Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an SHO von den National Institutes of Health (R01 GM092993) unterstützt, der National Science Foundation (NSF Career Award und DBI 0964216), dem Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Programm und die Minnesota Partnership Award für Biotechnologie und Medical Genomics. Geräte-Fertigung wurde an der Universität von Minnesota und Nanofabrikation Center (NFC), die Unterstützung von der NSF durch die National Nanotechnology Infrastructure Netzwerk empfängt. Diese Arbeit wurde auch durch Zuschüsse zu MR von den National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), der National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), der Applebaum, Hilton, Peterson und Sanford Stiftungen und der Familie McNeilus unterstützt. Die Autoren möchten Hyungsoon Im für die Unterstützung bei Abbildungen und Shailabh Kumar für die Unterstützung bei der Rasterelektronenmikroskopie danken.

1. Microfabrication von Microwell-Array-Substrat <ol><li> Beginnen mit einem 4-Zoll-Siliziumwafer mit 100 nm thermisch aufgewachsenes Oxid. </li><li> Spin SPR-955 0,7 Photoresist auf dem Wafer bei 4000 Upm für 30 Sekunden. </li><li> Backen auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 90 sek. </li><li> Expose Photolack. <ol><li> Verwenden Sie eine Maske, die ein um Löcher in einem sechseckigen Feld mit einer 3 um Zeit, wo das Array umfasst eine 2 mm x 2 mm Bereich angeordnet schaffen wird. </li><li> Aussetzen Wafer in einem i-Linien-Steppers mit einer Schrittweite von 6 mm und einer Belichtung von 200 mJ / cm 2. </li></ol></li><li> Backen auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 90 sek. </li><li> Entwickeln Sie mit Hilfe eines Spin-Entwickler zu 2 Pfützen von CD-26 auf dem Wafer für eine Gesamtentwicklungszeit von 90 Sekunden zu hinterlegen. </li><li> Gründlich mit Reinstwasser DI-Wasser und trocken mit N 2 spülen. </li><li> Ätzen des Oxids in einer Blind Ionenätzer für 6 min mit 50 sccm Ar, 25 sccm CF 4, und 50 sccm von CHF 3 floFlügel bei einem Druck von 75 mTorr. </li><li> Ätzen der Silizium in einem ICP-Deep-Trench-reaktiven Ionenätzer für 2 min mit 63 sccm C 4 F 8, 27 sccm SF &amp;sub6;, 40 sccm Ar und 10 sccm O 2 bei einem Druck von 14 mTorr fließt. </li><li> Spülen in Aceton, Methanol und Isopropanol zu entfernen, widerstehen. </li><li> In ein Bad aus H 2 SO 4: H 2 O 2 1:1 für 10 min, um die Oberfläche zu reinigen. </li><li> Gründlich mit Reinstwasser DI-Wasser und trocken mit N 2 spülen. </li><li> Abzuscheiden 1.080 Å von Al 2 O 3 durch Atomlagenabscheidung bei 250 º C </li></ol> 2. Herstellung von Poly (dimethylsiloxan) Rakel <ol><li> Wenn möglich, arbeiten in einem Reinraum. Ansonsten in der saubersten Umgebung möglich zu arbeiten. </li><li> Besorgen Sie sich eine Kunststoff-Petrischale (oder andere saubere Einweg-Container) mit ≥ 13 mm Seiten. </li><li> In diesem Gericht, gieße 5 g PDMS Härter, gefolgt von 50 g PDMS basE-Agent (oder irgendetwas mit einem Verhältnis von 1:10, die meist füllen wird die Petrischale). Mischen Sie gründlich mit einem Einweg-Kunststoff-Pipette oder Stange. </li><li> Blasen entfernen, indem man die Misch PDMS in einer Kammer mit einer Vakuumleitung, Anlegen von Vakuum bis Blasen mehr aus Gemisch (ca. 30 min). </li><li> Falls nicht bereits in der Petrischale gießen PDMS in Petrischalen, die Vermeidung Erzeugung von Luftblasen. </li><li> Heilung über Nacht auf einer Heizplatte bei&gt; 50 ° C (höhere Wärme für weniger Zeit geht auch). </li><li> Mit