The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.

1. VDJ Amplification 1.1) DNA-Extraktion aus Tumorproben <ol><li> Extrahieren von DNA aus dünnen Abschnitten (10-20 um) eingefroren Oktober eingebettet normalen oder malignen Geweben. <ol><li> Verdauen 10-30 dünne Schnitte von eingebetteten Gewebe von einem Kryostat-Mikrotom in 4 ml Nucleic Lysis Buffer (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2, 0,3 M NaCl, 0,002 M Na 2 EDTA) geschnitten mit Proteinase K (0,5 mg / ml, Endkonzentration ) und 0,625% SDS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen in einem 37 ° C-Wasserbad über Nacht. </li><li> 1 ml gesättigtem NaCl (5 M), um die Verdauung des Gemischs und kräftig schütteln, 15 Sek. </li><li> Zentrifuge bei 1.100 xg für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Den Überstand in ein neues 15 ml Zentrifugenröhrchen und fügen Sie zwei Volumina 100% Ethanol. </li><li> Mischen Sie durch Umdrehen des Röhrchens 6-8 mal. Zentrifuge bei 5000 × g für 60 min bei 4 ° C, um die gefällte DNA zu sammeln. </li><li> Zweimaliges Waschen des DNA-Pellets mit 70% Ethanol. Centrifuge bei 5.000 xg für 15 Minuten jedes Mal, um das Pellet zu erhalten. </li><li> Aufzulösen DNA in 100-400 ul TE-Puffer bei Raumtemperatur auf einem Schüttler über Nacht. Die DNA-Ausbeute beträgt 5 bis 200 &amp; mgr; g (Endkonzentration zwischen 50-500 ng / &amp; mgr; l) in Abhängigkeit von der Größe der Gewebe </li></ol></li><li> Extrahieren von DNA aus dünnen Abschnitten (10-20 &amp; mgr; m) von formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) normalen oder malignen Gewebe. <ol><li> Inkubieren Paraffinschnitte in 1 ml Xylol bei Raumtemperatur zweimal für je 10 min in einem 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen zu de-Paraffin säubern. Sammle die Gewebeschnitte durch Schleudern bei 13.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Abschnitte in 1 ml 100% Ethanol zweimal bei Raumtemperatur inkubiert, 10 Minuten jedes Mal zu Xylolen Rückstände zu entfernen. Sammle die Gewebeschnitte durch Schleudern bei 13.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Das Paraffin wird vollständig an dieser Stelle aufgelöst und nur die Gewebeschnitt verbleibt. </li><li> Der Luft trocknen die Teile bei Raum temperatur für 10-15 min. </li><li> Machen Sie eine 0,5 mg / ml Proteinase K-Lösung mit 1x PCR-Puffer (ab 10x PCR-Puffer mit Nuklease-freies Wasser verdünnt). Füge das Proteinase-K-Lösung zu den Proben in einem Endvolumen von 50-100 ul beimpft und über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Erhitzen Sie die Proben bei 95 ° C für 10 min, um Proteinase K zu inaktivieren Anmerkung: In diesem Schritt wird die DNA-Probe in der PCR-Puffer gelöst und kann in den Schritten 1.2 und 1.3 direkt verwendet werden. Die DNA-Ausbeute beträgt 0,5 bis 20 &amp; mgr; g (Endkonzentration 10-200 ng / &amp; mgr; l) in Abhängigkeit von der Größe des Gewebes. </li></ol></li></ol> 1.2) DNA Quality Assessment <ol><li> Mix 0,25 ul Taq DNA Polymerase mit 45 &amp; mgr; l der Master-Mix aus dem Handelsleiter-Kit in einem PCR-Röhrchen. </li><li> In 5 von 1.1.1.7 oder 1.1.2.5 hergestellten ul DNA in die PCR-Röhrchen und mischen Sie gut durch und Abpipettieren für mindestens 5-mal. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Bedingungen, um die DNA zu amplifizieren: 95 ° C7 min; gefolgt von 35 Zyklen von 45 sec bei 95 ° C, 45 sec bei 60 ° C und 90 sec bei 72 ° C; dann 72 ° C für 10 min und Halten bei 15 ° C. </li><li> Vorbereitung einer 2% igen Agarosegel in TBE (Tris / Borat / EDTA). </li><li> Mischungs 20 ul PCR-Reaktion mit 4 ul 6x Ladepuffer und geladen auf ein 2% iges Agarosegel. </li><li> Flecken auf der Agarosegel mit 0,5 ug / ml Ethidiumbromid-Lösung und detektieren PCR-Produkte mit einem Gel Vorstellen Systems. Hinweis: Die Proben, die 5 PCR-Produkte ergeben in Größen von 100, 200, 300, 400, und 600 bp wird weiterhin VDJ Amplikons zu erzeugen. VORSICHT: Ethidiumbromid ist ein potenter mutagen. Bitte mit äußerster Vorsicht durch das Tragen von Schutzzahnräder, dh Handschuhe, und entsorgen Sie in bestimmte Behälter pro Richtlinien Institution. </li></ol> 1.3) VDJ PCR 1.3.1) Amplify rekombiniert IgH VDJ-Segment von Framework-Region 1 (IgVHFR1) <ol><li> Mix 45 ul Master-Mix aus der Tube Labeled als &quot;Mix 2&quot; eines kommerziellen somatische Hypermutation IGH-Assay für Gel-Nachweis-Kit, 0,25 &amp; mgr; l Taq-DNA-Polymerase, und 5 ul von 1.1.1.7 oder 1.1.2.5 in einem PCR-Röhrchen hergestellte Probe DNA. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Bedingungen, um die DNA zu amplifizieren: 95 ° C für 7 min; gefolgt von 35 Zyklen von 45 sec bei 95 ° C, 45 sec bei 60 ° C und 90 sec bei 72 ° C; dann 72 ° C für 10 min und Halten bei 15 ° C. </li><li> Lösung der gesamten PCR-Produkts in einem 2% igen Agarosegel durch Elektrophorese. </li><li> Flecken auf der Agarosegel mit 0,5 ug / ml Ethidiumbromid-Lösung und detektieren PCR-Produkte mit einem Gel-Bildgebungssystem. Monoklonaler Amplifikat wird mit dem Grßenbereich von 310-380 bp zu erwarten. </li><li> Auszuschneiden Gelanteils mit dem monoklonalen Amplikon zwischen 310 bis 380 bp. </li><li> Reinigen DNA von exzidierten Gel unter Verwendung einer Standard-Gel-Extraktions-Kit nach Herstellerprotokoll. Anmerkung: Für Proben, die FR1-Fragmente erhalten werden konnte, gibt es keine Notwendigkeit, IgV reichlichHFR2 und IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Amplify rekombiniert IgH VDJ-Segment von Framework-Region 2 (IgVHFR2) <ol><li> Mix 45 ul Master-Mix aus der Tube als &quot;Tube B&quot; einer kommerziellen IGH Gene Klonalität Assay zur Gel-Nachweis-Kit, 0,25 &amp; mgr; l Taq-DNA-Polymerase, und 5 ul Proben-DNA aus 1.1.1.7 oder 1.1.2.5 in einem PCR-Röhrchen vorbereitet markiert . </li><li> Verwenden Sie die folgenden Bedingungen, um die DNA zu amplifizieren: 95 ° C für 7 min; gefolgt von 35 Zyklen von 45 sec bei 95 ° C, 45 sec bei 60 ° C und 90 sec bei 72 ° C; dann 72 ° C für 10 min und lassen bei 15 ° C. </li><li> Lösung der gesamten PCR-Produkts in einem 2% igen Agarosegel durch Elektrophorese. </li><li> Visualisieren PCR-Produkt (e) von 0,5 ug / ml Ethidiumbromid. Monoklonaler Amplikon kann im Größenbereich von 250-295 bp beobachtet werden. </li><li> Auszuschneiden Gelanteils mit dem monoklonalen Amplikon zwischen 250 bis 295 bp. </li><li> Reinige DNA aus ausgeschnittenen Gel mit einem Standard-Gel-ExtraktIonen Kit nach Herstellerprotokoll. </li></ol> 1.4) Optimize VDJ PCR <ol><li> Mithilfe der folgenden modifizierten PCR-Bedingungen zu amplifizieren IgVHFR1 und IgVHFR2 Verwendung suboptimaler DNA: 95 ° C für 7 min, 40 Zyklen von 95 ° C für 60 sec, 60 ° C für 60 sec, und 72 ° C für 90 sec, abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min. </li></ol> 2. VDJ Amplicon Bibliothek Vorbereitung und Sequencing 2.1) Bibliothek Vorbereitung 2.1.1) End-Reparatur <ol><li> Bringen VDJ PCR-Produkt aus 1.3 in ein PCR-Röhrchen und fügen Resuspensionspuffer von DNA-Probenvorbereitung Kit auf 60 ul zu bringen Sie die Lautstärke. </li><li> In 40 ul End Repair Mix aus DNA Probenvorbereitung Kit und gründlich mischen. </li><li> Inkubieren der Reaktion bei 30 ° C für 30 Minuten in einem vorgewärmten Thermocycler (30 ° C) mit einem vorgewärmten Deckel bei 100 ° C. </li><li> Mischen Sie 136 ul magnetische Perlen und 24 &amp; mgr; l PCR grade Wasser zuerst in einem 1,5-ml-Röhrchen, übertragen Sie dann die gesamte End-Reparaturreaktion von 2.1.1.3 in die 1,5-ml-Röhrchen und mischen Sie gut mit dem Perlen-Lösung. </li><li> Die Röhrchen auf einem magnetischen Ständer für 2 min, um die Trennung der Beads von der Lösung zu ermöglichen. Den Überstand aspirieren und waschen Sie die Perlen mit 80% frisch zubereiteten EtOH zweimal, während das Rohr auf dem Magnetständer. </li><li> Saugen Sie das Ethanol-Lösung vollständig und ermöglichen die Perlen