The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

Tierexperimentelle Studien wurden im Rahmen einer genehmigten Protokoll von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee durchgeführt am Virginia Polytechnic Institute und State University. 1. Setup (Zeit: ~ 45 min) <ol><li> Tauwetter gefrorenen Filialen von 0,25% Trypsin, Isolation Puffer für Mitochondrien (IBM) 1 und IBM2 in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Spülen Sie Gläser und Sezieren Instrumente in 70% Ethanol, gefolgt von hochreinem Wasser. </li><li> Bereiten 0,05% Trypsin-Lösung von 0,25% Trypsin Lager durch Verdünnen von 1 Teil Trypsin in 4 Teilen IBM1. </li><li> Mischen Sie Protease und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail mit Zelllysepuffer (1: 100-Verhältnis) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss. </li><li> Aliquots von 5 ml (5 ml / Maus) von 0,05% Trypsin in ein 15 ml Kunststoffröhrchen. </li><li> Set Motor angetrieben Gewebehomogenisator zu 80 RPM. </li></ol> 2. Isolierung der Skelettmuskulatur Mitochondrien (Zeit: ~ 90 min) <ol><li> Euthanize eine Maus mit CO 2 </sub&gt; Einatmen, gefolgt durch zervikale Dislokation. </li><li> Entfernen Sie rote Muskel von der Quadrizeps und M. gastrocnemius, der die soleus (~ 75-100 mg insgesamt), wie in den folgenden Schritten beschrieben beinhaltet: <ol><li> Schälen Sie die Haut in Richtung der Maus. </li><li> Entfernen Sie die Fettpolster über der Quadrizeps-Ursprungspunkt. Schneiden Sie die Quadrizeps-Sehne, die die Kniescheibe mit feiner Spitze Schere angebracht ist. Hinweis: Der Quadrizeps durch seine anatomische Position an dem vorderen Abschnitt des proximalen Femur identifiziert. </li><li> Langsam schnippeln die Aponeurose zwischen dem Knochen und der Quadrizeps, unter Vermeidung der Oberschenkelschlagader, um die Quadrizeps aus dem Knochen zu befreien. Schneiden Sie die Sehne mit feiner Spitze Schere am Ursprungspunkt auf dem Femur um den Quadrizeps zu befreien und legen Sie die Quadrizeps in gekühltem PBS. </li><li> Entfernen Sie sichtbaren Fettgewebe in den Quadrizeps mit einer Schere. Flip Quadrizeps um, so dass der Teil des Muskels, der über den Oberschenkelknochen wurde zugewandt ist uSeite Öffnen Sie die Quadrizeps mit einer Pinzette in einem pendelnden Bewegungen. Entfernen Sie die beiden sichtbaren roten Muskelabschnitte von jedem Lappen mit feiner Spitze Schere und in ein Becherglas mit 5 ml gekühlt IBM1. Hinweis: Quadrizeps als zwei Lappen mit einem Streifen aus roten Muskel in der Nähe der Seitenkante jedes Flügels angeordnet angezeigt. </li><li> Schneiden Sie die Haut über der Achillessehne mit feiner Spitze Schere und schälen die Haut in Richtung der Maus. Schneiden Sie die freiliegenden Achillessehne und schälen die Muskeln auf den Körper der Maus. </li><li> Schneiden Sie die Sehne am lateralen und medialen Kondylen des Oberschenkelknochens mit feiner Spitze Schere, um die gastrocnemius zu befreien und legen Sie die gastrocnemius, seine Sehnen in gekühltem PBS angeschlossen. </li><li> Klappen Sie den gastrocnemius auf und ziehen Sie die Soleusmuskel und legen Sie in den Becher, die 5 ml gekühlt IBM1. Fan öffnen Sie die gastrocnemius. Entfernen Sie die drei visuellen roten Muskelabschnitte (zwei seitlichen und einem medialen oberflächliche rote Streifen) mit feinen Spitzen versehenen Scherens und übertragen diese zu dem Becherglas gegeben, 5 ml gekühlter IBM1. </li></ol></li><li> Entfernen weiteres ~ 75-100 mg von roten Muskel aus