neuen / sauberen Rasierklinge vorsichtig schneiden Sie ein rechteckiges Stück ca. 2,5 x 2,5 cm, halten Oberfläche so sauber wie möglich. Ziehen Sie mit einer sauberen Pinzette. Schneiden Sie eine Kante (bis 1,5 cm), indem Sie unten auf Rasierklinge in einer Bewegung, bis Oberkante so scharf wie möglich zu machen (dies wird der in der Rakelverfahren verwendet Kante sein). </li><li> Reinigen mit Aceton, Methanol, Isopropylalkohol und Reinstwasser DI-Wasser, und dann föhnen mit sauberem Stickstoffgas. Bewahren Sie in einem sauberen Petrischale. </li></ol> 3. Herstellung von Vesikeln <ol><li> Sammeln Lipidstammlösungen von 25 mg / ml Ei-Phosphatidylcholin (PC) und 1 mg / ml 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin-N - (Lissamingrün Rhodamin B sulfonyl) Ammoniumsalz (Rho-DPPE) in Chloroform und eine 0,5 mg / ml Stammlösung von Monosialogangliosid GM1 in Chloroform / Methanol (2:1 v / v). </li><li> In einem kleinen Glasfläschchen stellen eine Mischung, die 97 Mol-% PC führt, 2 mol% GM1 und 1 Mol-% DPPE-Rho durch Zugabe von 18,9 &amp;mgr; l von 25 mg / ml PC, 39,6 ul 0,5 mg / ml GM1 und 7,9 ul 1 mg / ml Rho-DPPE mit Glasspritzen. </li><li> Hinweis:. Das Zusatzmaterial für Nair et al 25 eine ausgezeichnete anpassbare Excel-Tabelle für die Berechnung der Mengen von Lipiden erforderlich, um Vesikel beliebiger Zusammensetzung erstellen, enthält. </li><li> Zeigen Fläschchen im Vakuumtrockenschrank und das Lösemittel durch Verlassen der Ampulle unter Vakuum für 6 Stunden. </li><li> Stellen einer wässrigen Lösung von 0,1M NaCl. 0,5 ml der 0,1 M NaCl-Lösung in das Fläschchen, das das getrocknete Lipidfilm. </li><li> Lassen Sie die wässrigen Lipid-Mischung über Nacht ruhen. </li><li> Vortexen mischen, um eine Vesikelsuspension schaffen, dann beschallen für 20 min in einem Ultraschallbad bei Raumtemperatur. </li><li> Extrudieren der Vesikel Suspension durch eine Polycarbonatmembran mit 100 nm Porengröße. Übergeben Sie die Vesikelsuspension durch den Filter 17x. </li><li> Speichern der extrudierten Vesikel in einem Glasfläschchen bei 4 ° C </li></ol> 4. Bildung von sphärischen Unterstützte Lipiddoppelschichten <ol><li> Sammeln Sie 700 nm Durchmesser SiO 2-Kugeln. Die Perlen werden in destilliertem Wasser mit einer Stammkonzentration von 1,4 x 10 11 Perlen / ml geliefert. </li><li> In einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen bereiten eine 1 ml Partikelsuspension mit einer Konzentration von 1,5 x 10 10 Perlen / ml durch Zugabe von 107 ul Wulst Stammlösung auf 893 ul 0,1 M NaCl. </li><li> Mischen Sie den Suspension, um sicherzustellen, es ist gut, mixen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1700 g für 20 min dann den Überstand verwerfen. Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml 0,1 M NaCl. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal gründlich waschen die Perlen. </li><li> Die SSLBs bilden, in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen werden 25 ul der SiO 2-Partikelsuspension zu 200 ul von 1 mg / ml Vesikel-Suspension. Vortex die Mischung und lassen Sie stehen für 1 h bei Raumtemperatur. In dieser Phase sollte die Konzentration SSLB 1,7 x 10 9 SSLBs / ml. </li><li> Zentrifuge bei 1700 g für 20 min, um die SSLBs zu pelletieren. Das Pellet sollte rosa aufgrund der Ruptur der Vesikel mit Rho-DPPE auf den Perlen erscheinen. </li><li> Verwerfen des Überstandes und Resuspension in 225 &amp;mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH = 7,4. Wiederholen Sie die Schritte 4,6-4,7 zwei weitere Male, um alle unruptured Vesikel von der SSLB Suspension zu entfernen. </li></ol> 5. Versammlung SSLB Array <ol><li> Cleave Wafer von Mikrowell-Arrays was in rechteckige Stücke mit 4-6 microwell Arrays pro Stück. </li><li> Vortex mischen SSLB Aufhängung, dann legen 10 ul SSLB Suspension auf jede Mikroarrays. Lest Rest für 1 Stunde, damit SSLBs, an die Oberfläche zu begleichen. </li><li> Waschen Sie vorsichtig die Mikrowell-Array-Chip mit PBS aus einer Waschflasche, dann in einem PBS-Bad in einer flachen Schale vorbereitet einzutauchen. </li><li> Während untergetaucht ist, setzen die PDMS Rakel bündig auf dem Mikrowell-Array-Chip und ziehen Sie sie vorsichtig entlang der Oberfläche 5x bis SSLBs, die nicht in Mikro immobilisiert sind zu entfernen. </li><li> Fassen Sie die Mikrowell-Array-Chip mit einer Pinzette und schütteln in der PBS-Bad, um überschüssige SSLBs entfernen. </li><li> Schnelles Entfernen des Chips von der Rakel Bad und in ein frisches PBS-Bad bis zur weiteren Verwendung. Achten Sie darauf, die Oberfläche des Chips, um die nassen SSLBs erhalten bleibt. </li></ol> Hinweis: Die oben beschriebene Montageverfahren kann verwendet werden, um Arrays von natürlichen Membran-Teilchen zu erzeugen, wie Myelin Partikel aus Maushirn oder pho isoliertspholipid Vesikel ohne die SiO 2-Träger Perle. Diese Arbeit wird im Detail in Wittenberg et al. 21 beschrieben und repräsentative Ergebnisse sind unten dargestellt. 6. Cholera Toxin-Bindungsassay <ol><li> Vorbereitung einer 2 mg / ml Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. </li><li> Es wird eine Lösung mit der gewünschten Konzentration von Alexa 488-konjugierten Choleratoxin B-Untereinheit in PBS mit 2 mg / ml BSA. </li><li> Entfernen Sie die SSLB-Array-Chip aus dem PBS-Bad und Docht meisten der PBS-Lösung entfernt mit einem Labor zu wischen. Lassen Sie gerade genug PBS auf dem Chip zu halten, der SSLB Array mit Feuchtigkeit versorgt. </li><li> Um nichtspezifische Bindung zu verhindern, 200 ul 2 mg / ml BSA Lösung des SSLB Array-Chip. Ruhen lassen für 1 Stunde in einer feuchten Box. </li><li> Mit einer Mikropipette entfernen 200 ul-Lösung von der Spitze der SSLB Array-Chips. </li><li> In 200 ul von Choleratoxin Lösung des SSLB Array Chip und ruhen lassen für 1 Stunde in einer feuchten Box. </li><li> Waschen Sie vorsichtig die SSLB-Array-Chip mit PBS aus einer Waschflasche um ungebundenes Cholera-Toxin zu entfernen. </li><li> Wick überschüssige PBS mit einem Labor zu wischen. Vor Bildgebung Abdeckung Chip mit einem 24 mm x 40 mm Deckglas. </li><li> Bild-Arrays mit einem aufrechten Mikroskop mit Filtersätze für die Fluorophore von Interesse angemessen. </li><li> Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität einzelner SSLBs in einem Array mit der automatisierten Partikelanalyse-Funktion von ImageJ Software. </li><li> Kompilieren mittleren Fluoreszenzintensitäten von einzelnen SSLBs in Histogramme, die die Intensitäten der SSLBs auf einem bestimmten Array gefunden zusammenzufassen. </li></ol>

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H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Curved+Membranes+Recruit+Amphipathic+Helices+and+Protein+Anchoring+Motifs.">How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).</li><li>Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+G-Protein-Coupled+Receptors+in+Cell-Derived+Plasma+Membranes+Supported+on+Porous+Beads.">Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb offen zu legen.