an der Luft trocknen für 15 Minuten bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Nehmen Rohr von den Magnetstativ und resuspendieren Perlen in 17,5 ul Resuspensionspuffer. </li><li> Die Röhrchen wieder auf die magnetische Halterung für 2 min zu trennen Perlen aus der Resuspensionspuffer. Entfernen Sie die Resuspensionspuffer (End-Repair-Produkt ist nun in der Resuspension Puffer) in ein sauberes PCR-Röhrchen. </li></ol> 2.1.2) A-Tailing <ol><li> In 12,5 ul A-Tailing-Mix in den PCR-Röhrchen, das End-Repair-Produkt und gründlich mischen. </li&gt; <li> Inkubieren des PCR-Röhrchen bei 37 ° C für 30 Minuten in einem vorgewärmten Thermocycler (37 ° C) mit einem vorgewärmt Deckel bei 100 ° C. </li></ol> 2.1.3) Adaptor-Ligation <ol><li> In 2,5 ul Resuspensionspuffer, 2,5 ul Ligationsmischung und 2,5 ul DNA-Adaptor-Index in die A-Tailing-Reaktion. </li><li> Inkubieren der Reaktion bei 30 ° C für 30 MINL in einem vorgewärmten Thermocycler (30 ° C) mit einem vorgewärmten Deckel bei 100 ° C. </li><li> In 5 ul Stop-Ligationspuffer in jede Reaktions und gründlich mischen. </li><li> Mix 42,5 ul gut gemischten magnetischen Kügelchen, um die Reaktion folgende Schritte 2.1.1.5 bis 2.1.1.8 zu reinigen. In 50 ul Resuspensionspuffer, um den Adapter-ligierte Produkt zu eluieren. </li><li> Reinigen Sie den Adapter-ligierte Produkt ein zweites Mal unter Verwendung von 50 &amp; mgr; gut gemischten AMPure XP Perlen und eluieren das Produkt in 25 ul Resuspensionspuffer in ein sauberes PCR-Röhrchen. </li></ol> 2.1.4) Amplify DNA-Fragmenten <ol><li> In 5 ul PCR Primer Cocktail und 25 &amp; mgr; l PCR-Master-Mix auf die PCR-Röhrchen, das Adapter-ligierte Produkt und gründlich mischen. </li><li> Die Amplifikation in einer vorprogrammierten Thermocycler unter den folgenden Bedingungen: 98 ° C für 30 sec; 10 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 30 sec; dann 72 ° C für 5 min Halten bei 10 ° C. </li><li> Bereinigen Sie die Reaktion unter Verwendung von 50 &amp; mgr; l gut gemischte magnetische Kügelchen, und eluieren das Endprodukt in 30 ul Resuspensionspuffer. </li></ol> 2.1.5) Bibliothek Validation <ol><li> Quantifizierung des Endproduktes mit einem Fluorometer unter Verwendung der Herstellerprotokoll. Endgültige Bibliothek-Konzentration zwischen 2,5 bis 20 ng / &amp; mgr; l. </li><li> Beurteilung der Qualität des Endproduktes mit Hilfe eines Analyseinstrument mit hoher Empfindlichkeit DNS-Chips nach dem Protokoll des Herstellers. Erwarten Sie eine einzelne Bande mit der erwarteten Größe für entweder IGVHFR1, IGVHFR2 oder IGVHFR3. DichRWARTETE Größe der Bibliothek Produkt entspricht der Größe des ursprünglichen VDJ Amplikon sowie die Größe der Adapter (~ 125 bp). </li></ol> 2.2) VDJ-PCR-Bibliothek Pooling und Sequenzierung <ol><li> Berechnung der Molarität jeder Bankfraktion mit der folgenden Formel: NM = [(ng / 1.000) / bp * 660] x 10 9 ng wo die Konzentration des VDJ-PCR-Bibliothek in Schritt 2.1.5.1 gemessen und bp ist der Spitzen Größe des VDJ-PCR-Bibliothek in Schritt 2.1.5.2 gemessen. </li><li> Verdünnen Sie die Bibliothek bis 2 nm (10 ul insgesamt) mit DNase-freiem Wasser. </li><li> Kombinieren Sie die 10 ul der verdünnten 2 nM Bibliotheken zusammen in ein 1,5-ml-Tube. </li><li> Hinzufügen eines gleichen Volumens PhiX Spike-Kontrolle in die 1,5-ml-Tube. </li><li> Laden Sie den Pool am 07.00 Konzentration auf eine Durchflusszelle. </li><li> Sequenz, die die Bibliotheken mit einem Paired-End 150 Zyklussequenzer nach Herstellerprotokoll. </li></ol> 3. Datenanalyse Hinweis: Ein summary der Bioinformatik-Skripte in diesem Abschnitt verwendet, kann als Ergänzungs-Code-Datei. 