dem anderen Schenkel des Maus (wie in Schritt 2.2 beschrieben) und in einen 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und Zelllyse-Puffer (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat, 0,5% Natriumdeoxycholat, 1% Polyoxyethylen (9) nonylphenylether, verzweigt. Unmittelbar Blitz-einfrieren dieses zweite Probe in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung in Western Blot (siehe Schritt 6.1). </li><li> Legen Sie eine vorgekühlte, flache Kunststoffoberfläche auf Eis in einem großen Eimer. Gießen Sie einen Tropfen IBM1 auf die Kunststoffoberfläche und verwenden Pinzette, um das gesamte geschnittene rote Muskel (Schritt 2.2.4 und 2.2.7) in IBM1 Tröpfchen zu platzieren. Hackfleisch das Muskelgewebe für 2 min mit 3 Einzelklingen durch Ändern Rasierer alle 40 sec. </li><li> Übertragen des zerkleinerten Gewebes mit einem neuen Becherglases mit 5 ml frischem IBM1, indem die Kunststoffoberfläche, über the-Becherglas und Abkratzen der Muskeln in den Becher mit einer Rasierklinge. Nutzen Sie diese Lösung und lassen es durch einen 100 &amp; mgr; m Zellsieb auf eine 50 ml konischen Röhrchen platziert. </li><li> Tupfen Sie das Gewebe mit einer heiklen Aufgabe Wischer und dann übertragen sie in 5 ml 0,05% Trypsin-Lösung. Verwenden einer Pinzette, um das Gewebe von der Aufgabe Wischer zu entfernen. </li><li> Inkubieren des Muskelgewebes auf Eis für 30 min in 0,05% Trypsin-Lösung. </li><li> Spinnen Sie die 15 ml konischen Röhrchen mit Trypsin / Muskel Mischung bei 200 × g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> Gießen Sie die Trypsin-Überstand in einen Abfallbehälter und das Pellet mit 3 ml eiskaltem IBM1. Übertragen Sie das Gewebe bis zu einer 45 ml Glas-Homogenisator Rohr. Mit einem weiteren 1,5 ml IBM1 Spülen Sie die 15 ml konischen Röhrchen, um alle verbleibenden Proben sammeln und fügen Sie diese in die Glas-Homogenisator Rohr. </li><li> Legen Sie das Glas-Homogenisator Rohr in ein Becherglas oder Kunststoffbehälter gefüllt zur Hälfte mit Eis, so dass die Glas-Homogenisator bewegt sich minimal in das Becherglas. </li><li&gt; Homogenisieren des Gewebes / IMB1 Mischung mit den PTFE-Pistill zu einem Motor angetrieben Gewebehomogenisator mit 10 Durchgängen bei 80 UpM angebracht ist. Halten Sie den unteren Rand jeder Pass für ca. 2 Sek. </li><li> Übertragen Sie die Gewebehomogenat auf ein neues 15 ml konischen Rohr und spülen Sie das Glas-Homogenisator Rohr mit 6,5 ml IBM1. Gießen Sie die IBM1 in die 15 ml konischen Röhrchen mit Gewebehomogenat. </li><li> Spin der konischen 15 ml-Röhrchen bei 700 g für 10 min bei 4 ° C. Gießen Sie vorsichtig den Überstand in ein Glas mit hoher Festigkeit Zentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Pellet. </li><li> Spin der Überstand aus dem obigen Schritt bei 8.000 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und IBM1 resuspendieren Sie das Pellet durch langsame Zugabe von 500 ul IBM2. Schnitt das Ende einer Pipettenspitze und schonend homogenisiert das Pellet in IBM2 mit Mischen und Rühren von Bewegungen. Fügen Sie ein weiteres 4,5 ml IBM2 zu der Mischung, nachdem das Pellet vollständig aufgehängt ist. Hinweis: Vermeiden Sie übermäßige Verreiben, während brechen größere Pellet Stücke tsein kann die Mitochondrienmembranen beschädigen. </li><li> Spin der IBM2 / Gewebehomogenisat bei 8.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Hinweis: Dieser Schritt kann in einem sauberen hohe Festigkeit Zentrifugenröhrchen für eine genauere Quantifizierung der Protein isolierten Mitochondrien in Schritt 4, da Rest BSA wiederholen kann, um den Gesamtproteingehalt beiträgt. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und sanft, aber vollständig resuspendieren Sie das Pellet durch Zugabe von zwei 25 &amp; mgr; l-Schritten IBM2 mit einer Pipettenspitze mit der Spitze abgeschnitten. Vorsichtig umrühren und mischen das Pellet nach jeder Zugabe von 25 ul IBM2. Dieses mitochondriale Lager auf Eis. </li></ol> 3. Homogenisierung Whole Gewebelysat (Zeit: ~ 45 min; kann getan werden während Schritt 7) <ol><li> Entfernen Sie den Muskel aus, dass in den flüssigen Stickstoff aus dem Schritt 2.3 gelegt und bei Raumtemperatur, bis sie vollständig aufgetaut. </li><li> Hackfleisch das Gewebe für ~ 30 sec auf Eis mit feiner Spitze Schere. </li><li> Fügen Sie zwei 100 ul Kugeln Zirconium-Perlen mit dem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss aus Schritt 3.2, die das zerkleinerte Gewebe enthält. Homogenisieren des Gewebes in einer Perlmühle Gewebehomogenisator mit zwei, um drei 5-Minuten-Zyklen bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 4-6 (mittlere Einstellung). </li><li> Spin der Mischung aus Schritt 3.3 bei 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1.000 ul Pipettenspitze nach dem Spin und Transfer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Entsorgen Sie das Pellet und platzieren Sie den Überstand auf Eis. </li></ol> 4. Proteinbestimmung (Zeit: ~ 30 min) <ol><li> Bestimmung der Proteinkonzentration des gesamten Gewebelysat (Schritt 3.4) und mitochondriale Lager (Schritt 2.17) unter Verwendung des BCA-Protein-Assay-Kit nach den Angaben des Herstellers. </li></ol> 5. Mitochondrien Membranintegrität; Citratsynthase (CS) Activity (Zeit: ~ 15 min) <ol><li> Machen Sie zwei 1: 20-Verdünnungen der mitochondrialen Lager in hochreinem Wasser. Hinzufügen0,1% Triton X-100 zu einer Probe und beschallen es bei einer niedrigen Einstellung (765 Watts, Amplitude 2). Lassen Sie die anderen Verdünnung auf Eis. Bringen Sie die Probe auf Eis nach der Beschallung. </li><li> Führen Citratsynthase Assay sowohl die nicht-beschallte und beschallt mitochondrialen Verdünnungen mit einem spektrophotometrischen Test, wie zuvor beschrieben 11,12. </li><li> Bestimmen Sie den Prozentsatz der intakten Mitochondrien-Membranen unter Verwendung der folgenden Gleichungen: (Non-beschallt CS Aktivität ÷ beschallt CS-Aktivität) * 100 </li></ol> 100- N (Prozent von oben erreicht) 6. Mitochondrien Isolation Qualität; Western Blot (Zeit: Nach Lab Protocol) <ol><li> Zuführen Western Blot auf die gesamte Gewebelysat und isolierte Mitochondrien, wie zuvor beschrieben 12. Anmerkung: Die Verwendung Primärantikörper für GAPDH (1: 1.000 Verdünnung in 5% BSA / TBS-T) und COXIV (1: 1.000 Verdünnung in 5% fettMilch / TBS-T), gefolgt von anti-Ziege und Kaninchen-Sekundärantikörper, die jeweils (1: 10.000). </li></ol> 7. Respirometrische Testlauf (Zeit: ~ 90 min) <ol><li> Führen Sie gewünschte respirometrischen Tests unter Verwendung von Mikroplatten-basierten O 2 Verbrauchsmesstechnik, wie zuvor beschrieben (siehe Begleitartikel und Rogers et al 8). </li><li> Bestimmen Sie die Atemkontrollverhältnis (RCR) durch Division State 3 durch staatliche 4o (RCR) oder Division Staat 3U durch staatliche 4o. Verwenden Sie entweder die mittlere (durchschnittliche) Punkt oder die höchste (State 3) und die niedrigsten Preise (State 4o) von den Punkt-zu-Punkt-Spuren bei der Ermittlung RCR. </li></ol>

