Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Research Scholar Grants (116403-RSG-09-082-01-MGO) von der American Cancer Society und intramuralen Mittel von der Wake Forest University Health Sciences an GS unterstützt. DBS wurde von NCI Ausbildungsförderung 5T32CA079448 unterstützt.

1. Generierung von shRNA Konstrukte <ol><li> Identifizieren Sie ein siRNA-Zielsequenz (20-23 Nukleotide) auf zuvor veröffentlichten Kriterien 6 oder verwenden Sie einen Web-basierten Algorithmus-Server, wie zum Beispiel &quot;siRNA Target-Finder&quot; von Ambion und GenScript basiert. </li><li> Synthetisieren Oligonukleotide auf die Gestaltung der 1 und Beispiel Sequenzen in Tabelle 1 basiert. Durchführung der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Oligonukleotide P1 und P2 (30 Zyklen von Denaturierung bei 94 ° C für 30 Sekunden, Annealing bei 60 ° C für 30 s und Verlängern bei 72 ° C für 30 sec) und ein Plasmid, das die U6 oder H1 Promoter als Vorlage. Reinige das PCR-Produkt mit Hilfe eines PCR-Aufreinigung Spalte. Digest bis BamHI und HindIII verdaut und zur Reinigung des DNA unter Verwendung eines PCR-Reinigungssäule. Glühen die Oligonukleotide P3 und P4 (2,5 pmol / ul jeder in 100 ul 50 mM Tris • HCl, pH 8,0) durch Kochen für 5 min und langsam abkühlen auf Raumtemperatur. Digest einen lentiviralen VECTor, wie die in 2A beschrieben, durch BamHI und EcoRI und führen Gelreinigung. </li><li> Führen Sie eine 3-Fragment-Ligation mit dem BamHI / EcoRI-verdauten Vektor, einem BamHI / HindIII-verdaute PCR-Fragment und ein Paar von geglühtem Oligonukleotide (Bilden HindIII und EcoRI-Stellen an den beiden Enden) in einem Molverhältnis 01.10.10 (Abbildung 1). </li><li> Verwandeln hocheffiziente kompetente E. coli DH5 Zellen unter Verwendung des ligierten Produktes. Verdecken Sie die Kolonien unter Verwendung der Oligonukleotide P5 (im Vektor) und P6 (im H1-oder U6-Promotor). 7 </li><li> Planen Plasmid-DNA aus den positiven Kolonien mit einem kommerziellen Kit und bestätigen die Anwesenheit des Inserts durch BamHI / EcoRI-Verdau und DNA Agarose-Elektrophorese. Sequenz der Region, die den Promotor und shRNA Verwendung von Oligonukleotid-P5. </li><li> Benutzen Sie Plasmid-DNA Midi-oder Maxi-Vorbereitungs-Kits (endotoxinfrei wird bevorzugt), um die DNA, die das Lentivirus shRNA Ausdruck vorbereitenKassette. Ermitteln Sie die DNA-Konzentration durch Messung der Absorption bei 260 nm auf. Überprüfen Sie die DNA-Reinheit mit dem 260 nm/280 nm-Verhältnis und stellen Sie sicher, es fällt in den Bereich von 1,8 bis 2,0. Überprüfen Sie die Integrität Lentivirus Plasmid mittels Agarose-Gelelektrophorese. DNA für die Transfektion sollte Super-gewickelt werden. </li></ol> 2. Lentivirus Transfektion Vorsichtsmaßnahmen: Lentivirale Vektoren aus dem Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1)-Genom und replikationsinkompetent abgeleitet. Sie sind weit verbreitet in Gentransfer durch die Fähigkeit zur Infektion sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen verwendet. Allerdings gibt es zwei große Risiken in den Studien unter Verwendung von Lentiviren. (1) Das Potential für die Erzeugung von replikationskompetentem Lentivirus. Dieses Risiko kann stark reduziert werden, wenn die dritte Generation lentiviralen verwendet wird. (2) Das Potenzial der Onkogenese. Dieses Risiko lässt sich noch verschärfen, wenn die durchgeführten Einsätze sind onkogenen oder unterdrücken Tumorsuppressoren werden.Die Forschungsaktivitäten in der HIV-basierten Lentivirus beteiligt sind, sollten die &quot;Biosafety Überlegungen für die Forschung mit lentiviralen Vektoren&quot; des NIH (folgen <a href="http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html</a> ) und erfordern eine Genehmigung