Research reported in this publication was supported by The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory&#8217;s Research and Exploratory Development Department, Office of Technology Transfer, and Stuart S. Janney Fellowship Program, in addition to the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number R21HL127355.

1. Die Verarbeitung von SLNs <ol><li> Synthese von SLNs Hinweis: Mit der PIT-Methode 1,17,20, um die Unter 20 nm SLNs 1 vorzubereiten. <ol><li> Verwenden Sie aseptisch, Bioreagenzien oder Zellkultur-Reagenzien und sterilen Materialien (dh, Pipetten, Spatel, Fläschchen, etc.). </li><li> Verwenden Sie ein Biosicherheitswerkbank für die Synthese von SLN (Abbildung 2). </li><li> Kombinieren 0,6 mg Fluoreszenzfarbstoff (Nile Red (NIR) ist NiR Konzentration etwa 0,3 mg / ml) und 0,10 g Heneicosan (Lipid, 5 w / w% Lipid-Konzentration) in einem Glasfläschchen (15 ml), Co-Schmelze mit 90 ° C und umrühren. </li><li> Hinzufügen 0,11 g Polyoxyethylen (10) oleylether (Tensid, 5,5 Gewicht / Gewicht% Tensidkonzentration). Co-Schmelzen der resultierenden Mischung bei 90 ° C und rühren. </li><li> Hinzufügen 1,79 g steriles Wasser zu der Mischung, Erhitzen auf 90ºC und Rühren, bis eine transparente Nanoemulsion gebildet. Hinweis: Unter fortgesetztem Rühren und kontrollierte Kühlung, SLNs erzeugt. Diese Bedingungen verursachen eine Inversion der Wasser-in-Öl-Emulsion zu einer Öl-in-Wasser-Emulsion. Lipophile Moleküle wie NiR Partition auf die Lipidtröpfchen. </li><li> Bereiten Sie eine Nanoemulsion parallel ohne Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffs, um als Kontrollprobe zu dienen. Kombinieren 0,10 g Heneicosan und 0,11 g Polyoxyethylen (10) oleylether in ein Fläschchen (15 ml) Co-Schmelze bei 90 ° C und umrühren. <ol><li> Hinzufügen 1,79 g steriles Wasser zu der Mischung, Erhitzen auf 90ºC und Rühren, bis eine transparente Nanoemulsion gebildet. </li></ol></li><li> Weitere Sterilisierung jedes Nanoemulsion mit einer sterilen 0,2 um Filter. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Synthese von SLN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53102/53102fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </li><li> Teilchengröße und Polydispersity <ol><li> Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung (DLS), um die Teilchengröße und Polydispersität der SLN 1 unter Verwendung einer Glasküvette und ein Gerät zur Partikelgröße zu messen messen. </li><li> Vor den Messungen der Proben zu messen, die Teilchengrößen der beiden bekannten Normen nach Herstellerprotokoll für die Standards Vorbereitung und Messung. </li><li> Füllen Sie das Glas Küvetten mit 1,5 ml Standardlösung und messen Sie die Standardlösung mit den gleichen Messbedingungen wie die Proben. Hinweis: Vorheriger Schritt wurde für jeden Standard wiederholt. </li><li> Messen Sie die Proben vorbereitet. Für jeden, die folgenden Versuchsparameter: eine Laufzeit von 100 sec, Brechungsindex von Wasser (1,33), die Viskosität von Wasser bei 20 ° C (1.002 mPa · s). Anmerkung: Diese Technik verwendet frequenzverschobenen Lichts, um die Größe der Nanopartikel zu messen. </li><li> Berichten über den mittleren Teilchendurchmesser und Polydispersität particle Größenverteilung. </li></ol></li><li> Schmelzpunkt und latente Schmelzwärme <ol><li> Verwenden eines Differential-Scanning-Kalorimeter (DSC) mit einem Auto-Sampler und Flüssigstickstoffkühlquelle ausgestattet, um das thermische Verhalten von SLNs 1 zu untersuchen. </li><li> Pipettieren Sie den bei der Herstellung SLNs in einen 40 ul Aluminiumschale mit einer Masse von etwa 25 mg und hermetisch abzudichten die Pfanne mit einer Universal crimper drücken, um den Feuchtigkeitsverlust während der DSC-Scan zu minimieren. </li><li> Messen jedes Nanoemulsion 5 bis 80 ° C. </li><li> Bericht der Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme aus dem DSC-Diagramm, wo das Tal stellt den Schmelzpunkt und das Integral der Fläche unter der Kurve in der DSC-Diagramm, geteilt durch die Menge des Materials stellt die latente Schmelzwärme. </li></ol></li></ol> 2. SLNs Wechselwirkungen mit Fibroblasten und dendritischen Zellen <ol><li> Kultur von primären humanen Fibroblasten <ol><li> Kultur primären humanen fiFibroblasten gemäß den Anweisungen des Herstellers in einem flüssigen Medium für die Kultur von humanen dermalen Fibroblasten (Medium 106) mit der niedrigen Serum-Wachstumsergänzung (LSGS) -Kit ergänzt. Aufrechtzuerhalten Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C, 