3.1) Ausrichtung und QC <ol><li> Karte Paired-End-Sequenzierung liest gegen einen menschlichen IGH V, D und J-Region-Datenbank aus der IMGT Website 11 mit einer angepassten Nukleotid-BLAST-Algorithmus, basierend auf &#39;blastn&#39; von NCBI mit gap open penalty 2, gap extension penalty von 1 heruntergeladen, Wortlänge von 7 und E-Wert, der sich von 10 -4. Entsorgen Sie die Lese-Paar nicht, um sowohl eine IGH V und J-Region zuzuordnen. </li><li> Zählen der verbleibenden Lesepaare, IGH V- und J-Zuordnungen müssen die Frequenzen der pass VJ Kombinationen für alle Lesepaare von der Sequenzierungslauf auf der Probe erhalten wird. Graf eine Lesepaar, wenn es sich sowohl auf eine IGH V und J-Gen kartiert, und fügen Sie ihre Allel an die entsprechende Zählung für die besondere VJ Kombination. </li><li> Rang der Zählungen für jede neu kombiniert VDJ-Region von 3.1.2 von der Hoch erhaltenest zur niedrigsten. Die Region verfügt über die höchste VDJ liest Zählung wird als Haupt Umlagerung Kombination definiert. </li><li> Entsorgen Sie ausgerichteten Sequenzen, die weniger als 35% des Gebietes Haupt Umlagerung in 3.1.3 fest decken. </li></ol> 3.2) SHM Profil Identification <ol><li> Zählen Sie alle SHM Muster über das liest aus Schritt 3.1.3. Definieren Sie die SHM Muster als Subklon. </li><li> Zählen die Anzahl von den Subklonen, die verschiedene einzigartige SHM Mustern entsprechen, und die Anzahl von Lesevorgängen, die auf einzelne Subklone abgebildet werden. </li></ol> 3.3) Grafische Darstellung der Ergebnisse <ol><li> Führen die phylogenetische Analyse der Subklone mit ihren entsprechenden SHM-Muster unter Verwendung einer Nachbarschaftsverbindungsverfahren von R-Paket &quot;Affe&quot; entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Berechnen einer Distanzmatrix von den einzelnen unterschiedlichen Ausrichtungen, um den Subklon phylogeny zur Keimbahnsequenz der V verwurzelt neuJ Kombination in Frage für jeden gepaarten Probensatz. </li><li> Verwenden der Nukleotidsequenz von jedem Subklon als Zeichenvektors und Berechnen der ungefähren Saitenabstand zwischen allen Subklone in der Haupt VJ Umlagerung zur Diagnose und entsprechende Rückfall Proben unter Verwendung eines Levenshtein Abstandsmaß wo mathematisch der Abstand zwischen zwei Ausrichtungen durch d x, y gegeben (i, j), wobei d x, y (i, j) = 1, wenn i ≠ j und 0 sonst, und summieren diese Funktion über die Länge der Zeichenfolge entspricht, Sequenzen, i und j Nukleotids. </li><li> Graphisch die resultierende Matrix der Subklon Abstände und ihre entsprechenden Subklon Zählungen in den zwei folgenden Arten: <ol><li> Verwenden Sie R-Paket &quot;Masse&quot; nach Herstellerprotokoll zur multidimensionalen Skalierung auf den Subklon Distanzmatrix anzuwenden und erzeugen eine zweidimensionale Prinzip koordiniert Karte, die dann aufgetragen wird zusammen mit dem Logarithmusder subclonal zählt wie der Radius des Kreises. </li><li> Konstruieren Sie einen ungerichteten Graphen basierend auf der Levenshtein-Distanz, wo die Scheitelpunkte entsprechen den jeweiligen unterschiedlichen Subklon, die aus der großen VJ Umlagerung. Hinweis: Wenn der Abstand zwischen zwei anderen Klone gleich eins ist, dann gibt es eine Kante zwischen diesen beiden Eckpunkten. Wenn die Entfernung größer als eins ist, dann gibt es keinen Rand verbindet. </li><li> Zur graphischen Bestimmungen 3.3.3.2 mit der tkplot Funktion in der &quot;IGRAPH&quot; R-Paket mit dem Kamada Kawai-Layout nach dem Protokoll des Herstellers. Der Radius der Ecken ist proportional der dritte Wurzel der Gesamtzahl an Klonen, es abgebildet und die Schattierung verwendet einen roten und blauen Bereich, um den Anteil von Klonen, gehören entweder zur Diagnose (blau) oder Rückfall (rot) Proben bezeichnen . </li></ol></li></ol> 3.4) Heterogenität (Entropie) Messung <ol><li> Untersuchen Sie die Zahlen und Subklon Grafen von derEinzelmuster somatische Hypermutation in der Haupt VJ Umlagerung für jede vorkommende gepaarten Proben gesetzt. </li><li> Berechnen die empirische Entropie und Rest empirische Entropie für die Anzahl der unterschiedlichen Klone in jeder Probe unter Verwendung des Standard-Histogramms auf Basis Entropieschätzung eingestellt. </li></ol>

