The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. P&#233;bay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. P&#233;bay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. P&#233;bay); Australian Research Council Future Fellowship (A. P&#233;bay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.

Die Sammlung der menschlichen Haarprobe von Personen erfordert ethische Genehmigung durch die menschliche Forschung Ethik-Kommission in den Gasteinrichtungen und sollten in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt werden. 1. Isolierung von Keratinozyten aus Zupfinstrumente Haar <ol><li> Tau-extrazellulären Matrix (ECM) Lösung (dh Matrigel) auf Eis O / N. </li><li> Verwendung vorgekühlte Pipettenspitzen, fügen Sie 200 ul ECM-Lösung zu 12 ml gekühltes DMEM / F12-Medium. Coat eine 12-Well-Platte mit 1 ml verdünnter ECM-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die beschichtete Platte O / N bei 37 ° C. Waschen Sie die beschichtete Platte mit vorgewärmten DMEM / F12-Medium vor der Verwendung. </li><li> Sammeln primären menschlichen Haares von der individuellen Kopf, indem die Finger in der Nähe der Wurzel des Haares und Zupfen Sie die Haare in eine schnelle und gleichmäßige Bewegung. Überprüfen Sie, um zu bestätigen, dass jeder gesammelten Haaren enthält eine intakte Haarfollikel und bestimmen die Wachstumsphase der Haare unDer einem Binokular (Abbildung 1). <ol><li> Sammeln 5-10 Anagenhaare von jedem einzelnen auf Keratinozyten zu extrahieren. Verfahren gezupften Haare so schnell wie möglich zu einer erfolgreichen Ableitung Keratinozyten sicherzustellen. ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt die Morphologie der Haare in unterschiedlichen Phasen des Wachstumszyklus. Anagenhaare ist in der Wachstumsphase mit einer sichtbaren äußeren Epithelschicht die Länge der Haare, da die ORS bekannten Umgebung. Auf der anderen Seite, Telogen Haar stellt Haare in der Ruhephase und muss nicht eine sichtbare ORS, aber hat eine klare Kugel von Zellen für den Wurzel des Haares, als Telogen Ausbuchtung bekannt. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die Haarprobe in eine Petrischale, die 10 ml mit Antibiotika Mix für 5 min bei RT waschen. </li><li> Verwendung sterilisiert Schere und Pinzette, schneiden Sie übermäßigen Haarwelle, so dass ein Haar-Fragment mit einer intakten Haarfollikel und um 0,5 bis 1 cm von Haarschaft. </li><li> Sorgfältig transfer 1 Haar-Fragment in jeder Vertiefung der ECM-beschichtete Platte mit einer Pinzette. </li><li> Unter Verwendung einer 1 ml Pipette ca. 3 Tropfen Knockout Serum Replacement (KSR), Medium (~ 100 bis 200 &amp; mgr; l) zu den Haarproben. Hinweis: Halten Sie das Haar-Fragmente in engem Kontakt zur Plattenoberfläche, um für die Befestigung und die anschließende Keratinozyten Auswuchs zu ermöglichen. Hinzufügen von Seiten übermäßig in diesem Schritt kann bewirkt, dass die Haar-Fragmente zu schweben, und verringert die Chance einer erfolgreichen Haar Befestigung. </li><li> Die Haarproben in einer 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 inkubieren und lassen die Haarfollikel O befestigen / N. Am folgenden Tag, sanft weiteren hinzufügen 3 Tropfen KSR Medium (~ 100 bis 200 &amp; mgr; l), um die Haarproben feucht zu halten. </li><li> Beachten Sie die Haarproben täglich, um zu bestätigen, dass die Haarfollikel erfolgreich angeschlossen. Generell Befestigung der Haarfollikel ist offensichtlich innerhalb von 1-3 Tagen. Dicke Haare sind in der Regel leichter zu befestigen, verglichen mit feinen Haaren, wie feinen Haaren höher habenTendenz zu schweben, die die Befestigung behindern. <ol><li> Sobald das Haar haben auf die beschichtete Platte befestigt ist, fügen Sie 500 ul KSR Medium zum Brunnen. Seien Sie besonders vorsichtig beim Hinzufügen des Mediums als Haarproben möglicherweise nicht fest angeschlossen haben. Von diesem Punkt zu ändern Medien alle 2 Tage. Hinweis: Keratinozyten Auswüchse sollten von der ORS Bereich der Haar-Fragment nach 3-7 Tagen (2A-B) zu sehen sein. Lassen Sie die Keratinozyten bis zu 14 Tage vor aufwachsen Passagieren der Zellen, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. </li></ol></li></ol> 