5% CO 2 und Subkultur bei Erreichen 80% Konfluenz. </li><li> Für beide MTT und Bildanalyse, Samenzellen in einem 96-Well-Platte, bei einer Dichte von 2 × 10 4 Zellen pro Vertiefung, und lassen Sie sie bei 37 ° CO / N vor der SLN Belichtung ausgleichen lassen. </li><li> Zum Zeitpunkt Null, verdünnter SLNs in Komplettmedium ab (Abbildung 4), in Bezug auf Lipidkonzentration und Zugabe von 10 ul pro Vertiefung an jedem Replikat auch in der 96-Well-Platte. </li><li> Aufrechtzuerhalten Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 während der Inkubationszeit. </li></ol></li><li> MTT Toxizitätstest <ol><li> Nach 24 h Inkubation mit SLNs bestimmen zelluläre Lebensfähigkeit unter Verwendung des MTT-Assay nach dem Protokoll des Herstellers. &lt;/ li&gt; <li> Waschen Sie die Zellen einmal und fügen Sie frisches Medium in jede Vertiefung (100 ul / Vertiefung). Getötet Kontrolle Wells durch Inkubation in einer 70% igen Methanol-Lösung für 10 min vor dem Ersetzen mit frischem Medium. </li><li> Hinzufügen MTT-Reagens (10 ul pro Vertiefung) zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte und Inkubieren O / N bei 37 ° C. </li><li> Nach O / N Inkubation solubilisieren intrazellulärem Formazin Kristalle mit dem vorgesehenen Detergenslösung (100 ul pro Vertiefung) gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Nach 3 h Inkubation bei RT erhalten Absorptionswerte bei einer Meßwellenlänge von 570 nm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät. Anmerkung: MTT-Reagenz verwendet wird, sollte weniger als 1% (w / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid. </li></ol></li><li> Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Zu bestimmten Zeitpunkten nach der Dosierung von Fibroblasten mit SLN, wäscht die Fibroblasten zweimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und fixieren 10 min mit kaltem 70% igem Methanol. </li><li> Nach 10 min, Ersetzen Sie das Methanol mit PBS und die Aufnahmen mit einem inversen Mikroskop, mit einem Bandpass (BP) 690/50-nm-Filter-Set. </li></ol></li><li> Kultur von Knochenmark der Maus Dendritic Cells <ol><li> Induzieren Maus-Knochenmark gewonnene dendritische Zellen (BMDC) wie zuvor beschrieben 23,24. Kurz gesagt, Platte Einzelzellsuspensionen von C57BL / 10 Knochenmark in 100 mm Petrischalen bei 2 × 10 6 / Platte mit rekombinantem murinen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF, 300 U / ml) und rekombinantem murinem IL-4 (B-Zell-stimulierender Faktor, 200 U / ml). Ändern Medien alle 3 Tage. </li><li> Am 7. Tag hinzuzufügen NiR belastet SLN auf die Schalen in einer Endkonzentration von 0,5 und 5,0 ug / ml Lipid und Aufrechterhaltung der Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator für die gewünschte Dauer der Exposition. </li><li> Sammeln Zellen von den Schalen durch Ansaugen alle Medien in der Platte gesammelt wird in ein 50 ml Röhrchen, gefolgt von gründlichem Waschen der Platte (lose ad verdrängenrente Zellen) mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 4 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Sammeln Sie die erhaltene Zellsuspension in der gleichen 50-ml-Tube. </li></ol></li><li> Beurteilung der SLNs Incorporation über Durchflusszytometrie <ol><li> Bestimmen Sie die Konzentration des in Punkt 2.4.3 erhaltene Zellsuspension und vertreiben 3x10 5 Zellen in eine 12 mm x 75 mm Rund FACS-Röhrchen. </li><li> Die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml PBS und anschließendem Zentrifugieren der Röhrchen für 5 min bei 400 · g, bei einer Temperatur von 4 ° C. </li><li> Der Überstand verworfen und das Pellet mit 100 ul PBS / 2 mM EDTA / 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) (Färbepuffer) mit anti-CD11c-FITC monoklonalen Antikörper (0,25 ug / ml final). Inkubieren für 30 min auf Eis im Dunkeln. </li><li> Die Zellen werden mit 1 ml PBS und dann zentrifugieren Röhrchen 5 min bei 400 · g, bei einer Temperatur von 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren jedesPellet mit 400 &amp; mgr; l Färbepuffer. Die Zellen sind nun bereit für die Übernahme der Proben mit einem Durchflusszytometer (möglicherweise mit blauen und roten Lasern ausgestattet ist). </li><li> Mit Hilfe der Durchflusszytometrie-Analyse-Software, zu bewerten den Grad der Einbeziehung der SLN von DC durch Gating auf die Bevölkerung von CD11c + Zellen (FITC positiv) und Vergleichen der Intensität der SLN-assoziierte Fluoreszenz (in der PerCP-Cy5.5 oder APC-Kanälen gemessen). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In dieser Studie wurden die Synthese SLNs und ihre Anwendbarkeit für eine intrazelluläre Targeting-Anwendungen erforscht. Diese biokompatible Nanopartikel versprechen als Lieferfahrzeuge für mehrere Anwendungen einschließlich der Arzneimittelabgabe, Gen-Silencing, und Impfstoff-Technologien 25-30 gezeigt. Ultrakleine SLNs wurden unter Verwendung eines einfachen Prozesses hergestellt, und ihre Wechselwirkungen mit primären Hautzellen und primären Immunzellen wurden untersucht. SLNs wurden zur Verkapselun...