<ol>
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The authors have no conflicts of interest to disclose.

Aufgrund der nahezu unbegrenzten Anzahl von Iterationen der Sequenzinformation von VDJ Umlagerung und SHM am IGH-Locus der humanen B-Zellen kodiert, Untersuchung des gesamten IGH Repertoire von Hochdurchsatz-deep-Sequenzierung erwies sich als eine effiziente und umfassende Weise zu umreißen klonalen sein und Sub-klonale B-Zellpopulationen. Darüber hinaus kann diese Strategie verwendet, um die klonale Entwicklungspfad von B-Zell-Tumor-Entwicklung, Remission, und Rückfall durch Vergleich der klonalen und Unter klonalen...

Krebs ist eine klonale Erkrankung. Seit vor dreißig Jahren, als Peter C. Nowell vorgeschlagen, den Krebs zu klonalen Evolution Modell 1 haben viele Studien versucht, klonalen Populationen innerhalb Tumorproben zu sezieren und zu rekonstruieren klonalen Expansion und Evolution Muster, die die Tumorentstehung Prozess 2 zugrunde liegen. Vor kurzem hat Vollgenomsequenzierung Forschern ermöglicht, einen tiefen Blick auf die klonalen Heterogenität und Evolution 3,4 zu nehmen. Aufgrund des Mangels an tractable Marker in vielen Zelltypen ist es jedoch schwierig, die genaue klonalen Architektur und Entwicklungspfad abzuleiten. Glücklicherweise gibt es eine natürliche Klonalität Marker in reifen B-Zellen, aus denen viele malignen Lymphomen, einschließlich DLBCL, stammen. Als Antwort auf Antigen-Stimulation, wobei jede B-Zelle kann eine einzelne produktive IgH VDJ Sequenzsegment zusammen aus einem großen Pool von diesen Segmenten zu bilden, durch Verbinden einer V H (variable), eine D (Diversity) und ein J H (Verbindung). Während dieser process können kleine Teile der ursprünglichen Sequenz deletiert werden und zusätzliche ohne Matrize Nukleotide können verwendet werden, um eine einzigartige VDJ-Rearrangement erstellen. Diese spezifische VDJ Umlagerung kann in allen Nachkommen dieser B-Zelle geerbt werden daher Tagging einzelne reife B-Zelle und ihrer Nachkommenschaft 5. Weiterhin tritt SHM an rekombinierten VDJ-Sequenzen in der anschließenden Keimzentren (GC) Reaktion zur zusätzlichen Mutationen für die Erweiterung des Antikörperpool und die Verstärkung der Antikörperaffinität 6 einzuführen. Daher wird durch Vergleich und die Gegen VDJ und SHM Muster Lymphom Proben, die diese Prozesse durchlaufen haben könnte intratumorale Heterogenität abzugrenzen und klonale Entwicklungsweg der Krankheit kann abgeleitet werden. Bisher konnten VDJ-Rearrangement und SHM durch PCR Amplifikation der rekombinierten Bereiche, Klonierung der PCR-Produkte, und anschließend die Sanger-Sequenzierung, um Sequenzinformation zu erhalten, identifiziert werden. Dieser Ansatz is niedrigem Durchsatz und niedrige Ausbeute, Abrufen nur einen sehr kleinen Teil des gesamten rekombiniert VDJ Repertoire und innerhalb einer gegebenen Probe behindern die Charakterisierung der Gesamtdarstellung der klonalen Population. Ein modifizierter Ansatz wurde von Erzeugung NGS indexiert Sequenzierungsbibliotheken von VDJ PCR-Produkte und die Durchführung PE 2x150 bp-Sequenzierung, um mehr als eine halbe Million rekombiniert VDJ-Sequenzen pro Probe zu erhalten erstellt. Darüber hinaus wurde eine benutzerdefinierte Pipeline entwickelt, um die Qualitätskontrolle (QC) durchführen, richten, Filter VDJ Sequenzierung liest den Umlagerungen und SHM jedes Lese identifizieren und durchzuführen phylogenetische Analyse auf der klonalen Architektur jeder Probe. Darüber hinaus wurde ein neuer Ansatz wurde gegründet, um weiteren Charakterisierung der klonalen Evolution Muster für Proben bei verschiedenen Krankheitsstadien gesammelt. Wir haben diese Technik, um DLBCL Patientenproben angewendet. DLBCL ist eine aggressive Form von Non-Hodgkin-Lymphom mit häufigen Rückfällen in bis zu einem third der Patienten 7. DLBCL Rückfälle in der Regel früh auftreten, innerhalb von 2 bis 3 