Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Research Scholar Grants (116403-RSG-09-082-01-MGO) von der American Cancer Society und intramuralen Mittel von der Wake Forest University Health Sciences an GS unterstützt. DBS wurde von NCI Ausbildungsförderung 5T32CA079448 unterstützt.

1. Generierung von shRNA Konstrukte <ol><li> Identifizieren Sie ein siRNA-Zielsequenz (20-23 Nukleotide) auf zuvor veröffentlichten Kriterien 6 oder verwenden Sie einen Web-basierten Algorithmus-Server, wie zum Beispiel &quot;siRNA Target-Finder&quot; von Ambion und GenScript basiert. </li><li> Synthetisieren Oligonukleotide auf die Gestaltung der 1 und Beispiel Sequenzen in Tabelle 1 basiert. Durchführung der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Oligonukleotide P1 und P2 (30 Zyklen von Denaturierung bei 94 ° C für 30 Sekunden, Annealing bei 60 ° C für 30 s und Verlängern bei 72 ° C für 30 sec) und ein Plasmid, das die U6 oder H1 Promoter als Vorlage. Reinige das PCR-Produkt mit Hilfe eines PCR-Aufreinigung Spalte. Digest bis BamHI und HindIII verdaut und zur Reinigung des DNA unter Verwendung eines PCR-Reinigungssäule. Glühen die Oligonukleotide P3 und P4 (2,5 pmol / ul jeder in 100 ul 50 mM Tris • HCl, pH 8,0) durch Kochen für 5 min und langsam abkühlen auf Raumtemperatur. Digest einen lentiviralen VECTor, wie die in 2A beschrieben, durch BamHI und EcoRI und führen Gelreinigung. </li><li> Führen Sie eine 3-Fragment-Ligation mit dem BamHI / EcoRI-verdauten Vektor, einem BamHI / HindIII-verdaute PCR-Fragment und ein Paar von geglühtem Oligonukleotide (Bilden HindIII und EcoRI-Stellen an den beiden Enden) in einem Molverhältnis 01.10.10 (Abbildung 1). </li><li> Verwandeln hocheffiziente kompetente E. coli DH5 Zellen unter Verwendung des ligierten Produktes. Verdecken Sie die Kolonien unter Verwendung der Oligonukleotide P5 (im Vektor) und P6 (im H1-oder U6-Promotor). 7 </li><li> Planen Plasmid-DNA aus den positiven Kolonien mit einem kommerziellen Kit und bestätigen die Anwesenheit des Inserts durch BamHI / EcoRI-Verdau und DNA Agarose-Elektrophorese. Sequenz der Region, die den Promotor und shRNA Verwendung von Oligonukleotid-P5. </li><li> Benutzen Sie Plasmid-DNA Midi-oder Maxi-Vorbereitungs-Kits (endotoxinfrei wird bevorzugt), um die DNA, die das Lentivirus shRNA Ausdruck vorbereitenKassette. Ermitteln Sie die DNA-Konzentration durch Messung der Absorption bei 260 nm auf. Überprüfen Sie die DNA-Reinheit mit dem 260 nm/280 nm-Verhältnis und stellen Sie sicher, es fällt in den Bereich von 1,8 bis 2,0. Überprüfen Sie die Integrität Lentivirus Plasmid mittels Agarose-Gelelektrophorese. DNA für die Transfektion sollte Super-gewickelt werden. </li></ol> 2. Lentivirus Transfektion Vorsichtsmaßnahmen: Lentivirale Vektoren aus dem Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1)-Genom und replikationsinkompetent abgeleitet. Sie sind weit verbreitet in Gentransfer durch die Fähigkeit zur Infektion sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen verwendet. Allerdings gibt es zwei große Risiken in den Studien unter Verwendung von Lentiviren. (1) Das Potential für die Erzeugung von replikationskompetentem Lentivirus. Dieses Risiko kann stark reduziert werden, wenn die dritte Generation lentiviralen verwendet wird. (2) Das Potenzial der Onkogenese. Dieses Risiko