2. Wartung und Passagieren von Keratinozyten <ol><li> Vorstrich eine 6-Well-Platte mit der Beschichtungsmatrix Kit. Fügen Sie 680 ul des Verdünnungsmedium aus dem Kit in jede Vertiefung, gefolgt von 6,8 &amp; mgr; l Beschichtungsmatrix-Lösung. Schütteln Sie die Platte um eine gleichmäßige Verteilung der Beschichtungsmatrix-Lösung auf der Platte sicherzustellen. </li><li> Lassen Sie den beschichtete Platte für 30 min bei RT inkubieren. Entfernendie Beschichtungsmatrix-Lösung vor dem Beschichten von Keratinozyten. </li><li> Dissoziieren Keratinozyten in eine Einzelzellsuspension mit 500 ul 0,25% Trypsin pro Vertiefung für 2-5 Minuten bei 37 ° C. Inaktivierung des Trypsins mit 500 ul Medium, das Serum enthält (beispielsweise fötales Rinderserum (FBS) mittel) und Sammeln in ein steriles 15 ml Röhrchen. Entfernen Sie die Haare Fragment mit sterilisierten Pinzette. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der geernteten Zellen mit einem Hämozytometer. </li><li> Zentrifugieren der Zellen für 3 min bei 200 x g. Die Zellen mit PBS und wiederholen Zentrifugation waschen. Saugen Sie das PBS und Zellpellet in frischem Keratinozyten-Medium. </li><li> Platte um 4 x 10 4 Keratinozyten in ein Well ECM-beschichtete Platte in Gegenwart von Keratinozyten-Medium. Halten die Keratinozyten in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 (Abbildung 2C). Ändern Medien jeden Tag und Passage-Zellen, wenn die Kultur ist ~ 80% konfluent, which kann etwa 2-7 Tage dauern, je nach Durchgang Nummer und Proliferationsrate der Keratinozyten. Die abgeleiteten Keratinozyten sollte erweitert werden, um ausreichend gefroren Aktien unter Verwendung von Standard langsam Einfrieren Kryokonservierung Methoden 16 zu erzeugen. Anmerkung: Die hier beschriebenen Kulturbedingungen unterstützt die Ausdehnung des homogenen Population von Keratinozyten mit typischen Kopfsteinpflastermorphologie (Abbildung 2C). Gelegentlich können ein paar differenzierten Keratinozyten, mit großen und flachen Morphologie und haben replikative Potential verloren, in der Kultur zu beobachten. Charakterisierung von Keratinozyten durch Immunfärbung mit Antikörpern gegen Cytokeratin 14 durchgeführt werden, wie zuvor beschrieben 17. Gegründet Keratinozyten-Zelllinien sollte auch auf Mykoplasmen nach 1-3 Passagen mit kommerziell erhältlichen Kit getestet werden. </li></ol> 3. Erzeugung von hiPSCs von Keratinozyten Mit Episomale Vektoren <ol><li> Vorstrich eine 6-Well-Platte mit0,1% Gelatine (2 ml / Vertiefung). Gelatine mit Mantel für mindestens 20 min bei RT. </li><li> Umprogrammierung Experiment Verwendung Keratinozyten spätestens Gang 6 Dissociate Keratinozyten in eine Einzelzellsuspension mit 1 ml 0,25% Trypsin pro Vertiefung für 2-5 Minuten bei 37 ° C. Inaktivierung von Trypsin mit 1 ml Medium, das Serum (zB FBS-Medium) und sammeln Sie in einem 15-ml-Tube. </li><li> Zentrifuge Zellen für 3 min bei 200 xg und resuspendieren Zellen in Keratinozyten-Medium. Platte 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 pro Vertiefung Keratinozyten in einer gelatinierten Platte O / N. </li><li> Am folgenden Tag (Tag 0), überprüfen Sie die Platte, um sicherzustellen, Zellen 50-60% konfluent. Hinweis: Wenn Keratinozyten weniger als ~ 50% konfluent sie nicht gut nach der Transfektion wachsen könnte. </li><li> Am Tag 0, führen Transfektion der episomalen Vektoren Neuprogrammierung auf die Keratinozyten mit einem Verhältnis von 8 &amp; mgr; Transfektionsreagenz bis 2 &amp; mgr; g Gesamt-Plasmid-DNA.<ol><li> Nehmen 0,5 ug für jeden der 4 Plasmide (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOCT3 / 4-shP53F, pCXLE-hSK, pCXLE-HUL) und in 100 &amp; mgr; l reduziert Serum-Medium (zB OPTI-MEM) verdünnt. Hinweis: Das Plasmid pCXLE-eGFP verwendet, um die Transfektionseffizienz in Keratinozyten zu überwachen und ist nicht für eine erfolgreiche Neuprogrammierung erforderlich. </li><li> Sie 8 ul Transfektionsreagenz zu der verdünnten DNA. Mischen Sie durch Schwenken des Rohres. Lassen Sie die DNA-Reaktionsmischung bei RT 15 min ungestört zu entspannen. </li><li> Ersetzen Sie die Keratinozyten-Medium durch frisches Medium. </li><li> Fügen