Jahren von der ersten Diagnose, obwohl einige haben nach 5 Jahren 8 auftreten. Prognose für die Rückfall-Patienten ist schlecht, mit nur 10% zu erreichen 3 Jahre das progressionsfreie Überleben aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Dies ist die Grundlage, um den dringenden Bedarf an neuen Ansätzen zur DLBCL Rezidiv 9,10 behandeln. Allerdings sind die molekularen Mechanismen mit DLBCL Rückfall assoziiert noch weitgehend unbekannt. Insbesondere ist die Rolle von klonalen Heterogenität bei der Diagnose und klonale Entwicklung während DLBCL Rezidiv Entwicklung derzeit nicht charakterisierten, was es schwierig macht, eine genaue und nützliche Biomarker Rezidiv vorher definieren. Um diese Fragen zu beantworten, haben wir unsere angelegten VDJ-Sequenzierungsansatz auf mehreren paarweise mit identischer Primärdiagnose-Rückfall DLBCL Probenpaare. Zwei verschiedene klonale evolutionären Szenarien Rezidiv aus dem Vergleich der klonalen Architekturen zwischen der Diagnose und Rezidiv samp tauchtles, die mehrere molekulare Mechanismen schlägt in DLBCL Rückfall einbezogen werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ethanol</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89125-170</td>
			<td style="width:197px;">200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">TE buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12090-015</td>
			<td style="width:197px;">10 mM Tris&#183;Cl, pH 8.0; 10mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-XX0055-6</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td>25530-015</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">U1515</td>
			<td style="width:197px;">10 mM each nucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PCR Buffer&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11699105001</td>
			<td>Without MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td style="width:123px;">4311806</td>
			<td>50 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Specimen Control Size Ladder</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>2-096-0020</td>
			<td>33 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:359px;">IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td style="width:123px;">5-101-0030</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>1-101-0020</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">M8291</td>
			<td>20 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Corning (cellgro)</td>
			<td style="width:123px;">46-011-CM</td>
			<td style="width:197px;">6x1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50X TAE BUFFER&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101414-298</td>
			<td style="width:197px;">1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:197px;">10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">25 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10597011</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15628-019</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td style="width:197px;">500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610144</td>
			<td style="width:197px;">500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:197px;">50 columns</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A63881</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">Q32854</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:123px;">5067-4626</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">MiSeq</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Magnetic stand</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4457858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:359px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>170-8370</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vdj-seq: deep sequencing analysis of rearranged immunoglobulin heavy chain gene to reveal clonal evolution patterns of b cell lymphoma