lässt sich noch verschärfen, wenn die durchgeführten Einsätze sind onkogenen oder unterdrücken Tumorsuppressoren werden.Die Forschungsaktivitäten in der HIV-basierten Lentivirus beteiligt sind, sollten die &quot;Biosafety Überlegungen für die Forschung mit lentiviralen Vektoren&quot; des NIH (folgen <a href="http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html</a> ) und erfordern eine Genehmigung durch die Kommission für Biosicherheit der eines Forschers Institution. Generell verbesserte Biosafety Level-2 (BSL-2) ist für die Containment-Labor Einstellung erforderlich, wenn lentiviralen Vektoren verwendet werden. <ol><li> Tafel 4 × 10 6 293T-Zellen HEK mit vollständigem DMEM-Medium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin zugeführt) in 10-cm-Schalen und Kultur über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2 inkubiert. Ersetzen Sie das Medium mit 5 ml vorgewärmten Opti-MEM I reduzierter Serum-Medium (Invitrogen). </li><li> Lösung A: 10 ug shRNA-haltigen lentiviralen Vektor, 5 ug jedes der dritten Generationation Lentivirus Verpackung Plasmide (zubereitet mit hoher Reinheit, die drei Verpackung Plasmide umfassen VSV-G: für ein Hüllprotein, pRSV-Rev: für Drehzahlmesser und pMDLg / pRRE: für gag / pol, die essentiell für Lentivirus Verpackungen sind), 36 ul 2M CaCl 2, und 300 ul sterilem Wasser. </li><li> Planen Lösung B: 300 ul 2 × HEPES-gepufferte Salzlösung (281 mM NaCl, 100 mM HEPES, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH-Wert auf 7,12 von 0,5 N NaOH und sterilisiert durch 0,22 um Filter). </li><li> Langsam fallen Lösung A zu Lösung B während Durchleiten von Luft durch die Lösung B mit einer Pipette. Lassen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Langsam Drop Die gemischten Lösungen A / B in den HEK 293T Zellkulturschale in Schritt 2.1 hergestellt und bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator für 4-6 h. </li><li> Ersetzen des Mediums mit 7 ml vollständigem DMEM-Medium. Nach 24 h, eine zusätzliche 5 ml der vollständigem DMEM-Medium. Ernten Sie das Medium containing die Lentivirus nach weiteren 24 Stunden der Kultur. </li><li> Drehen des Mediums bei 1500 UpM, Umgebungstemperatur für 10 min. Den Überstand mit einem 0,45 um Filter und drehen Sie das Flow-Through-Medium mit dem Lentivirus durch Ultrazentrifugation bei 25.000 Umdrehungen pro Minute (entspricht 125.000 xg mit einem SW28 Ausschwingrotor, Beckman Ultrazentrifuge XL-90), 4 ° C für 90 min. Den Überstand in einen Behälter mit 5% Bleichmittel (Endkonzentration). </li><li> Resuspendieren Sie das Pellet in Lentivirus 0,5-1,0 ml kaltem PBS und machen Lentivirus Aliquots in 50-100 ul pro Röhre. Lagern Sie sie bei -80 ° C </li><li> Der Titer des lentiviralen durch kommerzielle Kits (wie QuickTiter Lentivirus Quantifizierung Kit von Cell Biolabs, Inc.), durch eine Echtzeit-PCR-Protokoll 8, oder durch Bestimmung der co-exprimierten fluoreszierenden Markierung mit Fluoreszenz-Mikroskopie oder Durchflusscytometrie bestimmt werden . Typischerweise kann ein 10-cm-Kulturschale etwa 0,5 bis 1,0 × 10 8 produzieren Infektionenehrgeizige Einheiten (IE). </li></ol> 3. Infektion und Charakterisierung von infizierten Zellen <ol><li> Seed die Zellen in 2 ml vollständigem Medium in einer 6-Well-Platte werden mit 30-40% Konfluenz (ungefähr 5-8 × 10 5 Zellen in Abhängigkeit von Zellgröße) infiziert. Kultur der Zellen über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2 inkubiert. </li><li> Ersetzen Sie das Medium mit 1 ml frisches Medium mit 8 ug / ml Polybren (Sigma, Cat # H9268) oder 5 ug / ml Protamin (Sigma, Kat. Nr. P4020). </li><li> Bestimmen eines geeigneten Multiplizität der Infektion (MOI) Bereich von 9 für einen bestimmten Zelllinie unter Verwendung Lentivirus mit fluoreszierenden Marker. Berechnen oder empirisch bestimmen die Höhe der Lentiviren verwendet, um die Zelllinie zu infizieren. Langsam fallen die Lentivirus in die Platte und schütteln Sie sie vorsichtig für 10 sek. </li><li> Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einer 5% igen CO 2-Inkubator für 6 h und ersetzen Sie dann das Medium mit normalem Vollmedium. </li><li> Mindestens zwei days nach der Infektion, überprüfen Sie die Zellen mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie für Lentivirus auszudrücken fluoreszierenden Marker und / oder fügen Sie die entsprechenden Antibiotikums zum Medium für lentiviralen Vektoren ausdrücken Antibiotikaresistenz-Genen. Für einen induzierbaren Vektors, wie eine Tet-On-System (Abbildung 2), der Kultur die Zellen in Medium mit Tetracyclin-freien FBS vorbereitet. Teilen Sie die Zellen 2-3 Tage nach der Infektion. Nehmen eines Teils der Zellen, um die induzierbare Gen Zuschlag durch Kultivieren in einem Medium mit und ohne 1,5 ug / ml Doxycyclin (Dox) für ≥ 2 Tage zugeführt zu testen. </li><li> Überprüfen Sie den Gen-Knockdown mittels Western Blot, Real-Time PCR oder Immunfärbung ≥ 2 Tage nach der Infektion, 2 Tage nach Antibiotika-Selektion, oder (für eine induzierbare Tet-On-System) ≥ 2 Tage nach der Dox hinaus. </li><li> Nutzen verschiedene Ansätze (wie z. B. Proliferation Assays, Weichagar Kulturwissenschaften, Zellmigrationsassays, Invasionsassays und Tumorbildung Studien), um die Auswirkungen des Zielgens zu bestimmen knockdown auf der Bösartigkeit der Zellen. </li></ol> 4. Xenograft Maus-Modell-Studie <ol><li> Reinigen Sie alle Oberflächen für Maus und Betäubung durch Injektion 70% Ethanol auf eine Infektion von Mäusen zu verhindern. Anesthetize athymischen Nacktmäusen (NCI-Frederick) mit 2% Isofluran gemischt mit Sauerstoff in einer Narkose Kammer 10 min vor Zellinokulation. Pflegen Sie die Narkose mit Isofluran 1% gemischt mit Sauerstoff durch eine Bugspitze. Führen Sie diesen Schritt in einem Raum mit hervorragender Belüftung und befestigen Isofluran Scavenger-Filter zur Induktion Kammer. </li><li> Propagieren die Zellen, die shRNAs. Verwendung Tetracyclin-freiem Medium für Tet-On-induzierbaren Vektoren. Trypsinieren die Zellen und Resuspendieren sie in Vollmedium mit 50% Matrigel. Positionieren der nackten Mäuse an einem Heizkissen (30 ° C) und 200 ul Injektion der Zellen (1-10 × 10 6, abhängig von der Bösartigkeit der Zellen) in die Mäuse mit 1-2 Injektionsstellen pro Maus. Verwenden Sie Spritzen mit 25.5-Gauge-Nadeln für subkutane Injektionen, und 28 bis 30 Gauge-Nadeln für orthotopen Injektionen. </li><li> Für eine konstitutive shRNA Vektoren, verwendet 2 Gruppen von Mäusen, die mit den Zellen, die das Zielgen shRNA und eine verschlüsselte shRNA injiziert. Für Tet-On-induzierbaren shRNA Vektoren, nutzen 4 Gruppen von Mäusen mit Zellen, die das Zielgen shRNA und eine