durch die Kommission für Biosicherheit der eines Forschers Institution. Generell verbesserte Biosafety Level-2 (BSL-2) ist für die Containment-Labor Einstellung erforderlich, wenn lentiviralen Vektoren verwendet werden. <ol><li> Tafel 4 × 10 6 293T-Zellen HEK mit vollständigem DMEM-Medium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin zugeführt) in 10-cm-Schalen und Kultur über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2 inkubiert. Ersetzen Sie das Medium mit 5 ml vorgewärmten Opti-MEM I reduzierter Serum-Medium (Invitrogen). </li><li> Lösung A: 10 ug shRNA-haltigen lentiviralen Vektor, 5 ug jedes der dritten Generationation Lentivirus Verpackung Plasmide (zubereitet mit hoher Reinheit, die drei Verpackung Plasmide umfassen VSV-G: für ein Hüllprotein, pRSV-Rev: für Drehzahlmesser und pMDLg / pRRE: für gag / pol, die essentiell für Lentivirus Verpackungen sind), 36 ul 2M CaCl 2, und 300 ul sterilem Wasser. </li><li> Planen Lösung B: 300 ul 2 × HEPES-gepufferte Salzlösung (281 mM NaCl, 100 mM HEPES, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH-Wert auf 7,12 von 0,5 N NaOH und sterilisiert durch 0,22 um Filter). </li><li> Langsam fallen Lösung A zu Lösung B während Durchleiten von Luft durch die Lösung B mit einer Pipette. Lassen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Langsam Drop Die gemischten Lösungen A / B in den HEK 293T Zellkulturschale in Schritt 2.1 hergestellt und bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator für 4-6 h. </li><li> Ersetzen des Mediums mit 7 ml vollständigem DMEM-Medium. Nach 24 h, eine zusätzliche 5 ml der vollständigem DMEM-Medium. Ernten Sie das Medium containing die Lentivirus nach weiteren 24 Stunden der Kultur. </li><li> Drehen des Mediums bei 1500 UpM, Umgebungstemperatur für 10 min. Den Überstand mit einem 0,45 um Filter und drehen Sie das Flow-Through-Medium mit dem Lentivirus durch Ultrazentrifugation bei 25.000 Umdrehungen pro Minute (entspricht 125.000 xg mit einem SW28 Ausschwingrotor, Beckman Ultrazentrifuge XL-90), 4 ° C für 90 min. Den Überstand in einen Behälter mit 5% Bleichmittel (Endkonzentration). </li><li> Resuspendieren Sie das Pellet in Lentivirus 0,5-1,0 ml kaltem PBS und machen Lentivirus Aliquots in 50-100 ul pro Röhre. Lagern Sie sie bei -80 ° C </li><li> Der Titer des lentiviralen durch kommerzielle Kits (wie QuickTiter Lentivirus Quantifizierung Kit von Cell Biolabs, Inc.), durch eine Echtzeit-PCR-Protokoll 8, oder durch Bestimmung der co-exprimierten fluoreszierenden Markierung mit Fluoreszenz-Mikroskopie oder Durchflusscytometrie bestimmt werden . Typischerweise kann ein 10-cm-Kulturschale etwa 0,5 bis 1,0 × 10 8 produzieren Infektionenehrgeizige Einheiten (IE). </li></ol> 3. Infektion und Charakterisierung von infizierten Zellen <ol><li> Seed die Zellen in 2 ml vollständigem Medium in einer 6-Well-Platte werden mit 30-40% Konfluenz (ungefähr 5-8 × 10 5 Zellen in Abhängigkeit von Zellgröße) infiziert. Kultur der Zellen über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2 inkubiert. </li><li> Ersetzen Sie das Medium mit 1 ml frisches Medium mit 8 ug / ml Polybren (Sigma, Cat # H9268) oder 5 ug / ml Protamin (Sigma, Kat. Nr. P4020). </li><li> Bestimmen eines geeigneten Multiplizität der Infektion (MOI) Bereich von 9 für einen bestimmten Zelllinie unter Verwendung Lentivirus mit fluoreszierenden Marker. Berechnen oder empirisch bestimmen die Höhe der Lentiviren verwendet, um die Zelllinie zu infizieren. Langsam fallen die Lentivirus in die Platte und schütteln Sie sie vorsichtig für 10 sek. </li><li> Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einer 5% igen CO 2-Inkubator für 6 h und ersetzen Sie dann das Medium mit normalem Vollmedium. </li><li> Mindestens