Verständnis Tumor Klonalität ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Tumorentstehung und Progression der Erkrankung beteiligt sind. Zusätzlich Verständnis der klonalen Zusammensetzungsänderungen, die innerhalb eines Tumors in Reaktion auf bestimmte Mikroumgebung oder Behandlungen auftreten können, um die Gestaltung komplexer und wirksame Ansätze führen zu beseitigen Tumorzellen. Allerdings hat Tracking Tumor klonale Subpopulationen war aufgrund des Fehlens der unterscheidbaren Markierungen schwierig. Zur Lösung dieses Problems wurde ein VDJ-seq-Protokoll erstellt, um die klonalen Evolution Muster der diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL) Rückfall durch Ausnutzung VDJ Rekombination und somatische Hypermutation (SHM), zwei einzigartige Features von B-Zell-Lymphomen zu verfolgen. In diesem Protokoll wurden Next-Generation Sequencing (NGS) Bibliotheken mit Indexierung Potential von verstärkten umge Immunglobulin-Schwerkette (IgH) VDJ-Region von Paaren von Primärdiagnose und Rückfall DLBCL samp aufgebautles. Im Durchschnitt mehr als eine halbe Million VDJ-Sequenzen pro Probe wurden nach Sequenzierung, die sowohl VDJ Umlagerung und SHM Informationen enthalten erhalten. Zusätzlich wurden angefertigt Bioinformatik Leitungen entwickelt und vollständig genutzt Sequenzinformation für die Charakterisierung der IgH-VDJ Repertoire in diesen Proben. Darüber hinaus ermöglicht die Pipeline des Wiederaufbaus und der Vergleich der klonalen Architektur der einzelnen Tumoren, die die Prüfung des klonalen Heterogenität innerhalb der Diagnose von Tumoren und Abzug der klonalen Evolution Muster zwischen Diagnose und Rezidivtumor Paaren ermöglicht. Bei der Anwendung dieser Analyse auf mehrere Diagnose-Rückfall-Paare aufgedeckt haben wir wichtige Beweismittel, dass mehrere Unterscheidungstumor evolutionären Muster könnte zu DLBCL Rückfall führen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz auch auf andere klinische Aspekte wie Identifizierung der minimalen Resterkrankung, Überwachung Rückfall Fortschritt und Ansprechen auf die Behandlung und Untersuchung von Immun Repertoire erweitert werdenn in nicht-Lymphom Kontexten.

Das Gesamtverfahren der VDJ-Sequenzierung (VDJ-seq), einschließlich DNA-Extraktion, rekombiniert VDJ-Region Amplifikation und Reinigung, Sequenzierung Bibliothekskonstruktion liest Verarbeitung und phylogenetische Analyse, ist in Abbildung 1 dargestellt. Routinemßig 5-200 ug DNA kann aus abgerufen werden gefroren oder Gewebeschnitten von 0,5 bis 20 &amp; mgr; g DNA aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten. Abhängig von der Qualität, Umlagerung Muster und ...

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VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

VDJ-Seq: Tiefe Sequenzierung Analyse Rearranged Immunglobulin-Schwerketten-Gen zu Klonale Entwicklung Muster der B Zell-Lymphom Reveal

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

vdj-seq-deep-sequencing-analysis-rearranged-immunoglobulin-heavy

Research

JoVE Journal

Medicine

26.5K Aufrufe.  Weill Cornell Medical College. This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes. 

Serie: VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

Dissection of Human Glaskörper Elemente für Proteomanalyse

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Forschung

Medizin

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

DNA-Vektor-basierte RNA-Interferenz, um Genfunktionen in Cancer Study

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Deep Neuromuscular Blockade Leads to a Larger Intraabdominal Volume During Laparoscopy

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that lowering the insufflation pressure during surgery may reduce the risk of post-operative pain. In this pilot study, a method is presented for measuring the intra-abdominal space available to the surgeon during laproscopy, in order to examine whether the relaxation produced by deep neuromuscular blockade can increase the working surgical space sufficiently to permit a reduction in the CO2 insufflation pressure. Using the laproscopic grasper, the distance from the promontory to the skin is measured at two different insufflation pressures: 8 mm Hg and 12 mm Hg. After the initial measurements, a neuromuscular blocking agent (rocuronium) is administered to the patient and the intra-abdominal volume is measured again. Pilot data collected from 15 patients shows that the intra-abdominal space at 8 mm Hg with blockade is comparable to the intra-abdominal space measured at 12 mm Hg without blockade. The impact of neuromuscular blockade was not correlated with patient height, weight, BMI, and age. Thus, using neuromuscular blockade to maintain a steady volume while reducing insufflation pressure may produce improved patient outcomes.

This article presents a method for measuring the working abdominal volume during laproscopic myomectomy using the surgical grasper, and applies this technique to obtain pilot data on whether deep neuromuscular blockade (NMB) can enable the use of lower insufflation pressure. Reduced insufflation pressure during laproscopic surgery has been shown to reduce post-operative pain, and thus the use of NMB during surgery may enable improved patient outcomes.

Tief neuromuskuläre Blockade führt zu einer größeren Intraabdominelle Volume Während Laparoskopie

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that ...

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of breast tissue patterns in mammograms. We hypothesize that architectural distortion modifies the normal orientation of breast tissue patterns in mammographic images before the formation of masses or tumors. In the initial steps of our methods, the oriented structures in a given mammogram are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect node-like sites of radiating or intersecting tissue patterns. Each detected site is then characterized using the node value, fractal dimension, and a measure of angular dispersion specifically designed to represent spiculating patterns associated with architectural distortion.
Our methods were tested with a database of 106 prior mammograms of 56 interval-cancer cases and 52 mammograms of 13 normal cases using the features developed for the characterization of architectural distortion, pattern classification via quadratic discriminant analysis, and validation with the leave-one-patient out procedure. According to the results of free-response receiver operating characteristic analysis, our methods have demonstrated the capability to detect architectural distortion in prior mammograms, taken 15 months (on the average) before clinical diagnosis of breast cancer, with a sensitivity of 80% at about five false positives per patient.

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms. Oriented structures are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect sites of radiating tissue patterns. Each site is characterized and classified using measures to represent spiculating patterns. The methods should assist in the detection of breast cancer.

Erkennung von Architektur Distortion in Vor Mammographie<em&gt; Über</em&gt; Analyse der Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Gen-Umgebung Interaktionsmodelle zur Entlarvung von Störmechanismen bei Parkinson-Krankheit

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Fokus Formation: Ein Assay auf Zellbasis, um das onkogene Potential eines Gens zu bestimmen

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Unvoreingenommene Tiefe Sequenzierung von RNA-Viren aus klinischen Proben

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. However, a specific immunoglobulin E (IgE) measurement system with a high price-performance ratio is lacking in mainland China, especially in the primary care hospitals. This paper describes the principle and operation procedures of using a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system to detect allergen-specific IgE in serum. The results were compared with those from ImmunoCAP (System 1), the industrial standard, and the reproducibility of the system to detect patients sensitized to common allergens is evaluated. The results showed that in comparison with ImmunoCAP (System 1), the BioIC System (System 2) has good precision and sensitivity in detecting serum-specific IgE against various inhalant and food allergens but with a significantly lower cost. It can serve as a good alternative to System 1 in primary care hospitals in mainland China who have lower financial affordability.

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

This paper presents a protocol for detecting serum-specific immunoglobulin E with a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system and the evaluation of its usefulness in allergy diagnoses.

Einsatz von Biochip mikrofluidischen Technologie zur Erkennung Serum Allergen-spezifische Immunglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...