verschlüsselte shRNA, mit normalem Wasser zugeführt und Dox (1,5 mg / ml), Wasser (2 × 2 Behandlungen shRNAs = 4 Gruppen) injiziert . Ersetzen Sie den Dox-haltigem Wasser zweimal pro Woche. </li><li> Überwachen Sie die Länge und Breite der Tumore wöchentlich oder zweiwöchentlich von einem digitalen Messschieber und berechnen Tumorvolumen (V) durch die Formel V = 1/2 (Länge × Breite 2) 10. Stellen Sie sicher, dass Tumorvolumen überschreitet nicht die Richtlinien der institutionellen ACUC (wie 10% des Körpergewichts). Einschläfern jede Maus über ein Protokoll von der institutionellen ACUC zugelassen, wenn er irgendein Zeichen von umfangreichen Ulzeration oder Nekrose, offensichtlich infectio zeigtn, unkontrollierte Blutungen oder Krankheit im Endstadium. </li><li> Das Tumorwachstum und Metastasierung kann für die inokulierten Tumors Zellen, die ein Biolumineszenz-Markierung 11, wie Firefly Luciferase überwacht werden. Reinigen Sie alle Oberflächen für Maus-und Imaging-Betäubung von 70% Ethanol auf eine Infektion von Mäusen zu verhindern. Betäuben die Mäuse wie in Schritt 4.1 beschrieben. Spritzen Luciferin (150 mg / kg) intraperitoneal. Platzieren Sie die Mäuse in einer desinfizierten Abbildungskammer eines handelsüblichen Abbildungssystem, wie ein IVIS Imaging System (Caliper Life Sciences, Inc.). Schalten Sie den Hebel auf die Anästhesie Anästhesie um 1% Isofluran mit Sauerstoff gemischt zu halten. Führen Sie diesen Schritt in einem Raum mit hervorragender Belüftung. </li><li> Nehmen Sie das erste Bild, indem 5 min und überprüfen Sie die Signalstärke. Stellen Sie die Belichtungszeit, um Bilder mit optimalen Signal im Vergleich Hintergrund zu erhalten. Bestimmen Sie die Imaging-Zeit empirisch, ist die in der Regel 1-5 min zur subkutanen Tumoren. </li><li> Euthanize die Mäuse durch ein Protokoll genehmigtdurch die institutionelle ACUC wenn Tumorgrößen etwa 1.000 mm 3, oder wie von den Richtlinien vorgegebenen ACUC erreichen. Excise der Xenograft, zu wiegen und zu fotografieren. Verarbeiten Sie die Tumorproben für verschiedene Studien, wie pathologische Untersuchungen zur Morphologie von Tumorzellen zu bestimmen, und Western-Blot-und Real-Time PCR Studien zur Genexpression zu testen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Auswirkungen von YY1 Zuschlag auf Xenotransplantat Tumorbildung der Firefly-Luciferase-Expression MDA-MB-231-Zellen (menschliche Brust-Adenokarzinom-Zellen; Caliper Life Sciences) Prüfung in athymischen Nacktmäusen. Die shRNA Target-Sequenz des menschlichen YY1 wird &quot;GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T&quot;. Eine verschlüsselte Sequenz &quot;GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T&quot; wurde ebenfalls für eine Kontrolle (Forts.) shRNA, die nicht über signifikante Ähnlichkeit mit einem bekannten Protokoll erstellt. Die verwendeten Oligonukleotide, um Tet-On-induzierbaren shRNA Konstrukte, mit YY1 als Beispiel, Sind in Tabelle 1 gezeigt. Als Ergebnis wurden zwei lentiviralen Vektoren, PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA und PLU-Puro-Indu-cont shRNA, gebaut und sie wurden verwendet, um Lentiviren zu produzieren. Wir verwendeten diese Lentiviren einzeln infizieren zwei MDA-MB-231-Zell-Klonen (Klone 1 und 3) Expression sowohl Tetracyclin Regler (tetR) und Glühwürmchen-Luciferase. Polyklonale Zellpopulationen wurden nach Puromycin-Selektion erhalten. 3A zeigt Dox-induzierte Knockdown YY1 in diesen MDA-MB-231 Zellen durch PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA Lentivirus infiziert. Wir haben dann verwendet die polyklonalen Zellen von Klon 3 einzeln durch diese induzierbaren YY1 shRNA und shRNA cont Lentiviren infiziert und beobachtet, dass YY1 Erschöpfung Invasivität von MDA-MB-231-Zellen (Abbildung 3B) reduziert. Western Blot-Analysen bestätigt Dox-induzierten Silencing YY1 in MDA-MB-231-Zellen mit dem Indu-YY1 shRNA, während die Zellen mit INDU-cont shRNA nicht zeigte diesen Effekt (Abbildung 3C). Wir haben dann verwendet<html> diese Zellen für die Xenograft-Maus-Modell-Studie. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen zeigten die Mäuse durch die MDA-MB-231 Zellen mit INDU-YY1 shRNA implantiert und mit Dox-haltigem Wasser reduziert Tumorbildung, wenn visualisiert durch Biolumineszenz (Abbildung 4A) und bestimmt durch Tumorgewichte (4B ). YY1 Silencing in dieser Xenograft wurde durch Western-Blot-Studien in 4C gezeigt bestätigt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung zur Erzeugung eines shRNA und shRNA Konstrukt Transkription. Die Primer P1 bis P6 dargestellt (siehe Tabelle 1 zum Beispiel Sequenzen). Pol III: RNA-Polymerase III (d):. Verdaute Ende. Die Zeichnung ist nicht maßstabsgetreu. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4129/4129fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Schematische Darstellung von (A) einem lentiviralen Vektor und (B) den Mechanismus der Tet-On-induzierbaren Promotor H1 für Gen-Silencing verwendet. Die lentiviralen Vektor wurde auf der Grundlage pLL3.7 14 rekonstruiert. H1-PR: H1-Promotor; UBC-Pr: Human Ubiquitin C-Promotor; Puro: Puromycin; TRE: Tetracyclin responsive element; Dox: Doxycyclin. TetR: Tetracyclin-Regler. 5&#39;LTR, 3&#39;SIN-LTR und WRE sind wesentliche Bestandteile eines lentiviralen Vektors 14. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig3.jpg" /> Abbildung 3. Dox-induzierten Silencing YY1 und seine Wirkung auf Invasivität von MDA-MB-231 Zellen. A. YY1 Ebenen in zwei polyklonale Zellpopulationen abgeleitet von TetR-exprimierenden Klone 1 und 3 durch PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA Lentivirus infizierten und kultiviert in Abwesenheit und Gegenwart von Dox. B. Boyden-Kammer-Assay von MDA-MB-231-Zellen mit induzierbarer shRNAs. (* P &lt;00,05 im Vergleich zu anderen drei Gruppen). C. Repräsentative Western Blots von YY1-Expression in diesen vier Zellpopulationen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig4.jpg" /> Abbildung 4. Effekte der induzierten YY1 Silencing auf Xenotransplantat Tumorbildung durch MDA-MB-231-Zellen. A. Schematische Darstellung der Zell-Implantation (links) und Vertreter Biolumineszenz Bilder von der IVIS Imaging System nach 4 Wochen (rechts) nach Zellinokulation eingefangen. B. Xenograft Tumorgewichte bei 4 Wochen. * P ≤ 0,05. C. Western Blots von YY1 und β-Aktin-Expression in Xenotransplantaten von MDA-MB-231 Zellen mit INDU-YY1 shRNA in Abwesenheit und Anwesenheit von Dox. Etiketten auf der Oberseite sind die Namen der einzelnen Mäusen. <table border="1"><tbody><tr><td> Oligonukleotid </td><td> Sequenz (5 &#39;- 3&#39;) </td><td> Nutzung und Lage </td></tr><tr><td> P1 (Tet-On-H1) </td><td> CAGT GGATCC CGA CTG ACG ACG TCA TCA ACC C </td><td> PCR; am 5&#39;-Ende des H1-Promotor </td></tr><tr><td> P1 (U6) </td><td> CAGT GGATCC GAC ATC GCC GCC TCT AGG </td><td> PCR; am 5&#39;-Ende der U6-Promotor </td></tr><tr><td> P2 (für YY1 mit Tet-On-H1) </td><td> CAGC AAGCTT GAA ATC TGC TGC nach TTC TGC TCC c GGG ATC ATC TCT ACT GAT AGG GAA C </td><td> PCR; am 3&#39;-Ende des Tet-On-induzierbaren Promotor H1 </td></tr><tr><td> P2 (für YY1 mit U6) </td><td> CAGC AAGCTT GAA ATC TGC TGC nach TTC TGC TCC c AAA CAA GGC ttt tct cca agg gat ein </td><td> PCR; am 3&#39;-Ende der U6-Promotor </td></tr><tr><td> P3 (für YY1) </td><td> AGC tt ATC TGC TGC nach TTC TGC TCC c ttttt g </td><td> Um mit P4 geglüht werden </td></tr><tr><td> P4 (für YY1) </td><td> AATTC aaaaa <strong&gt; GGG AGC AGA AGC AGG TGC aga ta </td><td> Um mit P3 geglüht werden </td></tr><tr><td> P5 (für pLL3.7) </td><td> GGG TAC GCA GGG AGT GAA AGA ATA g </td><td> Für PCR-Screening, mit P6 verwendet </td></tr><tr><td> P6 (für Tet-On-H1) </td><td> GAT TTC CCA GAA GCG CAC ATA-AC </td><td> Für PCR-Screening, mit P5 verwendet </td></tr><tr><td> P6 (für U6) </td><td> AGG GTG AGT TTC TTG TGC CTT TG </td><td> Für PCR-Screening, mit P5 verwendet </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Synthetisierte Oligonukleotide bei der Erzeugung shRNA Konstrukte verwendet. P1 und P6-Sequenzen für die Maus U6 und Tet-On-induzierbaren humanen H1-Promotoren vorgesehen sind. Menschliche YY1 als ein Beispiel mit einer shRNA Zielsequenz GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T. Die Sequenzen spezifisch für YY1 hervorgehoben werden. Zwei P2-Sequenzen von YY1 für die beiden Promotoren ausgebildet, jeweils. Die konstituierende U6 / YY1 shRNA wurde bisher 15, beschrieben, während der Tet-On H1/YY1 in diesem Protokoll verwendet wurde. P5 Vektor-spezifischen und die Sequenz für pLL3.7 14 gezeigt wird. Die Sequenzen der Restriktionsenzyme sind unterstrichen, während die Sequenzen an die Promotoren während der PCR-Amplifikation Glühen sind kursiv gesetzt.

<ol>
	<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1.">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li><li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27.">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , (2012).</li><li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology.">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li><li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts.">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+(MOI)+for+predicting+gene+transfer+events.">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).</li><li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems.">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li><li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53.">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um knock down ein Gen mit shRNA und visualisieren ihre biologische Wirkung mit Biolumineszenz-Bildgebung das Wachstum von Tumorzellen in vivo. Der Zielort einer shRNA darf keine der drei Restriktionsstellen (BamHI, HindIII und EcoRI) verwendet für die Subklonierung. In einer seltenen Fall, wenn eine dieser Seiten vorhanden ist, kann eine zusätzliche Restriktionsenzym verwendet werden, um es bei der Erzeugung des Konstrukts zu ersetzen. Meh...

Zusätzlich zu den üblichen Laborgeräten für RNA-und Protein-Analysen und Zellkulturen verwendet, werden die folgenden Materialien und Reagenzien für dieses Protokoll benötigt. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td></tr><tr><td> Biosicherheitswerkbank geeignet für Biosafety Level 2 Containment </td></tr><tr><td> PCR Thermocycler </td></tr><tr><td> Ultrazentrifugation </td></tr><tr><td> Anästhesie-Induktion Kammer mit Isofluran-Fänger </td></tr><tr><td> Digitaler Messschieber </td></tr><tr><td> IVIS Imaging-System </td></tr><tr><td> Kompetenten E. coli DH5a </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, HindIII &amp; Restriktionsenzyme </td></tr><tr><td> T4 DNA-Ligase </td></tr><tr><td> Die dritte Generation Lentivirus Verpackung Plasmide VSV-G, pRSV-Rev und pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> Materialliste

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

RNA-Interferenz (RNAi) inhibiert die Genexpression durch speziell erniedrigender Ziel-mRNAs. Seit der Entdeckung des doppelsträngige small interference RNA (siRNA) in Gen-Silencing-1, hat RNAi zu einem mächtigen Werkzeug der Forschung in der Gen-Funktions-Studien. Im Vergleich zu genetische Deletion besitzt RNAi-vermittelten Gen-Silencing viele Vorteile, wie die Leichtigkeit, mit der sie durchgeführt wird und seine Eignung für die meisten Zelllinien. Mehrere Studien haben die Anwendungen der RNAi-Technologie in der Krebsforschung nachgewiesen. Insbesondere hat die Entwicklung der DNA-Vektor-basierte Technologie für kleine doppelsträngige RNA (shRNA) von der U6 oder H1-Promotor angetrieben produzieren langfristig und induzierbare Gen-Silencing 2,3 möglich gemacht. Seine Verwendung in Kombination mit gentechnisch viralen Vektoren, wie Lentivirus, ermöglicht eine hohe Effizienz der shRNA Lieferung und / oder Integration in die genomische DNA für eine stabile Expression shRNA. Wir beschreiben eine detailed Prozedur mit dem DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie, um die Genfunktion, einschließlich Konstruktion von lentiviralen Vektoren, shRNA, Lentivirus Produktions-und Zell-Infektion und funktionelle Studien mit einer Maus-Xenograft-Modell zu bestimmen. Verschiedene Strategien wurden bei der Erzeugung shRNA Konstrukte berichtet worden. Die hier beschriebene Protokoll unter Verwendung PCR-Amplifikation und eine 3-Fragment-Ligation verwendet werden, um direkt und effizient zu erzeugen shRNA enthaltenden lentiviralen Konstrukte, ohne irgendwelche zusätzliche Nukleotid benachbart zu einem shRNA kodierenden Sequenz. Da die shRNA-Expressionskassetten dieser Strategie erzeugt werden durch Restriktionsenzymen geschnitten werden, können sie leicht auf andere Vektoren werden mit unterschiedlichen fluoreszierenden oder antibiotische Marker bewegt. Die meisten kommerziellen Transfektionsreagenzien kann in Lentivirus genutzt werden. Allerdings ist in diesem Bericht stellen wir ein wirtschaftliches Verfahren mit Calciumphosphat-Präzipitation, die erreichen können über 90% Transfektionseffizienz in293T-Zellen. Im Vergleich zu einer konstitutiven shRNA Expressionsvektoren, ein induzierbarer shRNA System besonders geeignet, um einen Zuschlag essentiellen Gens, um die Zellproliferation. Wir zeigen die Gen-Silencing von Yin Yang 1 (YY1), einem potenziellen Onkogens bei Brustkrebs 4,5, durch ein Tet-On-induzierbaren shRNA-System und seine Auswirkungen auf die Tumorbildung. Forschung mit Lentivirus erfordert Überprüfung und Genehmigung eines Biosafety-Protokoll von der Kommission für Biosicherheit der eines Forschers Institution. Forschung mit Tiermodellen erfordert Überprüfung und Genehmigung eines Tieres Protokoll, das von der Animal Care und Use Committee (ACUC) der eines Forschers Institution.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA-Interferenz (RNAi) besitzt viele Vorteile gegenüber der Gen-Knockout und wurde allgemein als ein Werkzeug in der Gen-funktionelle Studien verwendet. Die Erfindung des DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie hat langfristig und induzierbare Gen Knockdown möglich gemacht haben, und erhöhte auch die Machbarkeit von Gen-Silencing<em&gt; In-vivo-</em&gt;.

DNA-Vektor-basierte RNA-Interferenz, um Genfunktionen in Cancer Study

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

dna-vector-based-rna-interference-to-study-gene-function-in-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K Aufrufe.  Wake Forest University School of Medicine. RNA-Interferenz (RNAi) besitzt viele Vorteile gegenüber der Gen-Knockout und wurde allgemein als ein Werkzeug in der Gen-funktionelle Studien verwendet. Die Erfindung des DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie hat langfristig und induzierbare Gen Knockdown möglich gemacht haben, und erhöhte auch die Machbarkeit von Gen-Silencing In-vivo-.