In dieser Arbeit wird gezeigt, dass monodisperse SiO 2-Kugeln mit unterstützten Lipiddoppelschichten überzogen werden können, ohne die Notwendigkeit von Zielliganden auf den Lipid-Doppelschichten und der Substratoberfläche in Mikrotiterplatten Arrays angeordnet werden, und die Anordnungen können zur Charakterisierung von Toxin-Lipid-Wechselwirkungen verwendet werden. Die Dissoziationskonstante wir CTx/GM1 Bindung berechnet vergleicht vorteilhaft, da die großen Unterschiede der Werte in der Literatur, mi...

Lipid-Doppelschicht-Membranen sind wesentliche Strukturen in der Natur. Zellplasmamembranen und Organellen-Membranen sind aus Lipid-Doppelschichten, die eine Reihe von Molekülen, die für das Leben notwendig sind, zusammengesetzt zu integrieren. Viele lebenserhaltenden Prozesse auf der Oberfläche von Zellen vorkommen oder durch Moleküle mit Lipid-Doppelschichtmembranen assoziiert vermittelt. In der Tat sind viele Arzneimittel Ziel Prozesse oder Moleküle auf oder in Membranen 1,2 gefunden. Es ist daher notwendig, analytisch untersuchen Prozesse wie chemische Reaktionen oder nichtkovalente Bindungsereignisse, die auf Membranoberflächen auftreten. Da die natürlichen Membranen kann schwierig sein, mit Sensoren zu isolieren und / oder eine Schnittstelle sein, viele Forscher beschäftigen vereinfachte Modellmembranen zur Durchführung von analytischen Studien. Eine Anzahl von Modellmembransysteme sind in der Literatur beschrieben, von Riesenvesikeln, die zehn bis hundert Mikrometer im Durchmesser, um Liposomen mit nanoskaligen Abmessungen 3,4 sein kann. Alternverhältnismäßig planaren Lipid-Doppelschichten auf festen Trägern abgeschieden, dh unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs), können auf einer Reihe von verschiedenen Oberflächen hergestellt werden und wurden vielfach in der biophysikalischen, biochemischen und analytischen Anwendungen 5 verwendet. Koppeln SLBs mit elektrischen oder optischen Materialien ermöglicht Untersuchung von Membran Biochemie und Biophysik durch die Verwendung von verschiedenen analytischen Techniken. Fluoreszenzmikroskopie 6, 7 der Elektrochemie, optische Spektroskopie 8, 9 der Rastersondenmikroskopie, Oberflächen-Plasmon-Resonanz 10 und Massenspektrometrie 11 wurden alle verwendet, um die Struktur und Eigenschaften von SLBs zu studieren. SLB-Arrays bieten zusätzliche Flexibilität bei der Gestaltung von Sensoren für die Multiplex-Assays 12,13. Andere Anwendungen verwenden SLB-Arrays, um die Verbindung, die zwischen Immunzellen 14 bildet imitieren. Aufbereitungsmethoden für SLB-Arrays wurden aus microFlu variiertidic nähert sich 15 bis diejenigen, die physikalischen Barrieren zwischen benachbarten SLB-Patches zu verwenden. Andere Gruppen haben 16 Druckverfahren verwendet, 17, 18 und photochemischen Strukturierung verschiedener Nanotechnik nähert sich 19 bis SLB-Arrays erstellen. In diesem Papier und begleitende Video zeigen wir ein Verfahren zur Bildung SLB-Arrays durch Aufbringen von SLB-beschichtete SiO 2-Kugeln in geordnete Reihen von Vertiefungen 20. Wir verweisen auf die SLB-beschichtete SiO 2-Kugeln als Kugel unterstützt Lipid-Doppelschichten (SSLBs). Diese Technik ist eine Erweiterung der früheren Arbeit, die Arrays von Phospholipid-Vesikeln und Biomembranen aus natürlichen Quellen, 21, aus dem wir zeigen auch, beispielsweise Ergebnisse abgeleitet erstellt. Andere Methoden zum Ordnen Biomembran Partikel oder Vesikel auf Mustern der spezifischen Targeting-Liganden auf Oberflächen, die mit komplementären Liganden auf der Vesikel-Oberfläche enthalten assoziieren verlassen. Beispiele sind Biotin-Avidin Verein 22,23 und DNA-Hybridisierungssysteme 24. Unser Ansatz erfordert nur eine Mikrowell-Array ohne Targeting oder Erkennungsgruppen erforderlich. Die Größe SSLBs wird durch den Durchmesser der SiO 2-Trägern Wulst, die eine geringe Polydispersität aufweisen definiert. Durch die Abstimmung der Mikrowell-Durchmesser, nur größer als der Durchmesser SSLB, setzt sich nur eine einzige SSLB in jede Vertiefung. Ein Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Rakel entfernt dann von der Oberfläche SSLBs alle, die nicht in Mikro immobilisiert sind. Die Streifen und die daraus resultierende SSLB Arrays hoher Dichte (~ 10 5 SSLBs / mm 2) mit 3 um Mitte-zu-Mitte-Abstand und Sechskant Periodizität. Abscheiden von seriell SSLBs mit unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen ist es möglich, Mehrkomponenten-Arrays mit zufällig positionierten SSLBs erstellen. Um die Erfassungsfähigkeit SSLB Arrays zeigen, haben wir die Wechselwirkung von Choleratoxin (CTX) mit einem Gangliosid (GM1) in die SSLBs aufgenommen. Mitnatürlichen Membranpartikel, waren wir in der Lage, zellspezifische Lipide im Mehrkomponenten-Arrays enthalten Membranmaterial aus zwei unterschiedlichen Zelltypen zu detektieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">4-inch silicon wafers</td>
			<td style="width:91px;">University Wafer</td>
			<td align="right" style="width:119px;">425</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">SPR955-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Shipley MICROPOSIT CD-26 developer</td>
			<td style="width:91px;">MicroChem</td>
			<td style="width:119px;">CD-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">i-line stepper</td>
			<td style="width:91px;">Canon</td>
			<td style="width:119px;">2500 i3 stepper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vision 320 reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Advanced Vacuum</td>
			<td style="width:119px;">Vision 320 RIE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Deep trench reactive ion etcher</td>
			<td style="width:91px;">Plasma Therm</td>
			<td style="width:119px;">SLR-770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Atomic layer depostion system</td>
			<td style="width:91px;">Cambridge NanoTech</td>
			<td style="width:119px;">Savannah</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit</td>
			<td style="width:91px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:119px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">egg phosphatidylcholine</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:239px;">1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810158C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">monosialoganglioside GM1&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">860065P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Silica beads</td>
			<td style="width:91px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">SS03N/4666</td>
			<td>Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C-34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate</td>
			<td style="width:91px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">NL1326R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">FM1-43</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">T-3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Eppendorf MiniSpin centrifuge</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-401-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of biomembrane microarrays with a squeegee-based assembly method