zwei days nach der Infektion, überprüfen Sie die Zellen mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie für Lentivirus auszudrücken fluoreszierenden Marker und / oder fügen Sie die entsprechenden Antibiotikums zum Medium für lentiviralen Vektoren ausdrücken Antibiotikaresistenz-Genen. Für einen induzierbaren Vektors, wie eine Tet-On-System (Abbildung 2), der Kultur die Zellen in Medium mit Tetracyclin-freien FBS vorbereitet. Teilen Sie die Zellen 2-3 Tage nach der Infektion. Nehmen eines Teils der Zellen, um die induzierbare Gen Zuschlag durch Kultivieren in einem Medium mit und ohne 1,5 ug / ml Doxycyclin (Dox) für ≥ 2 Tage zugeführt zu testen. </li><li> Überprüfen Sie den Gen-Knockdown mittels Western Blot, Real-Time PCR oder Immunfärbung ≥ 2 Tage nach der Infektion, 2 Tage nach Antibiotika-Selektion, oder (für eine induzierbare Tet-On-System) ≥ 2 Tage nach der Dox hinaus. </li><li> Nutzen verschiedene Ansätze (wie z. B. Proliferation Assays, Weichagar Kulturwissenschaften, Zellmigrationsassays, Invasionsassays und Tumorbildung Studien), um die Auswirkungen des Zielgens zu bestimmen knockdown auf der Bösartigkeit der Zellen. </li></ol> 4. Xenograft Maus-Modell-Studie <ol><li> Reinigen Sie alle Oberflächen für Maus und Betäubung durch Injektion 70% Ethanol auf eine Infektion von Mäusen zu verhindern. Anesthetize athymischen Nacktmäusen (NCI-Frederick) mit 2% Isofluran gemischt mit Sauerstoff in einer Narkose Kammer 10 min vor Zellinokulation. Pflegen Sie die Narkose mit Isofluran 1% gemischt mit Sauerstoff durch eine Bugspitze. Führen Sie diesen Schritt in einem Raum mit hervorragender Belüftung und befestigen Isofluran Scavenger-Filter zur Induktion Kammer. </li><li> Propagieren die Zellen, die shRNAs. Verwendung Tetracyclin-freiem Medium für Tet-On-induzierbaren Vektoren. Trypsinieren die Zellen und Resuspendieren sie in Vollmedium mit 50% Matrigel. Positionieren der nackten Mäuse an einem Heizkissen (30 ° C) und 200 ul Injektion der Zellen (1-10 × 10 6, abhängig von der Bösartigkeit der Zellen) in die Mäuse mit 1-2 Injektionsstellen pro Maus. Verwenden Sie Spritzen mit 25.5-Gauge-Nadeln für subkutane Injektionen, und 28 bis 30 Gauge-Nadeln für orthotopen Injektionen. </li><li> Für eine konstitutive shRNA Vektoren, verwendet 2 Gruppen von Mäusen, die mit den Zellen, die das Zielgen shRNA und eine verschlüsselte shRNA injiziert. Für Tet-On-induzierbaren shRNA Vektoren, nutzen 4 Gruppen von Mäusen mit Zellen, die das Zielgen shRNA und eine verschlüsselte shRNA, mit normalem Wasser zugeführt und Dox (1,5 mg / ml), Wasser (2 × 2 Behandlungen shRNAs = 4 Gruppen) injiziert . Ersetzen Sie den Dox-haltigem Wasser zweimal pro Woche. </li><li> Überwachen Sie die Länge und Breite der Tumore wöchentlich oder zweiwöchentlich von einem digitalen Messschieber und berechnen Tumorvolumen (V) durch die Formel V = 1/2 (Länge × Breite 2) 10. Stellen Sie sicher, dass Tumorvolumen überschreitet nicht die Richtlinien der institutionellen ACUC (wie 10% des Körpergewichts). Einschläfern jede Maus über ein Protokoll von der institutionellen ACUC zugelassen, wenn er irgendein Zeichen von umfangreichen Ulzeration oder Nekrose, offensichtlich infectio zeigtn, unkontrollierte Blutungen oder Krankheit im Endstadium. </li><li> Das Tumorwachstum und Metastasierung kann für die inokulierten Tumors Zellen, die ein Biolumineszenz-Markierung 11, wie Firefly Luciferase überwacht werden. Reinigen Sie alle Oberflächen für Maus-und Imaging-Betäubung von 70% Ethanol auf eine Infektion von Mäusen zu verhindern. Betäuben die Mäuse wie in Schritt 4.1 beschrieben. Spritzen Luciferin (150 mg / kg) intraperitoneal. Platzieren Sie die Mäuse in einer desinfizierten Abbildungskammer eines handelsüblichen Abbildungssystem, wie ein IVIS Imaging System (Caliper Life Sciences, Inc.). Schalten Sie den Hebel auf die Anästhesie Anästhesie um 1% Isofluran mit Sauerstoff gemischt zu halten. Führen Sie diesen Schritt in einem Raum mit hervorragender Belüftung. </li><li> Nehmen Sie das erste Bild, indem 5 min und überprüfen Sie die Signalstärke. Stellen Sie die Belichtungszeit, um Bilder mit optimalen Signal im Vergleich Hintergrund zu erhalten. Bestimmen Sie die Imaging-Zeit empirisch, ist die in der Regel 1-5 min zur subkutanen Tumoren. </li><li> Euthanize die Mäuse durch ein Protokoll genehmigtdurch die institutionelle ACUC wenn Tumorgrößen etwa 1.000 mm 3, oder wie von den Richtlinien vorgegebenen ACUC erreichen. Excise der Xenograft, zu wiegen und zu fotografieren. Verarbeiten Sie die Tumorproben für verschiedene Studien, wie pathologische Untersuchungen zur Morphologie von Tumorzellen zu bestimmen, und Western-Blot-und Real-Time PCR Studien zur Genexpression zu testen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Auswirkungen von YY1 Zuschlag auf Xenotransplantat Tumorbildung der Firefly-Luciferase-Expression MDA-MB-231-Zellen (menschliche Brust-Adenokarzinom-Zellen; Caliper Life Sciences) Prüfung in athymischen Nacktmäusen. Die shRNA Target-Sequenz des menschlichen YY1 wird &quot;GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T&quot;. Eine verschlüsselte Sequenz &quot;GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T&quot; wurde ebenfalls für eine Kontrolle (Forts.) shRNA, die nicht über signifikante Ähnlichkeit mit einem bekannten Protokoll erstellt. Die verwendeten Oligonukleotide, um Tet-On-induzierbaren shRNA Konstrukte, mit YY1 als Beispiel, Sind in Tabelle 1 gezeigt. Als Ergebnis wurden zwei lentiviralen Vektoren, PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA und PLU-Puro-Indu-cont shRNA, gebaut und sie wurden verwendet, um Lentiviren zu produzieren. Wir verwendeten diese Lentiviren einzeln infizieren zwei MDA-MB-231-Zell-Klonen (Klone 1 und 3) Expression sowohl Tetracyclin Regler (tetR) und Glühwürmchen-Luciferase. Polyklonale Zellpopulationen wurden nach Puromycin-Selektion erhalten. 3A zeigt Dox-induzierte Knockdown YY1 in diesen MDA-MB-231 Zellen durch PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA Lentivirus infiziert. Wir haben dann verwendet die polyklonalen Zellen von Klon 3 einzeln durch diese induzierbaren YY1 shRNA und shRNA cont Lentiviren infiziert und beobachtet, dass YY1 Erschöpfung Invasivität von MDA-MB-231-Zellen (Abbildung 3B) reduziert. Western Blot-Analysen bestätigt Dox-induzierten Silencing YY1 in MDA-MB-231-Zellen mit dem Indu-YY1 shRNA, während die Zellen mit INDU-cont shRNA nicht zeigte diesen Effekt (Abbildung 3C). Wir haben dann verwendet<html> diese Zellen für die Xenograft-Maus-Modell-Studie. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen zeigten die Mäuse durch die MDA-MB-231 Zellen mit INDU-YY1 shRNA implantiert und mit Dox-haltigem Wasser reduziert Tumorbildung, wenn visualisiert durch Biolumineszenz (Abbildung 4A) und bestimmt durch Tumorgewichte (4B ). YY1 Silencing in dieser Xenograft wurde durch Western-Blot-Studien in 4C gezeigt bestätigt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung zur Erzeugung eines shRNA und shRNA Konstrukt Transkription. Die Primer P1 bis P6 dargestellt (siehe Tabelle 1 zum Beispiel Sequenzen). Pol III: RNA-Polymerase III (d):. Verdaute Ende. Die Zeichnung ist nicht maßstabsgetreu. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4129/4129fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Schematische Darstellung von (A) einem lentiviralen Vektor und (B) den Mechanismus der Tet-On-induzierbaren Promotor H1 für Gen-Silencing verwendet. Die lentiviralen Vektor wurde auf der Grundlage pLL3.7 14 rekonstruiert. H1-PR: H1-Promotor; UBC-Pr: Human Ubiquitin C-Promotor; Puro: Puromycin; TRE: Tetracyclin responsive element; Dox: Doxycyclin. TetR: Tetracyclin-Regler. 