Sie vorsichtig die DNA-Reaktionsmischung zu Keratinozyten-Kultur und Inkubation in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 für 4 Stunden. Hinweis: Es wird nicht empfohlen, längeren Transfektion O / N in Keratinozyten durchzuführen, da sie geringe Überlebens nach der Transfektion aufweisen. </li><li> Nach 4 Stunden nach der Transfektion, ersetzen Sie die Keratinozyten-Medium durch frisches Medium. </li></ol></li><li> Am Tag 1 (1 Tag nach der transfection), ändern Sie die Keratinozyten-Medium und prüfen Transfektionseffizienz durch Schätzung der Anteil der eGFP positiven Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Typischerweise&gt; 60-70% Transfektionseffizienz für primären Keratinozyten unter Verwendung dieses Protokolls festgestellt. </li><li> Am Tag 2 wiederholen Transfektion, wie in Schritt 3.5 beschrieben. Zwei aufeinanderfolgenden Transfektionen typischerweise erreichen würde&gt; 90% Transfektionseffizienz. Keratinocytenkultur Regel erreicht Mündung bis zum Ende der zweiten Transfektion. <ol><li> Bereiten Sie eine 10 cm Schüssel mit embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder für jede Neuprogrammierung Reaktion. Bereiten mitotisch inaktivierten MEF Feeder wie zuvor beschrieben 18. </li><li> Precoat-10-cm-Schale mit 5 ml 0,1% Gelatine für mindestens 20 min. Platte 4 x 10 6 mitotisch inaktivierten MEF pro 10 cm Schale in FBS-Medium. Lassen Sie die Zellen absetzen und befestigen Sie O / N in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. </li></ol></li><li> Am Tag 3, harWeste die Keratinozyten mit 0,25% Trypsin, wie in Schritt 3.2 und 3.3 beschrieben. Resuspendieren der Keratinozyten in KSR Medium und die Platte 90% der Keratinozyten aus 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte in eine 10 cm MEF Feeder-Gericht mit KSR Medium. </li><li> Von Tag 4 ab, jeden Tag ändern Sie die KSR Medium. <ol><li> Alternativ nach Tag 18, ersetzen Sie jeden zweiten Tag Kulturmedium. Hinweis: Nicht-Keratinozyten umprogrammiert wird aufhören zu vermehren, während hiPSC Kolonien mit definierten Grenze, die menschliche embryonale Stammzellen (hES) ähneln wird ab Tag 14 entstehen - 21. </li></ol></li><li> Isolieren hiPSC Kolonien durch manuelle Dissektion von Tag 21 ab. Vermeiden hiPSC Kolonien, die eng zusammen gruppiert sind und nur hiPSC Kolonien, die sich deutlich von den anderen getrennt werden pflücken. Anmerkung: hiPSC Kolonien können früher aufgenommen werden, aber die Kolonie mit definierten Grenzen möglicherweise nicht zu früheren Zeitpunkten offensichtlich, angesichts der geringen Koloniegröße. Neuprogrammierung Effizienzen zwischen diff variierenErent Patienten Keratinozyten und wird auch durch andere Faktoren wie beispielsweise Durchlaufhäufigkeit bzw. Proliferationsrate der Keratinozyten beeinflusst. <ol><li> Für die manuelle Präparation der hiPSC Kolonien, verwenden Sie eine 26G Nadel hiPSC Kolonien unter einem Binokular geschnitten. Schneiden Sie ein hiPSC Kolonie in kleine Stücke rund 300 bis 600 &amp; mgr; m in der Länge. Übertragen Sie die Stücke von einem hiPSC Kolonie in einen neuen MEF Feeder-Platte (2,5 x 10 4 MEF / cm 2), um eine klonale Linie der hiPSCs etablieren. Zu Beginn jeder Kultur hiPSC klonalen Linie in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte oder Organkulturschalen, erweitern Sie dann bis 6 Well-Plattenformat. </li><li> Pflegen etablierten klonalen Linien hiPSCs in KSR Medium auf MEF Feeder. Sobald der Kultur zu erreichen 70-80% Konfluenz mit hiPSC Kolonien ~ 1,5 mm Durchmesser, Durchgang hiPSCs mit Standard-enzymatische Methoden Passagieren (Accutase, Dispase oder Collagenase IV) gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol></li><li> Charakterisieren gegründet hiPSC Linies Pluripotenz und ihre Fähigkeit, in Zellen Vertreter der drei Keimblätter in vitro und / oder in vivo 13,19 differen bestätigen. Auch routinemäßig etablierten Test hiPSC Linien für Mykoplasmen mit kommerziell erhältlichen Kits zu gewährleisten, dass sie pathogen-frei sind. Genomische Stabilität hiPSC Linien durch Karyotypisierung oder Array-basierte Kopienzahl Variation (CNV) Analyse routinemäßig zu überwachen. </li></ol>

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	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, U141-U141 (2008).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells.">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31, 458-466 (2013).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine.">Generation of induced pluripotent stem cells from urine.</a> J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).</li><li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Peters, A., Zambidis, E., Ye, K., Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16.+Generation+of+nonviral+integration-free+induced+pluripotent+stem+cells+from+plucked+human+hair+follicles.">Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles.</a> Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. , 203-227 (2012).</li><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+the+surface+of+skin+development.">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445, 834-842 (2007).</li><li>Limat, A., Noser, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+cultivation+of+single+keratinocytes+from+the+outer+root+sheath+of+human+scalp+hair+follicles.">Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles.</a> J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).</li><li>Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+keratinocytes+by+simple+transfection+of+episomal+vectors.">Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors.</a> Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).</li><li>Higgins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+hair+follicle+dermal+papilla+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells.</a> J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).</li><li>Muchkaeva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Hair+Follice+Dermal+Papilla+Cells.">Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells.</a> Acta naturae. 6, 45-53 (2014).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen. , (2013).</li><li>Sporl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+membrane+cholesterol+reveals+new+insights+into+epidermal+differentiation.">Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).</li><li>Conner, D. A., et al., Ausubel, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryo+fibroblast+(MEF)+feeder+cell+preparation.">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Current protocols in molecular biology. 23, Unit 23 22 (2001).</li><li>Pebay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+sphingosine-1-phosphate+and+platelet-derived+growth+factor+in+the+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).</li><li>Myung, P., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+bulge+in+hair+regeneration.">Dissecting the bulge in hair regeneration.</a> J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).</li><li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hair+cycle.">The hair cycle.</a> J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy.">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li><li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives:+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper.">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).</li><li>McKernan, R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+point+of+large-scale+collections+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).</li><li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells.">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, U1145-U1112 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+rate+of+somatic+cells+affects+reprogramming+efficiency.">Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency.</a> J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+passage+human+fibroblasts+induced+to+pluripotency+are+capable+of+directed+neuronal+differentiation.">Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation.</a> Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).</li><li>Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+genetic+variation+in+somatic+human+tissues.">Extensive genetic variation in somatic human tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).</li><li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li></ol>