Lipid-Doppelschichtmembranen zu bilden, die Plasmamembranen der Zellen und definieren die Grenzen der subzellulären Organellen. In der Natur werden diese Membranen sind heterogene Gemische von vielen Arten von Lipiden, enthalten membrangebundene Proteine ​​und sind dekoriert mit Kohlenhydraten. In einigen Experimenten, ist es wünschenswert, die biophysikalischen oder biochemischen Eigenschaften der Lipiddoppelschicht von denjenigen der natürlichen Membran entkoppeln. Solche Fälle erfordern die Verwendung von Modellsystemen, wie Riesen-Vesikel, Liposomen oder unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs). Arrays von SLBs sind für Sensoranwendungen und imitiert die Zell-Zell-Interaktionen besonders attraktiv. Hier beschreiben wir ein neues Verfahren zur Bildung SLB-Arrays. Submicron-Durchmesser SiO 2-Kugeln werden zunächst mit Lipid-Doppelschichten beschichtet, um sphärische SLBs (SSLBs) zu bilden. Die Kügelchen werden dann in einer Anordnung von Mikro hergestellt Submikron-Durchmesser Vertiefungen abgeschieden. Die Herstellung Technik verwendet eine &quot;Rakel&quot;, um die Substratoberfläche zu reinigen, während leaving hinter SSLBs, die in Mikrovertiefungen niedergelassen haben. Dieses Verfahren erfordert keine chemische Modifikation des Mikrovertiefungs Substrat, noch eine besondere Zielliganden auf der SSLB. Mikrowells durch einzelne Perlen besetzt, weil der Durchmesser gut abgestimmt ist, nur größer als der Kugeldurchmesser sein. Typischerweise mehr 75% der Brunnen belegt sind, während der Rest leer bleiben. In Puffer SSLB Arrays anzuzeigen langfristige Stabilität von mehr als einer Woche. Mehrere Arten von SSLBs können in einem Array von seriellen Abscheidung gebracht werden, und die Anordnungen können zum Abtasten verwendet werden, was wir demonstrieren durch Charakterisierung der Wechselwirkung von Choleratoxin mit Gangliosid GM1. Wir zeigen auch, dass die Phospholipid-Vesikel ohne den Wulst Stützen und Biomembranen aus zellulären Quellen kann mit dem gleichen Verfahren angeordnet werden und Zell-spezifischen Membran-Lipide identifiziert werden.

Wenn SiO 2-Kugeln werden mit einer Lösung von Vesikeln aus Phospholipiden, fluoreszierende Lipide und andere Lipide, wie Gangliosiden zusammen gemischt, reißen die Vesikel auf der SiO 2-Oberflächen SSLBs Wulst zu bilden, wie schematisch in Fig. 1a gezeigt. Nach dem Waschen der SSLBs wird ein Tropfen der Lösung SSLB auf einer Mikrowell-Array platziert, und die Perlen dürfen an der Oberfläche absetzen. (Fig. 1B1) Dies kann auch mit einer Suspension von Phosphol...

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Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Unterstützten Lipiddoppelschichten und natürlichen Membran Teilchen sind praktisch Systeme, die die Eigenschaften von Zellmembranen annähern kann und in einer Vielzahl von Analysestrategien eingearbeitet werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays der unterstützten Lipiddoppelschicht beschichtete SiO 2-Kugeln, Phospholipid-Vesikel oder natürlichen Membranpartikeln.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K Aufrufe.  University of Minnesota.  Unterstützten Lipiddoppelschichten und natürlichen Membran Teilchen sind praktisch Systeme, die die Eigenschaften von Zellmembranen annähern kann und in einer Vielzahl von Analysestrategien eingearbeitet werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays der unterstützten Lipiddoppelschicht beschichtete SiO 2-Kugeln, Phospholipid-Vesikel oder natürlichen Membranpartikeln. 

Serie: Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gold Nanostar Synthesis mit einem Silver Seed vermitteltes Wachstum Methode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Forschung

Biotechnik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.