Nanopartikel-basierten Lieferfahrzeuge haben ein großes Versprechen für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen gezeigt, die Bereitstellung eines Mechanismus, um gezielt zu verändern zellulären Signaltransduktion und Genexpression. Diese Fahrzeuge können mit Medikamenten, Proteinen und Nukleinsäuren, einen Aufprall zellulären Reaktionen und erreichen eine gewünschte Wirkung auf Zielgewebe beladen werden. Viele Arten von Nano zu therapeutischen und diagnostischen Nutzen, einschließlich Lipide, Polymere, Silizium und magnetischen Materialien untersucht worden. Diese Systeme sind attraktiv aufgrund ihres Potentials zur lokalisierten Arzneimittelabgabe, erhöhten therapeutischen Konzentration im Zielgewebe, und eine Verringerung der systemischen Toxizität. Feste Lipidnanopartikel (SLN) sind ein gut untersuchtes Beispiel einer Nanopartikel-Abgabesystem, das als vielversprechende Arzneimittelabgabevehikel in den letzten Jahren abzeichnet. SLNs kann leicht für mehrere Anwendungen einschließlich Bio-Sensing 1, Kosmetika 2 und t formulierenherapeutic Lieferung 3-7. Ihr Nutzen ergibt sich aus der Tatsache, dass sie vollständig aus resorbierbaren, ungiftig Lipiden, was zu einer verbesserten Biokompatibilität. Während der Synthese können lipophile Medikamente in SLN Fahrzeuge aufgenommen werden, wodurch Arzneimittellöslichkeit und Eignung Erhöhung für die parenterale Verabreichung. SLN Fahrzeugen auch dazu beitragen, eingekapselt Therapeutika zu stabilisieren, wodurch deren Abbau und Freiraum, und die Maximierung der therapeutischen Wirkung. Diese Fahrzeuge sind vor allem für Langzeitwirkung, kontrollierte Trennöle gut geeignet aufgrund ihrer Stabilität bei Körpertemperatur 3,4,8,9. Wichtiger ist, Verkapselung von Wirkstoffen in Lipidnanopartikel ändert die intrinsische die pharmakokinetischen Profile der Arzneimittelmoleküle. Dies bietet einen Vorteil, indem sie die kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen mit einem engen therapeutischen Index. Die Freisetzungsrate des SLN-einge Therapeutika kann abgestimmt basieren auf der Lipidabbaurate oder das Medikament Diffusionsgeschwindigkeit in dieLipidmatrix. SLNs werden oft entwickelt, um in spezifischen Zielgeweben ansammeln. Beispielsweise ihre Größe (typischerweise größer als 10 nm) potenziert Retention im Blutkreislauf, wobei der Leaky-Vaskulatur Tumorgewebe erleichtert Abscheidung. Darüber hinaus hat der Weg der Verabreichung Partikel wurde gezeigt, daß die biologische Verteilung, die das Potenzial zu verändern, wie Lymphknoten 10,11 um spezifische physiologische Zielstrukturen. Bei der Abscheidung in Zielgeweben zu erzielen geeigneten zellulären Wechselwirkungen und eventuelle Internalisierung von Nanopartikeln ist schwierig aufgrund der Fähigkeit der Zellmembranen, um den Fluss von Ionen und Molekülen in die und aus der Zelle 12 selektiv zu steuern. Um die zelluläre Aufnahme zu erleichtern, ist es möglich, Nano mit spezifischen Liganden einschließlich Peptiden, kleine Moleküle, als auch monoklonale Antikörper 13,14 modifizieren. Verschiedene Mechanismen, die sowohl passive Penetration und aktiven Transport von Nanopartikelnüber die Zellmembran sind zuvor beschrieben worden 3,12,15. Im allgemeinen hat es sich gezeigt, daß zell Nanopartikel Wechselwirkungen werden durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Nanopartikel einschließlich der Größe, Form, Oberflächenladung und Oberflächenchemie beeinflusst neben zellspezifischen Parameter wie Zelltyp oder Zellzyklus-Phase 12. Eine frühere Untersuchung zeigte die Synthese von Sub-10 nm SLNs zur topischen 16 und Biomarker-Erkennungsanwendungen 1 unter Verwendung der Phaseninversionstemperatur (PIT) Verfahren 17. Dies ist eine schonende Syntheseverfahren, wobei 2 die Zusammensetzung konstant bleibt, während die Temperatur allmählich verändert wird. Kontinuierliches Rühren der erhitzten Lösung beim Abkühlen auf Raumtemperatur führt zu einer