The authors have no conflict of interest.

Erzeugung von patientenspezifischer hiPSCs bietet einen einzigartigen Ansatz für die Untersuchung der Pathogenese in den erkrankten Zelltypen in vitro, und stellt auch eine Plattform zum Wirkstoff-Screening, neue Moleküle, die die Krankheitsphänotypen retten kann identifizieren. Diese Krankheit Modellansatz mit hiPSCs vielversprechende Ergebnisse für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Long-QT-Syndrom, Huntington-Krankheit, Parkinson-Krankheit und amyotrophe Lateralsklerose 22 ergab. M...

Die Entdeckung der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) hat das Gebiet der regenerativen Medizin revolutioniert und bietet eine praktikable Methode zur Erzeugung von patientenspezifischen Stammzellen 1-3. hiPSCs wurden erfolgreich aus verschiedenen Zelltypen, einschließlich Fibroblasten, 4,5, 6,7 hämatopoetischen Zellen, Nieren-Epithelzellen aus Urin 8 und Keratinozyten 9,10 erzeugt. Bisher Haut-Fibroblasten und blutbildenden Zellen stellen die am häufigsten verwendeten Zellquellen zur Erzeugung von patientenspezifischen iPSCs. Dies mag auf die Tatsache zurückzuführen, dass Hautbiopsien und Blutentnahme sind Routine medizinischen Verfahren und großen Biobanken von Patienten Blut oder Hautproben wurden in vielen Ländern etabliert. Im Gegensatz zu den Blutzellen und Hautfibroblasten, die invasive Extraktionsmethoden erfordern, Keratinozyten stellen eine leicht zugängliche Zelltyp für hiPSC Generation. Keratinocytes sind Keratin-reiche Epithelzellen, die das Äußere epidermalen Barriere der Haut zu bilden und werden auch in Nägel und Haare 11 gefunden. Insbesondere kann auf die Keratinozyten der äußeren Haarwurzelhülle (ORS) Haarfollikel von einer externen Zellschicht, die den Haarschaft zusammen mit dem inneren Wurzelscheide (IRS) Zellen (12, Figur 1) abgedeckt ermittelt werden. Wie Haar Sammlung ist ein einfaches Verfahren, das nicht die Unterstützung des medizinischen Personals erfordert, bietet es eine Chance für die Patienten zu sammeln und zu ihren eigenen Haarproben an Laboratorien, die die Sammlung von Patientenproben für hiPSC Generation erheblich erleichtern würde. Epidermiskeratinocyten auch eine höhere Wirksamkeit und eine schnellere Anpassung Umprogrammierung Kinetik im Vergleich zu Fibroblasten, zusätzlich zu den Vorteilen der Verwendung von Keratinozyten, wie die Ausgangszellen für die Erzeugung hiPSC 9,13. Weiterhin kann hiPSCs auch mit anderen Zellpopulationen in der Haarfollikel erzeugt werden,einschließlich der dermalen Papillenzellen an der Basis des Haarfollikels 14,15 entfernt. Frühere Berichte des iPSC Generation mit Haar-abgeleiteten Zellen verwenden häufig retroviralen oder lentiviralen-basierte Verfahren der Reprogrammierung 9,14,15. Allerdings sind diese virale Verfahren einzuführen unerwünschte genomische Integration ausländischer Transgenen während Neuprogrammierung. Im Vergleich dazu ist die Verwendung von episomalen Vektoren, eine Möglichkeit, die nicht-virale Verfahren zum Umprogrammieren Integration freien iPSCs 4 zu erzeugen. Wir haben bereits eine einfache, kostengünstige und nicht-virale Verfahren zur effizienten umprogrammieren Keratinozyten in hiPSCs mit episomalen Vektoren 13 entwickelt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von Keratinozyten stamm hiPSCs, einschließlich der Ableitung von Keratinozyten aus gezupften Haare, Erweiterung und Wartung der Keratinozyten und anschließender Neuprogrammierung zu hiPSCs generieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic Mix:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ng/ml Antimycotic amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942-20ml</td>
			<td>Antibiotic mix is made up in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR) medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% knockout serum replacement (KSR)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; MEM non-essential amino acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.5&#215; Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;bFGF (10 ng/ml, added fresh)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;EpiLife with 60&#160;&#181;M Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M-EPI-500-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Human keratinocyte growth supplement (HKGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE)&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5&#215; Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mM L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular Matrix (ECM):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354234</td>
			<td>Aliquot Matrigel stock and store in -80&#176;C following manufacturer&#8217;s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200&#181;l matrigel for coating a 12-well plate (~150&#181;g/well).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating Matrix Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R-011-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td rowspan="5">Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-eGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27077</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27078</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent Fugene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E231B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td>Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Serum medium: OPTI-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN2613R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Use at 10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
			<td>Use at 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-160 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4360</td>
			<td>Use at 5&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5279</td>
			<td>Use at 5&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td>Use at 10&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Detection kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of integration-free human induced pluripotent stem cells using hair-derived keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