5&#39;LTR, 3&#39;SIN-LTR und WRE sind wesentliche Bestandteile eines lentiviralen Vektors 14. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig3.jpg" /> Abbildung 3. Dox-induzierten Silencing YY1 und seine Wirkung auf Invasivität von MDA-MB-231 Zellen. A. YY1 Ebenen in zwei polyklonale Zellpopulationen abgeleitet von TetR-exprimierenden Klone 1 und 3 durch PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA Lentivirus infizierten und kultiviert in Abwesenheit und Gegenwart von Dox. B. Boyden-Kammer-Assay von MDA-MB-231-Zellen mit induzierbarer shRNAs. (* P &lt;00,05 im Vergleich zu anderen drei Gruppen). C. Repräsentative Western Blots von YY1-Expression in diesen vier Zellpopulationen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig4.jpg" /> Abbildung 4. Effekte der induzierten YY1 Silencing auf Xenotransplantat Tumorbildung durch MDA-MB-231-Zellen. A. Schematische Darstellung der Zell-Implantation (links) und Vertreter Biolumineszenz Bilder von der IVIS Imaging System nach 4 Wochen (rechts) nach Zellinokulation eingefangen. B. Xenograft Tumorgewichte bei 4 Wochen. * P ≤ 0,05. C. Western Blots von YY1 und β-Aktin-Expression in Xenotransplantaten von MDA-MB-231 Zellen mit INDU-YY1 shRNA in Abwesenheit und Anwesenheit von Dox. Etiketten auf der Oberseite sind die Namen der einzelnen Mäusen. <table border="1"><tbody><tr><td> Oligonukleotid </td><td> Sequenz (5 &#39;- 3&#39;) </td><td> Nutzung und Lage </td></tr><tr><td> P1 (Tet-On-H1) </td><td> CAGT GGATCC CGA CTG ACG ACG TCA TCA ACC C </td><td> PCR; am 5&#39;-Ende des H1-Promotor </td></tr><tr><td> P1 (U6) </td><td> CAGT GGATCC GAC ATC GCC GCC TCT AGG </td><td> PCR; am 5&#39;-Ende der U6-Promotor </td></tr><tr><td> P2 (für YY1 mit Tet-On-H1) </td><td> CAGC AAGCTT GAA ATC TGC TGC nach TTC TGC TCC c GGG ATC ATC TCT ACT GAT AGG GAA C </td><td> PCR; am 3&#39;-Ende des Tet-On-induzierbaren Promotor H1 </td></tr><tr><td> P2 (für YY1 mit U6) </td><td> CAGC AAGCTT GAA ATC TGC TGC nach TTC TGC TCC c AAA CAA GGC ttt tct cca agg gat ein </td><td> PCR; am 3&#39;-Ende der U6-Promotor </td></tr><tr><td> P3 (für YY1) </td><td> AGC tt ATC TGC TGC nach TTC TGC TCC c ttttt g </td><td> Um mit P4 geglüht werden </td></tr><tr><td> P4 (für YY1) </td><td> AATTC aaaaa <strong&gt; GGG AGC AGA AGC AGG TGC aga ta </td><td> Um mit P3 geglüht werden </td></tr><tr><td> P5 (für pLL3.7) </td><td> GGG TAC GCA GGG AGT GAA AGA ATA g </td><td> Für PCR-Screening, mit P6 verwendet </td></tr><tr><td> P6 (für Tet-On-H1) </td><td> GAT TTC CCA GAA GCG CAC ATA-AC </td><td> Für PCR-Screening, mit P5 verwendet </td></tr><tr><td> P6 (für U6) </td><td> AGG GTG AGT TTC TTG TGC CTT TG </td><td> Für PCR-Screening, mit P5 verwendet </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Synthetisierte Oligonukleotide bei der Erzeugung shRNA Konstrukte verwendet. P1 und P6-Sequenzen für die Maus U6 und Tet-On-induzierbaren humanen H1-Promotoren vorgesehen sind. Menschliche YY1 als ein Beispiel mit einer shRNA Zielsequenz GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T. Die Sequenzen spezifisch für YY1 hervorgehoben werden. Zwei P2-Sequenzen von YY1 für die beiden Promotoren ausgebildet, jeweils. Die konstituierende U6 / YY1 shRNA wurde bisher 15, beschrieben, während der Tet-On H1/YY1 in diesem Protokoll verwendet wurde. P5 Vektor-spezifischen und die Sequenz für pLL3.7 14 gezeigt wird. Die Sequenzen der Restriktionsenzyme sind unterstrichen, während die Sequenzen an die Promotoren während der PCR-Amplifikation Glühen sind kursiv gesetzt.