Nanoemulsion. Dieses Verfahren resultiert in der Synthese von SLNs mit kleinerer Teilchengrße 1 als die zuvor unter Verwendung verschiedener Verfahren für die Synthese von Lipid nan gemeldetoparticles 17-22. Die resultierende Größenskala von weniger als 20 nm beträgt, stellt einen Vorteil für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen aufgrund der erhöhten Oberfläche und dem Potential für erhöhte zelluläre Interaktionen. Eine schematische Darstellung SLNs designt einen fluoreszierenden Farbstoff oder therapeutischen liefern, ist in Abbildung 1 dargestellt. Die SLN bestehen aus einer Lipid Innenraum (zB lineares Alkan), die die Einarbeitung von lipophilen Verbindungen (beispielsweise Farbstoffe oder Therapeutika) und einem Tensid Außen (zB lineares nichtionisches Tensid) von Wasser umgeben ist. In dieser Studie wurden SLNs mit einem Fluoreszenzfarbstoff beladen, und als ein Modell verwendet, um Partikel-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen. Primäre humane dermale Fibroblasten und Maus dendritischen Zellen wurden farbstoffbeladenen SLN über die Zeit ausgesetzt, um Wechselwirkungen im Hinblick auf Toxizität und Partikelaufnahme charakterisieren. A 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) -Assay wurde utilium geeignete Dosierung Ebenen zu etablieren zed. Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie zwei eingesetzt werden, um Partikelaufnahme in vitro zu untersuchen Methoden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des SLN, die die Hauptbestandteile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53102/53102fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nile Red (NiR)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>19123</td>
			<td>BioReagent, suitable for fluorescence, &#8805;98.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heneicosane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>286052</td>
			<td>98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij O10</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6136</td>
			<td>Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td>Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter 0.2 &#181;m Supor Membrane Low Protein Binding</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>PN4612</td>
			<td>Non-Pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanotrac Ultra&#160;</td>
			<td>Microtrac</td>
			<td>serial number U1985IS</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Scanning Calorimeter</td>
			<td>Mettlet-Toledo</td>
			<td>----</td>
			<td>Instument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human fibroblasts&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C-004-5C</td>
			<td>Neonatal (HDFn)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 106</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>M-106-500</td>
			<td>A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S-003-K</td>
			<td>All the components of complete LSGS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>4890-025-K</td>
			<td>Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3,[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safire2 microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>----</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td>For molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine GM-CSF&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>415</td>
			<td>&#62;97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IL-4&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>404</td>
			<td>&#62;97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

solid lipid nanoparticles (slns) for intracellular targeting applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Die PIT-Verfahren wurde verwendet, um die SLN zu synthetisieren und die Phaseninversionstemperatur wurde bestimmt unter Verwendung eines Wasserbades. Die Proben wurden langsam erwärmt und vorsichtig gerührt, bis die Lösung klar erschien. Der Phaseninversionstemperatur für die SLNs unter Verwendung Heneicosan Lipid 45 ° C. Tabelle 1 faßt die Teilchengröße, Polydispersität, Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme für den SLN. Die synthetisierten Verwendung der oben beschriebenen Verarbeitungs...

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Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

16.7K Aufrufe.  The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory. In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions. 