Das Haar durchläuft drei verschiedene Phasen des Wachstumszyklus: Anagenphase (Wachstumsphase), catagen (die Regressionsphase) und Telogen (die Ruhephase) 20,21. Das Anagen Haarfollikel enthält mehrere Schichten von Epithel; Diese Schichten sind die ORS, IRS und den Haarschaft (Abbildung 1). Anagenhaar schließlich einen Übergang zu dem catagen Phase, die durch Apoptose der ORS und Beendigung der Haarschaft Differenzierung gekennzeichnet ist. Schließlich catagen Haar Übergang in die Telo...

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Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

generation-integration-free-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.4K Aufrufe.  University of Melbourne. This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors. 

Serie: Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from various somatic cell types by transducing four Yamanaka transcription factors: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. The study of iPSCs remains at the cutting edge of biological and clinical research. In particular, patient-specific iPSCs can be used as a pioneering tool for the study of disease pathobiology, since iPSCs can be induced from the tissue of any individual. Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease, classified by the destruction of cartilage and bone structure in the joint. Synovial hyperplasia is one of the major reasons or symptoms that lead to these results in RA. Fibroblast-like Synoviocytes (FLSs) are the main component cells in the hyperplastic synovium. FLSs in the joint limitlessly proliferate, eventually invading the adjacent cartilage and bone. Currently, the hyperplastic synovium can be removed only by a surgical procedure. The removed synovium is used for RA research as a material that reflects the inflammatory condition of the joint. As a major player in the pathogenesis of RA, FLSs can be used as a material to generate and investigate the iPSCs of RA patients. In this study, we used the FLSs of a RA patient to generate iPSCs. Using a lentiviral system, we discovered that FLSs can generate RA patient-specific iPSC. The iPSCs generated from FLSs can be further used as a tool to study the pathophysiology of RA in the future.

Here we describe a protocol for generating human induced-pluripotent stem cells from patient-derived fibroblast-like synoviocytes, using a lentiviral system without feeder cells.

Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...