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	<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1.">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li><li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27.">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , (2012).</li><li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology.">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li><li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts.">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+(MOI)+for+predicting+gene+transfer+events.">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).</li><li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems.">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li><li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53.">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um knock down ein Gen mit shRNA und visualisieren ihre biologische Wirkung mit Biolumineszenz-Bildgebung das Wachstum von Tumorzellen in vivo. Der Zielort einer shRNA darf keine der drei Restriktionsstellen (BamHI, HindIII und EcoRI) verwendet für die Subklonierung. In einer seltenen Fall, wenn eine dieser Seiten vorhanden ist, kann eine zusätzliche Restriktionsenzym verwendet werden, um es bei der Erzeugung des Konstrukts zu ersetzen. Meh...

Zusätzlich zu den üblichen Laborgeräten für RNA-und Protein-Analysen und Zellkulturen verwendet, werden die folgenden Materialien und Reagenzien für dieses Protokoll benötigt. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td></tr><tr><td> Biosicherheitswerkbank geeignet für Biosafety Level 2 Containment </td></tr><tr><td> PCR Thermocycler </td></tr><tr><td> Ultrazentrifugation </td></tr><tr><td> Anästhesie-Induktion Kammer mit Isofluran-Fänger </td></tr><tr><td> Digitaler Messschieber </td></tr><tr><td> IVIS Imaging-System </td></tr><tr><td> Kompetenten E. coli DH5a </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, HindIII &amp; Restriktionsenzyme </td></tr><tr><td> T4 DNA-Ligase </td></tr><tr><td> Die dritte Generation Lentivirus Verpackung Plasmide VSV-G, pRSV-Rev und pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> Materialliste

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

RNA-Interferenz (RNAi) inhibiert die Genexpression durch speziell erniedrigender Ziel-mRNAs. Seit der Entdeckung des doppelsträngige small interference RNA (siRNA) in Gen-Silencing-1, hat RNAi zu einem mächtigen Werkzeug der Forschung in der Gen-Funktions-Studien. Im Vergleich zu genetische Deletion besitzt RNAi-vermittelten Gen-Silencing viele Vorteile, wie die Leichtigkeit, mit der sie durchgeführt wird und seine Eignung für die meisten Zelllinien. Mehrere Studien haben die Anwendungen der RNAi-Technologie in der Krebsforschung nachgewiesen. Insbesondere hat die Entwicklung der DNA-Vektor-basierte Technologie für kleine doppelsträngige RNA (shRNA) von der U6 oder H1-Promotor angetrieben produzieren langfristig und induzierbare Gen-Silencing 2,3 möglich gemacht. Seine Verwendung in Kombination mit gentechnisch viralen Vektoren, wie Lentivirus, ermöglicht eine hohe Effizienz der shRNA Lieferung und / oder Integration in die genomische DNA für eine stabile Expression shRNA. Wir beschreiben eine detailed Prozedur mit dem DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie, um die Genfunktion, einschließlich Konstruktion von lentiviralen Vektoren, shRNA, Lentivirus Produktions-und Zell-Infektion und funktionelle Studien mit einer Maus-Xenograft-Modell zu bestimmen. Verschiedene Strategien wurden bei der Erzeugung shRNA Konstrukte berichtet worden. Die hier beschriebene Protokoll unter Verwendung PCR-Amplifikation und eine 3-Fragment-Ligation verwendet werden, um direkt und effizient zu erzeugen shRNA enthaltenden lentiviralen Konstrukte, ohne irgendwelche zusätzliche Nukleotid benachbart zu einem shRNA kodierenden Sequenz. Da die shRNA-Expressionskassetten dieser Strategie erzeugt werden durch Restriktionsenzymen geschnitten werden, können sie leicht auf andere Vektoren werden mit unterschiedlichen fluoreszierenden oder antibiotische Marker bewegt. Die meisten kommerziellen Transfektionsreagenzien kann in Lentivirus genutzt werden. Allerdings ist in diesem Bericht stellen wir ein wirtschaftliches Verfahren mit Calciumphosphat-Präzipitation, die erreichen können über 90% Transfektionseffizienz in293T-Zellen. Im Vergleich zu einer konstitutiven shRNA Expressionsvektoren, ein induzierbarer shRNA System besonders geeignet, um einen Zuschlag essentiellen Gens, um die Zellproliferation. Wir zeigen die Gen-Silencing von Yin Yang 1 (YY1), einem potenziellen Onkogens bei Brustkrebs 4,5, durch ein Tet-On-induzierbaren shRNA-System und seine Auswirkungen auf die Tumorbildung. Forschung mit Lentivirus erfordert Überprüfung und Genehmigung eines Biosafety-Protokoll von der Kommission für Biosicherheit der eines Forschers Institution. Forschung mit Tiermodellen erfordert Überprüfung und Genehmigung eines Tieres Protokoll, das von der Animal Care und Use Committee (ACUC) der eines Forschers Institution.

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DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA-Interferenz (RNAi) besitzt viele Vorteile gegenüber der Gen-Knockout und wurde allgemein als ein Werkzeug in der Gen-funktionelle Studien verwendet. Die Erfindung des DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie hat langfristig und induzierbare Gen Knockdown möglich gemacht haben, und erhöhte auch die Machbarkeit von Gen-Silencing<em&gt; In-vivo-</em&gt;.

DNA-Vektor-basierte RNA-Interferenz, um Genfunktionen in Cancer Study

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

dna-vector-based-rna-interference-to-study-gene-function-in-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K Aufrufe.  Wake Forest University School of Medicine. RNA-Interferenz (RNAi) besitzt viele Vorteile gegenüber der Gen-Knockout und wurde allgemein als ein Werkzeug in der Gen-funktionelle Studien verwendet. Die Erfindung des DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie hat langfristig und induzierbare Gen Knockdown möglich gemacht haben, und erhöhte auch die Machbarkeit von Gen-Silencing In-vivo-.

Serie: DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Forschung

Medizin

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Ein orthotopen Blasenkrebs-Modell für Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Nichtinvasive Intratracheale Intubation, die Pathologie und Physiologie der Maus Lung Study

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Dreidimensional Kulturen: Ein Werkzeug, um Architektur zu studieren Normale acinar gegen maligne Transformation von Brustzellen

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Mit Saccadometry mit Deep Brain Stimulation Normale und Pathologische Funktion des Gehirns zu studieren

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...