Membranzusammensetzungen beschränkt. Das Lösungsmittel-unterstützte Lipiddoppelschicht (SALB) Methode 24-28 ist eine alternative Herstellungsmethode, die nicht Lipidvesikel erfordert. Das Verfahren beruht auf der Abscheidung o basierendf Lipidmoleküle auf einer festen Oberfläche in Gegenwart eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, gefolgt von einer allmählichen Austausch dieser Lösemittel mit einer wässrigen Pufferlösung, um SLB Bildung auszulösen. Während des Lösungsmittelaustauschschritt, der ternären Mischung von Lipiden, organischen Lösungsmittel und Wasser durchläuft eine Reihe von Phasenübergängen mit zunehmendem Wasseranteil, der zur Bildung von lamellaren Phasenstrukturen in der Hauptmassenlösung und einer SLB auf dem festen Substrat führt. Wichtig ist, umgeht diese Selbstorganisation Route die Notwendigkeit Vesikel Bruch, die in der Regel ist der limitierende Schritt für die Transformation von adsorbierten Vesikel in ein SLB. Das Protokoll ist anwendbar auf eine große Vielzahl von Oberflächen, einschließlich Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Chrom, Indiumzinnoxid und Gold. In diesem Dokument und in der begleitenden Video wird ein Vergleich von Lipidablagerung durch die SALB und Vesikelfusion Methoden vorgestellt. Insbesondere der Einfluss der experimentellen Parameter, einschließlich Lipidkonzentration, Strömungsgeschwindigkeit, und die Wahl des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels auf die Qualität des von der SALB Verfahren gebildet Bilayer diskutiert. Analytische Charakterisierung der hergestellten SLBs wird von der QCM-D, Fluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzerholung nach Photobleaching (FRAP) Techniken durchgeführt. QCM-D-Überwachung ist eine oberflächensensitive Massenmesstechnik, die seit den bahnbrechenden Arbeiten von Keller und Kasemo 29 durchgeführt wird, wurde ausgiebig genutzt, um quantitativ Doppelschichtbildung zu untersuchen. Fluoreszenzmikroskopie erlaubt Inspektion der Membranhomogenität sowie die Visualisierung von Membrandomänen. Die FRAP Technik ist ein Standardwerkzeug, um die seitliche Beweglichkeit der Lipid-Moleküle in einer SLB, die eine wesentliche Eigenschaft des fluidischen Membranen bestimmen. Der erste Teil dieser Studie beinhaltet QCM-D-Analyse der SALB und Vesikelfusion Methoden angewandt, um Doppelschichtbildung auf Siliziumdioxid und Gold zu versuchen. Im zweiten Teil,Die Herstellung und Charakterisierung dieser Membranen mit einem Bereich von Cholesterinkonzentration mit dem SALB Verfahren demonstriert und die Ergebnisse werden mit den von der Vesikelfusion Verfahren erhaltenen verglichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

Um Zellmembranen zu imitieren, ist der unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) eine attraktive Plattform, die In-vitro-Untersuchung von Membranbezogenen Prozesse ermöglicht, während zur Übertragung der Biokompatibilität und Biofunktionalität auf feste Substrate. Die spontane Adsorption und Ruptur Phospholipidvesikel ist die am häufigsten verwendete Methode, um SLBs bilden. Jedoch unter physiologischen Bedingungen Vesikelfusion (VF) ist, nur eine Teilmenge der Lipidzusammensetzungen und feste Träger begrenzt. Hier beschreiben wir ein einstufiges allgemeine Verfahren genannten Lösungsmittel-unterstützte Lipiddoppelschicht (SALB) Bildungsverfahren um SLBs die nicht Vesikel erfordert bilden. Die SALB Verfahren beinhaltet die Abscheidung von Lipidmolekülen auf einer festen Oberfläche in Gegenwart eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel (zB Isopropanol) und anschließender Lösungsmittelaustausch mit wßriger Pufferlösung um SLB Bildung auszulösen. Die kontinuierliche Lösungsmittelaustauschschritt ermöglicht Anwendung desVerfahren in einem Durchflusskonfiguration für die Überwachung Doppelschichtbildung und nachfolgende Änderungen unter Verwendung einer Vielzahl von oberflächensensitive Biosensoren. Die SALB Methode kann verwendet werden, um SLBs auf einer Vielzahl von hydrophilen festen Oberflächen, einschließlich derjenigen, die unlösbar zu Vesikelfusion sind herzustellen. Darüber hinaus ermöglicht es die Herstellung von SLBs von Lipidzusammensetzungen zusammengesetzt, die nicht mit der Vesikelfusion Verfahren hergestellt werden können. Hierin vergleichen wir Ergebnisse mit den SALB und konventionellen Vesikelfusion Methoden auf zwei veranschaulichende hydrophile Oberflächen, Siliciumdioxid und Gold erhalten. Um die experimentellen Bedingungen für die Herstellung von hochwertigen Doppelschichten über die SALB Verfahren hergestellt zu optimieren, wird die Wirkung von verschiedenen Parametern ab, einschließlich der Art des organischen Lösungsmittels in der Abscheidungsschritt, die Rate der Lösungsmittelaustausch, und der Lipidkonzentration sowie Tipps zur Problemlösung diskutiert . Bildung unterstützt Membranen, die hohe Anteile an Cholesterin ist auch DämonenFett mit dem SALB Verfahren, Hervorhebung der technischen Möglichkeiten des SALB Technik für eine breite Palette von Membrankonfigurationen.

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll, um eine unterstützte Lipiddoppelschicht auf festen Substraten ohne Verwendung von Lipidbläschen bilden. Wir zeigen, ein einstufiges Verfahren zur Herstellung einer Lipid-Doppelschicht auf Siliciumdioxid und Gold sowie trägergestützten Membranen mit Cholesterin angereicherten Domäne für verschiedene biologische Anwendungen bilden.

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

14.6K Aufrufe.  Nanyang Technological University.  Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll, um eine unterstützte Lipiddoppelschicht auf festen Substraten ohne Verwendung von Lipidbläschen bilden. Wir zeigen, ein einstufiges Verfahren zur Herstellung einer Lipid-Doppelschicht auf Siliciumdioxid und Gold sowie trägergestützten Membranen mit Cholesterin angereicherten Domäne für verschiedene biologische Anwendungen bilden. 

Serie: Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Forschung

Biotechnik

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

Mikrofluidischen Chip Herstellung und Verfahren zur Influenza Detect

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymeren Mikronadelanordnung Fabrication durch Photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Eine einfache und skalierbare Herstellungsverfahren für organische elektronische Vorrichtungen auf Textilien

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

Herstellung von Decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüste

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...