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	<li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics. , (2013).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li><li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence.">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).</li><li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance,+metabolic+flexibility,+and+mitochondrial+performance.">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS one. 6, e21746 (2011).</li><li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration.">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).</li><li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes.">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).</li><li>Hulver, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+stearoyl-CoA+desaturase-1+expression+in+skeletal+muscle+contributes+to+abnormal+fatty+acid+partitioning+in+obese+humans.">Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans.</a> Cell Metab. 2, 251-261 (2005).</li><li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+modulates+skeletal+muscle+substrate+metabolism.">Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> JoVE. , (2011).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).</li><li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization.">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).</li><li>Asmann, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mitochondrial+functions,+mitochondrial+DNA+copy+numbers,+and+gene+transcript+profiles+in+type+2+diabetic+and+nondiabetic+subjects+at+equal+levels+of+low+or+high+insulin+and+euglycemia.">Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia.</a> Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).</li><li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro.">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li></ol>

George Rogers is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument for which this protocol was modified.

Die hier vorgestellten Methoden liefern eine detaillierte Beschreibung eines mitochondrialen Isolierungsverfahren von minimalen Mengen (~ 75-100 mg) von Maus-Skelettmuskel. Dieses Isolierungsverfahren ist in der Lage, High-Functioning, reine Mitochondrien (~ 450 &amp; mgr; g) zu ergeben, wie durch O 2 Verbrauchsraten, RCR-Werte, Maximal Citrat-Synthase-Aktivität und Proteinexpression von Immunoblotting nachgewiesen. Wichtig ist, dass die Mitochondrien von diesem Verfahren getrennt für mehrere respirometirc ...

The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies3-5.
Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays. 
Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several &#181;g per well8. Therefore, we present a modification of previously published methods7 to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O2 consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research9,10.

<table><tbody><tr><td>Essentially Fatty</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acid Free- BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris/HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6511</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>N/A</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium Chloride&lt;br/&gt; White Crystals or Crystalline Powder&lt;br/&gt; &amp;ge;99.0 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771&amp;nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750&amp;nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Single Edge Razor Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>352360</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Halt Protease &amp;amp; Phosphatse Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861284</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap</td><td>Thermo Scientific</td><td>3474</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zirconium Oxide beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>C9012112</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH antibody (1D4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-59540</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Anti- COXIV antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4844s</td><td>Any mitochondrial inner membrane protein will suffice</td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>711-035-152</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>115-001-003</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pyruvic Acid, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>Store at 4 &amp;deg;C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td>Succinic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &amp;ge;95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oligomycin A, &amp;ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Store at 2-8 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>phenylhydrazone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;ge;98% (TLC), powder [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A from streptomyces sp.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>Store at -20 &amp;deg;C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Store at room temperature</td></tr></tbody></table>

isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Dysfunktionalen Skelettmuskel Mitochondrien spielen eine Rolle in Zusammenhang mit der Alterung, Übergewicht und Diabetes Typ II beobachtet veränderten Stoffwechsel. Mitochondriale respirometrischen Assays aus isolierten Mitochondrien Zubereitungen erlauben die Beurteilung der Mitochondrienfunktion sowie die Bestimmung des Mechanismus (en) der Wirkung von Arzneimitteln und Proteinen, die den Stoffwechsel modulieren. Aktuelle Isolierungsverfahren erfordern häufig große Mengen von Gewebe, um qualitativ hochwertige Mitochondrien für respirometrischen Assays notwendig ergeben. Die hier vorgestellten Methoden beschreiben, wie hohe Qualität gereinigt Mitochondrien (~ 450 &amp; mgr; g) von geringen Mengen (~ 75-100 mg) von Maus-Skelettmuskel isoliert werden für den Einsatz in Hochdurchsatz-Atemmessungen. Wir stellten fest, dass unsere Trennung Verfahren ergibt 92,5 ± 2,0% intakte Mitochondrien durch Messung Citrat-Synthase-Aktivität spektralphotometrisch. Darüber hinaus Western Blot-Analyse in isolierten Mitochondrien führte das schwache Expression des cytosolic Protein, GAPDH und die robuste Expression des mitochondrialen Proteins, COXIV. Die Abwesenheit eines bekannten GAPDH Band in den isolierten Mitochondrien indikativ für kleine Verunreinigungen von nicht mitochondrialen Quellen während des Isolierungsverfahrens. Am wichtigsten ist, die Messung des O 2 Verbrauchsrate mit Mikroplatte basierte Technologie und Bestimmen des respiratorischen Steuerungsverhältnis (RCR) für gekoppelte respirometrischen Assays zeigen hoch gekoppelt (RCR,&gt; 6 für alle Assays) und funktionelle Mitochondrien. Im Ergebnis ist die Zugabe eines separaten Zerkleinern Schritt und Motor angetrieben Homogenisierungsgeschwindigkeit eines zuvor beschriebene Verfahren erheblich reduziert ist die Isolierung von hoher Qualität und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskel, in stark gekoppelt Mitochondrien, die mit hoher Funktions respire Ergebnisse führten während auf Mikrotiterplatte respirometirc Assays.

Citrat-Synthase-Aktivität als Maß für die Unversehrtheit der Membran, da Citratsynthase ist in der inneren Mitochondrienmembran, und sollte daher nicht in Suspensionen von Mitochondrien mit intakten Membranen vorliegen. 1 stellt Citrat-Synthase-Aktivität in nicht-beschallten mitochondrialen Proben verglichen, die mit beschallter Proben aus der gleichen Isolation. Beschallen der Mitochondrien führt zu einem statistisch signifikanten Anstieg der Citrat-Synthase-Aktivität (P &lt;0,01). Wichtig ist, d...

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Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

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12.7K Aufrufe.  Virginia Tech. Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Serie: Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, mitochondria exist in a series of complex morphologies, ranging from small oval organelles to a broad, reticulum-like network. Understanding how the mitochondrial reticulum expands and develops in response to diverse stimuli such as alterations in energy demand has long been a topic of research. A key aspect of this growth, or biogenesis, is the import of precursor proteins, originally encoded by the nuclear genome, synthesized in the cytosol, and translocated into various mitochondrial sub-compartments. Mitochondria have developed a sophisticated mechanism for this import process, involving many selective inner and outer membrane channels, known as the protein import machinery (PIM). Import into the mitochondrion is dependent on viable membrane potential and the availability of organelle-derived ATP through oxidative phosphorylation. Therefore its measurement can serve as a measure of organelle health. The PIM also exhibits a high level of adaptive plasticity in skeletal muscle that is tightly coupled to the energy status of the cell. For example, exercise training has been shown to increase import capacity, while muscle disuse reduces it, coincident with changes in markers of mitochondrial content. Although protein import is a critical step in the biogenesis and expansion of mitochondria, the process is not widely studied in skeletal muscle. Thus, this paper outlines how to use isolated and fully functional mitochondria from skeletal muscle to measure protein import capacity in order to promote a greater understanding of the methods involved and an appreciation of the importance of the pathway for organelle turnover in exercise, health, and disease.

Mitochondria are key metabolic organelles that exhibit a high level of phenotypic plasticity in skeletal muscle. The import of proteins from the cytosol is a critical pathway for organelle biogenesis, essential for the expansion of the reticulum and the maintenance of mitochondrial function. Therefore, protein import serves as a barometer of cellular health.

Messung der Proteinimportkapazität der Mitochondrien der Skelettmuskulatur

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Biochemie

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Medizin

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biologie

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

<meta charset="utf8"></head><body>Mitochondriale Isolierung von Nagetieren für qualitativ hochwertige bioenergetische Studien

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry to study metabolic impairments and disease. Consistent mitochondrial quality is necessary to properly investigate mitochondrial physiology and bioenergetics; however, many different published isolation methods are available for researchers. Although different experimental strategies require different isolation methods, the basic principles and procedures are similar. This protocol details a method capable of extracting well-coupled mitochondria from a variety of tissue sources, including small animals and cells. The steps outlined include organ dissection, mitochondrial purification, protein quantification, and various quality control checks. The primary quality control metric used to identify high-quality mitochondria is the respiratory control ratio (RCR). The RCR is the ratio of the respiratory rate during oxidative phosphorylation to the rate in the absence of ADP. Alternative metrics are discussed. While high RCR values relative to their tissue source are obtained using this protocol, several steps can be optimized to suit the individual needs of researchers. This procedure is robust and has consistently resulted in isolated mitochondria with above-average RCR values across animal models and tissue sources.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Aufdeckung der Rolle von mitochondrialem Calciumphosphat bei Herzinsuffizienz und Bioenergetik

Bioenergetic and metabolomic studies on mitochondria have revealed their multifaceted role in many diseases, but the isolation methods for these organelles vary. The method detailed here is capable of purifying high-quality mitochondria from multiple tissue sources. Quality is determined by respiratory control ratios and other metrics assessed with high-resolution respirometry.

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren 

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Messung der Proteinimportkapazität der Mitochondrien der Skelettmuskulatur

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien