This work was supported by Ministerio de Econom&#236;a y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Le&#242;n (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Le&#242;n (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Br&#251;let (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.

Ethics Statement: Verfahren mit Versuchstieren wurden unter Protokolle, die von der Universität Valladolid Stallanlage in Übereinstimmung mit der Europäischen Konvention 123 / Europarat und der Richtlinie 86/609 / EWG zugelassen abgewickelt. 1. Kurz und Langzeitkultur von Ratten-Hippokampus-Neuronen <ol><li> Herstellung von Poly-D-Lysin-beschichtete 12 mm-Glasdeckgläschen. <ol><li> Sterilisieren, Durchmesser 12 mm Deckgläser in Ethanol für mindestens 24 Stunden. Lassen Sie sie unter sterilen Bedingungen zu trocknen. </li><li> Verteilen Sie die Deckgläser auf einem Streifen von Parafilm in einer Petrischale. Decken die Oberfläche jedes Deckglas mit 200 ul 1 mg / ml Poly-D-Lysin. Lassen Sie die Behandlung von O / N. </li><li> Am nächsten Tag waschen Sie die Deckgläser mit doppelt destilliertem sterilem Wasser alle 15 min für 90 min unter sterilen Bedingungen. </li><li> Füllen Sie eine vier auch Multischale Platte mit 500 ul Neurobasal Kulturmedium pro Vertiefung. Neurobasal Kulturmedium sollte ergänzt werden,10% fötales Rinderserum, 2% B27, 1 &amp; mgr; g / ml Gentamycin und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Legen Sie die Deckgläser in der Multischale Platte. Halten sie in einer angefeuchteten 37 ºC und 5% CO 2 -Inkubator bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Isolierung von Neuronen im Hippocampus von neugeborenen Ratten. <ol><li> Vorbereitung 1,8 ml Papainlösung (direkt erworben) in einem Glasfläschchen (20 ul / ml) unter sterilen Bedingungen: bis zu einer Endkonzentration von 20 &amp; mgr; l zu erhalten / ml etwa 40 &amp; mgr; l Papain in 1,8 ml Hank plus 0,6% BSA hinzuzufügen (ul berechnet werden in Abhängigkeit von den Lieferanten Bedingungen). Hanks 0,6% BSA wird durch Mischen von 85 ml HBSS Medium mit 15 ml 4% iges Rinderserumalbumin (BSA, hergestellt Lösung 4 g BSA in 100 ml HBSS). Bereiten Sie es in einer sterilen Haube. </li><li> Inkubieren Papain in Hank plus 0,6% BSA für 30 Minuten bei 37 ºC vor der Verwendung. Filtern der Lösung unter Verwendung eines 0,22 um Filter vor der Verwendung. </li><li> Vorbereitung Hams F-12-Medium durch Zugabe von Dulbecco-Modifiziertem Eagle-Medium-Pulver (13,5 g pro Liter) in 900 ml doppelt destilliertem sterilem Wasser. Fügen Sie dann 6 g HEPES und 336 mg NaHCO 3 und den pH auf 7,42 mit NaOH 4 N. In sterilem Wasser, um eine 1 L Lösung zu erhalten und filtern es mit einem 0,20 um Polyethersulfon (PES) Flaschenaufsatzfilter. Führen Sie diesen Vorgang in einer sterilen Haube. Schließlich sättigt die Lösung mit CO 2 unter sterilen Bedingungen vor der Verwendung. Shop-Lösungen bei 4 ° C und verwenden Sie sie gekühlt. </li><li> Euthanize Neugeborenen (P0) Rattenjungen durch Enthauptung und waschen Sie den Kopf in sterile HBS Medium. Öffnen Sie den Schädel mit Hilfe einer sterilen Schere. Extrahieren Sie das Gehirn mit einem Spatel und waschen Sie ihn schnell in Hams F-12-Medium. </li><li> Machen Sie einen Schrägschnitt mit Hilfe eines Skalpells in jeder Hemisphäre (1B), und tragen sie zu einer Petrischale mit Ham-F-12-Medium. </li><li> Verwerfen Meningen sorgfältig mit Hilfe von Pinzetten und Dissektion unter einer Lupe. </li> &lt;li&gt; Geben Sie den Hippocampus in einem charakteristischen konkaven Stelle über dem Kortex mit Lupe. Dann trennen den Hippocampus von der Rinde durch vorsichtiges Ziehen von einer Grenze und Entfernen von seiner Position mit Augen Schere. </li><li> Übertragen Sie die Hippocampus-Gewebe bis zu einer 4-Well-Platte mit steriler Hanks Medium ohne Ca 2+ und Mg 2+ und 0,6% BSA aufgefüllt und waschen Hippocampus-Gewebe. Ohne dass die Medien zu schneiden das Gewebe in kleine Stücke (ca. 2 x 2 mm) mit den gleichen Augen Schere. </li><li> Übertragen hippocampalen Stücke zu einer Ampulle, die 1,8 ml vorfiltriert Papainlösung. Dann inkubieren sie bei 37 ° C unter gelegentlichem, leichtem Schütteln. 15 Minuten später, fügen Sie 90 ul DNase I-Lösung (50 ug / ml final) und Inkubation für weitere 15 min. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe mit einem 10 ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Bruchstücke mit frischen Neurobasal Kulturmedium. Erhalten Zellsuspension, indem Gewebefragmente durch eine 5 ml-Kunststoff pipette. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 160 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand mit einem Kunststoff sterilen Pasteur-Pipette und Pellet auszusetzen vorsichtig mit 1 ml automatisierte Pipette in 1 ml Neurobasal Kulturmedium. </li><li> Messung der Zelldichte unter Verwendung eines Neubauer-Zählkammer. Legen Sie das Deckglas über die Neubauer-Kammer. Zugabe von 10 &amp; mgr; l Zellsuspension. Stellen Sie sicher, die Zellsuspension in die Kammer gleichmäßig und macht keine Blasen. Zählen die Anzahl der Zellen unter dem Mikroskop und führen entsprechenden Berechnungen, um eine geeignete Tropfen 40-80 ul, enthaltend 30 x 10 3 Zellen erhalten. Die Gesamtzahl der Zellen wird von der Anzahl der verwendeten Tiere ab. </li></ol></li><li> Kurzzeit- und Langzeitkultur von Ratten-Hippocampus-Neuronen. <ol><li> Im Laufe der vier auch Multischale Platte mit 500 ul Neurobasal Kulturmedium hergestellt, bevor und in den Inkubator, Platte aufbewahrt ca. 30 x 10 3 Zellen in einem Rückgang von etwa 50 &amp; mgr; l zu jedemauch der Multischale Platte mit einem Poly-D-Lysin-beschichtete, Durchmesser 12 mm Deckglas. </li><li> Pflegen primären Hippocampus-Zellen in einem befeuchteten 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator für 2-5 Tage in vitro (DIV, kurzfristige, junge Kulturen) oder&gt; 15 DIV (langfristige, im Alter von Kulturen), bevor Experimente ohne die Kultur Medien. </li></ol></li></ol> 2. Fluorescence Imaging der cytosolischen Ca 2+ -Konzentration <ol><li> Herstellung von Testlösungen für Fluoreszenz-Imaging. <ol><li> Vorbereitung eines externen HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) Lösung, die in mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl 2 1, CaCl 2 1, Glucose 10, Natrium-HEPES 10 (pH 7,42). </li><li> Vorbereitung eines externen, Mg 2+ -frei, HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) Lösung, die in mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl 2 1, Glucose 10 und 10 HEPES (pH 7,42). </li><li> Lösen NMDA in Mg 2+ -frei, HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) mit einem FINAl Konzentration von 100 &amp; mgr; M und ergänzen Sie es mit 10 uM Glycin. </li><li> Vorbereitung einer HBS enthaltende Lösung KCl anstelle von NaCl durch die Lösung (in mM): KCl 145, MgCl 2 1, CaCl 2 1, Glucose 10 und 10 HEPES (pH 7,42). </li></ol></li><li> Laden des Hippocampus-Zellen mit fluoreszierenden Calciumsonde Fura2 / AM. <ol><li> Nehmen Sie die Zellkultur enthält Deckgläser aus dem Inkubator und waschen Sie sie mit HBS-Medium bei RT durch Übertragung auf ein neues Vier auch Multischale Platte, die 500 &amp; mgr; l HBS pro Vertiefung. </li><li> Inkubieren Zellen mit Fura2 / AM 4 &amp; mgr; M für 60 min bei RT (25 ° C) an einem dunklen Ort (in der gleichen HBS Medium hergestellt). </li><li> Nach 60 min waschen Deckgläser mit frischen HBS Medium. </li></ol></li><li> Aufnahme von Fluoreszenzbildern von zytosolischen [Ca 2+] in kultivierten Zellen. <ol><li> Schalten Sie die Lampe, Mikroskop, Perfusionssystem, Fluoreszenz-Kamera und Computer. </li><li> Legen Sie die Deckgläser in einem thermostatisierten Plattform fürOpen 12 mm Deckgläser auf der Bühne des inversen Mikroskop und wählen Sie einen mikroskopischen Bereich unter Verwendung eines 40X-Objektiv (Öl, NA: 1,3). Perfundieren Zellen kontinuierlich mit vorgewärmten (37 ° C) HBS Mediums in Abwesenheit oder Anwesenheit von Testsubstanzen. Aufrechterhaltung der Strömung mit einer Rate von ungefähr 5-10 ml / min. Hinweis: Handy Perfusionssystem für lebende Zellen in einem thermostatisierten Plattform für offene 12 mm Deckgläser montiert. 8-Linien schwerkraftgetriebenen Perfusionssystem mit einer Ventilsteuerung ausgerüstet ist, um die Lösungen zu perfundieren. Eine Vakuumpumpe ist für das Entfernen überschüssigen Mediums verantwortlich. Lösungen werden unter Verwendung eines in-Rohr-Heizung erwärmt. </li><li> Nehmen Sie ein Hintergrundbild mit der Verschluss an beiden Anregungswellenlängen geschlossen. </li><li> Epi-Zellen leuchten abwechselnd bei 340 und 380 nm. Record Licht bei 520 nm alle 5-10 s mit einer Fluoreszenzkamera, die von einer Fura-2 dichroitischen Spiegel gefiltert wird emittiert. </li><li> Wenn die Aufzeichnungszeit beendet ist, speichern Sie die vollständige Sequenz of Bilder bei 520 nm emittiert im Computer zur weiteren Analyse. </li></ol></li><li> Analyse von aufgezeichneten Fluoreszenzbilder. <ol><li> Öffnen Sie das Experiment-Datei. Unter Verwendung des Aquacosmos Software, klicken Sie auf &quot;Verhältnis&quot; und wählen Sie die gewünschte Übersetzungsbereich. Berechnung der pixel-Verhältnis in den resultierenden Bildern, um eine Sequenz von Verhältnis Bilder zu erhalten. </li><li> Subtrahieren Hintergrund durch Einstellen der &#39;Hintergrund Beseitigung&#39;. Drücken Sie &quot;Start Berechnung &#39;. </li><li> Drücken Sie &#39;Alle Zeitfolge &quot;Knopf und löschen die alten Regions of Interest (ROIs). Zur quantitativen Analyse von Einzelzellen herzustellen neuen Regionen von Interesse oder ROIs entsprechend einzelnen Neuronen. Durchschnitt alle Verhältniswerte in jedem Pixel entsprechend jedem ROI und jedes Bild, um eine Aufnahme von Verhältnisfluoreszenzwerte für einzelne ROIs (Zellen) zu erhalten. </li><li> Um die einzelnen Aufnahmen anzuzeigen exportieren Verhältnis Fluoreszenzwerte entsprechend jeder ROI auf eine grafische progrbin. </li><li> Stellen die entsprechenden Berechnungen zur Bestimmung der Größe des Anstiegs der Fluoreszenz-Verhältnis in Reaktion auf jede Stimulierung unter Verwendung einer geeigneten Datenanalyse und grafische Software. </li></ol></li></ol> 3. Biolumineszenz-Bildgebung der mitochondrialen Ca2 + -Konzentration <ol><li> Transfektion von kultivierten Hippocampusneuronen mit der mitGAmut Plasmid. HINWEIS: Die Zellen werden zunächst mit dem mitGAmut Plasmid, das ein Mitochondrien-Targeting-Sequenz und eine mutierte Aequorin fehlt ein Ca 2+ Bindungsstelle an das grün fluoreszierende Protein (GFP) fusioniert transfiziert. Diese Konstruktion erkennt große Anstiege in der mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme und ermöglicht die Identifizierung von transfizierten Zellen durch das GFP-Fluoreszenz. Das Plasmid wurde entwickelt und freundlicherweise von P. Brulet und Mitarbeiter 18 (CNRS, Paris) zur Verfügung gestellt. <ol><li> Bereiten Neurobasal TF, enthält Neurobasal Kulturmedium ohne fötales Rinderserum, B27, gentamicin und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Bereiten Sie 50 ul Neurobasal TF plus 2,5 ul Transfektionsreagenz in einem Fläschchen (Lösung A). Bereiten Sie 50 ul Neurobasal TF plus 4 ug mitGAmut Plasmid in einem Fläschchen (Lösung B). Sanft hinzufügen Lösung B über Lösung A. Lassen Mischen während 20 min ohne Schütteln. </li><li> Übertragen Sie die Deckgläser haltigen Neuronen im Hippocampus, neue Multischale Platten, enthaltend 200 &amp; mgr; l frisches Neurobasal TF. </li><li> In tropfenweise 100 ul Lösung A + B über jedes Deckglas. Inkubation für 30 min. Entfernen Sie das Medium. Einmal Zellen mit frischem Neurobasal TF waschen. Bringen Sie die Deckgläser auf den ursprünglichen Neurobasal Kulturmedium. </li><li> Kultur Neuronen für zusätzliche 24 h bei 37 ºC und 5% CO 2 nach der Transfektion, um eine effiziente Expression und Ausrichtung der Sonde zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Herstellung von Testlösungen für Biolumineszenz-Bildgebung. <ol><li> Bereiten HBS Lösungen, die NMDA-100 um oder 145 mM KCl alsoben beschrieben (Schritt 2.1). Vorbereitung HBS-Lösung, die 10 mM Ca 2+ und Digitonin 100 uM. </li></ol></li><li> Rekonstitution von Mitochondrien-Targeting Aequorin mit Coelenterazin n. <ol><li> Transferdeck transfiziert Hippocampusneuronen zu einem Vier-Loch-Platte, die 200 &amp; mgr; l HBS. </li><li> In 4 ul Coelenterazin n (200 &amp; mgr; M) zu 200 ul HBS für eine Endkonzentration von 4 &amp; mgr; M und vorsichtig mischen. Inkubation für 2 Stunden bei RT (25 ° C) und bei Dunkelheit. </li></ol></li><li> Aufzeichnungs Biolumineszenz Bilder mitochondriale [Ca 2+]. <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, die Lampe, das Perfusionssystem, Biolumineszenz-Kamera und dem Computer. </li><li> Übertragen rekonstituiert Deckgläser in eine thermostatisierte (37 ° C) Perfusionskammer und perfundieren kontinuierlich mit vorgewärmter HBS-Lösung mit einer Rate von 5-10 ml / min. </li><li> Unter Verwendung eines 40X-Objektiv (Öl, NA: 1,3), wählen Sie eine mikroskopische Feld mit Zellen, die einpoaequorins wie durch Fluoreszenzemission mit der Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) assoziiert mit den FITC-Filter dargestellt. Eine typische Feld kann 1-2 transfizierte Zellen enthalten. Nehmen Sie das GFP-Fluoreszenzbild, mit einer CCD-Kamera. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop Licht. Entfernen Sie die dichroitischen haltigen Box in der Lichtpfad befindet. Schalten Sie das Anregungslicht und schließen Sie die Dunkelfeld für völliger Dunkelheit. </li><li> Perfundieren Zellen in 5-10 ml / min mit HBS Medium mit oder ohne Testlösungen bei 37 ° C vorgewärmt. </li><li> Erfassen Photonenemissions Bilder alle 10 sec mit einer Photonenzählung Kamera mit einem Bildprozessor abgewickelt. </li><li> Am Ende jedes Experiments permeabilisieren Zellen mit 0,1 mM Digitonin in 10 mM CaCl 2 in HBS, um alle verbleibenden Photonenemissionen zu lösen. Hinweis: Diese photonischen Emissionen müssen, um die Gesamtphotonenemissionen, eine für die Kalibrierung in Ca 2+ Konzentrationen erforderlichen Wert zu schätzen hinzugefügt werden &lt;./ li&gt; <li> Speicher Biolumineszenz Bilder in dem Computer mit dem GFP assoziiert Fluoreszenzbild vor der Photonenzählung Bildgebung erfasst. </li></ol></li><li> Analyse der Biolumineszenz Bilder reflektieren mitochondriale [Ca 2+]. <ol><li> Quantifizierung photonischen Emissionen unter Verwendung spezifischer Software. Photonic-Emissionen zu mitochondrialen freien Ca unter Verwendung des von Brini et al. 15 beschriebenen Algorithmus umgewandelt werden 2+ -Konzentration ([Ca 2+] mit). </li><li> Öffnen Sie das Experiment und die GFP-Fluoreszenz Bild. Ausgewählte Bereiche von Interesse (ROIs) mit Hilfe spezifischer Software, indem die Form der transfizierten Zellen nach den Fluoreszenzbildern zu Beginn des Experiments eingefangen. </li><li> Fügen Sie die gleichen ROIs für jedes Bild. Gesamtphotonenemissionen in jedem ROI mit spezifischer Software, die Lumineszenzemission Wert (L) für jede Zelle in jedem Zeitpunkt zu erhalten, berechnet. </li><li> Alle photonischen EMISS hinzufügenIonen in der Biolumineszenz-Bilder, einschließlich der nach der Digitonin Permeabilisierung, mit der spezifische Software, um eine Biolumineszenz-Bild alle photonischen Emissionen zu erhalten, die erhalten diejenigen. </li><li> Exportwerte von Photonenemissionen für jeden Bereich von Interesse zu einer spezifischen Software für die Berechnungen. Um dies zu tun, klicken Sie auf &quot;Grafik&quot;, um die Biolumineszenz-Werte für jeden ROI zu jedem Zeitpunkt zu berechnen. Wählen Sie &#39;Gesamtwert&#39; und &#39;verwenden aktuelle ROI für alle Bilder. Drücken Sie &#39;berechnen&#39;. Speichern Sie die &#39;txt.file&#39; und Export von Daten auf ein Arbeitsblatt. Für jede ROI, [Ca 2+] mit berechnet wird unter Verwendung des folgenden Algorithmus: [Ca 2+] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; woher, R = [L / (L Gesamt λ)] 1 / n L die Lumineszenz zu dem Zeitpunkt der Messung in jedem interessierenden Bereich emittiert. L Gesamt istdas nach Zugabe der in dem Gewebe zu diesem Zeitpunkt zu dem Zeitpunkt der Messung für jeden interessierenden Bereich vorhanden Zählungen verbleibende Gesamt Lumineszenz. λ, K TR, K R und n Konstanten, dessen Werte auf Kombination von Aequorin (Wildtyp oder mutierte) und coelenterazin verwendet (Wildtyp oder n-Typ) als auch die Aufzeichnungstemperatur 16. Für die hier verwendete Kombination (mutiert AEQ und coelenterzine n), bei 37 ° C, haben wir die folgenden Werte: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 × 10 3, n = 1204 und λ = 0138. </li></ol></li><li> Stellen die entsprechenden Berechnungen zur Bestimmung der Größe des Anstiegs der Biolumineszenz als Antwort auf jeden Stimulus unter Verwendung eines geeigneten Datenanalyse und grafische Software. </li></ol>

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None of the authors have competing interests or conflicting interests.

Der Umbau von intrazellulärem Ca 2+ Homöostase im alternden Gehirn an kognitiven Verluste in Zusammenhang gebracht, erhöhte Anfälligkeit für ischämische Schädigung, Exzitotoxizität und Neurodegeneration. Um diese Hypothese in vitro zu untersuchen, sind Ca 2+ bildgebenden Verfahren zur Verfügung. Leider lebensfähige Kulturen von Hippocampusneuronen alt sind nicht zuverlässig. Vor kurzem wurde beobachtet, dass die Langzeitkulturen von Ratten-Hippocampusneuronen vorliegenden viele ...

Exzitotoxizität ist einer der wichtigsten Mechanismen, der einen Beitrag zur Neuronenschädigung und Zelltod in neurologischen Beleidigungen wie Ischämie und in einigen neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit ein. Diese Art von Neurotoxizität wird hauptsächlich durch Glutamat wirkend auf Ca 2+ vermittelte -durchlässigen, ionotropen NMDA-Rezeptoren (NMDAR) 2. Exposition von kultivierten Neuronen Glutamat kann Exzitotoxizität 3, die neuronale Apoptose 4 verursacht führen. Wir und andere haben bereits berichtet, dass die neuronale Anfälligkeit für NMDA-induzierte Apoptose bei der Entwicklung in vitro und Alterungs 5-8 ändern. Es ist weithin anerkannt, daß eine Erhöhung der cytosolischen freies Ca 2+ -Konzentration ([Ca 2+] cyt) führt zu Zellen-Aktivierung. Allerdings, wenn dieser Anstieg zu hoch ist und / oder genug aufrechterhalten, kann Zelltod 9 auszulösen. Außerdem wurde vorgeschlagen,daß Exzitotoxizität erfordert mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme 10, da die Behandlung von Neuronen mit einem mitochondrialen Entkoppler geschützt Neuronen gegen Glutamat-induzierte Zelltod 11. Wenn Mitochondrien zu viel Ca 2+ kann die Öffnung der mitochondrialen Permeability Transition Pore auftreten, was zu von Cytochrom c und andere pro-apoptotischen Faktoren und Induktion von Apoptose zu lösen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass diese mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme ist direkt mit der altersabhängigen Anfälligkeit Exzitotoxizität verwandte, durch direktes Messen NMDA-induzierten mitochondrialen Ca 2+ -Aufnahme in einzelnen Neuronen des Hippocampus 5, ein Verfahren, das in diesem Artikel berichtet wird. Der Hippocampus, in physiologischen Prozessen, wie Lernen, Gedächtnis und kognitiven Prozessen 12 beteiligt ist, sehr anfällig für Alterung und neurodegenerativen Störungen 13. Hat, die vorgeschlagen, nach mehreren Wochen in vitro kultiviertHippokampus-Neuronen zeigen eine Reihe von typischen Merkmale Alter von 14 Neuronen. Dementsprechend kann langfristige kultivierten Hippokampus-Neuronen bieten ein umfassendes Modell zur Ca 2+ vermittelte Mechanismen der verstärkten Exzitotoxizität in Alterung zu untersuchen. Das übergeordnete Ziel des vorgestellten Verfahrens ist daher die wesentliche Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ Homöostase oder Ca 2+ Umbau im alternden Gehirn untersuchen, einschließlich der Differential Ca 2+ Reaktionen, die durch NMDA-Rezeptor-Agonisten in einer langfristigen kultivierten Hippokampus-Neuronen ausgelöst . Das Verfahren enthält eine detaillierte Beschreibung der Kultur von Ratten-Hippocampus-Neuronen und die Überwachung der cytosolischen und mitochondriale Ca 2+ Konzentrationen von Fluoreszenz und Biolumineszenz-Bildgebung in einzelnen Neuronen auf. Fluoreszenz-Imaging der cytosolischen Ca 2+ in kultivierten Neuronen ist ein Standardverfahren. Jedoch ist dieses Verfahren zum Unter unzuverlässigerzelluläre Ca 2+ Messungen einschließlich mitochondrialen Ca 2+. Gründe dafür sind mangelhafte Ausrichtung der synthetischen Sonden und unangemessen Affinität für Ca 2+ Konzentrationen, die in den Mitochondrien von dem niedrigen Niveau uM sogar zum mM Ebene ändern können. Die Verwendung von Ca 2+ Sonden der Basis von Proteinen, wie zum Beispiel Aequorin, gestattete es dem Targeting subzellulären Organellen und die Verwendung von Derivaten unterschiedlichen Ca 2+ mit unterschiedlichen Affinitäten Coelenterazine oder mutierte Sonden fehlt spezifischen Ca 2+ Bindungsstellen 15. Auf diese Weise können Biolumineszenz-Bildgebung von Zellen Mitochondrien ziel Aequorin Expression der Überwachung der mitochondrialen Ca 2+ -Konzentrationen in einzelnen Neuronen zu ermöglichen. Doch kann dieses Verfahren erfordern die Verwendung von Photonenzählung Kameras oder CCD-Kameras für ultra Biolumineszenz-Bildgebung 16-18. Diese Methode kann neue Ergebnisse, die in mehr establ bestätigt werden sollteIshed Gehirnaltern Modelle wie zum Beispiel Gehirnschnitten von alten Tieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Culture Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (from bovine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bobine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips</td>
			<td>Labolan</td>
			<td>0111520/20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well multidish plaques</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petry dishes</td>
			<td>JD Catalan s.l.</td>
			<td>2120044T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura2-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine n</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>BT-10115-2250 uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDA</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite ilumination system</td>
			<td>EXFO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA ER fluorescence camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM photon counting CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC-8 valve controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-27B heating system&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquacosmos Software</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons

Anfälligkeit für Neuronen Zelltod zu Neurodegeneration und Ischämie verbunden sind außerordentlich im Alter von Gehirn erhöht, sondern Mechanismen verantwortlich sind schlecht bekannt. Exzitotoxizität, ein Verfahren angenommen, um Neuronenschaden durch beide Beleidigungen induzierte beizutragen, wird durch Aktivierung der Glutamat-Rezeptoren, Ca2 + -Einstrom und mitochondriale Ca 2+ Last fördert vermittelt. Eine wesentliche Änderung der intrazellulären Ca 2+ Homöostase oder Umbau von intrazellulärem Ca 2+ Homöostase kann Neuronenschäden in alten Nervenzellen begünstigen. Zur Untersuchung von Ca 2+ Umbau im Altern haben wir Live Cell Imaging in Langzeitkulturen von Ratten-Hippocampus-Neuronen, die in einigen Aspekten im Alter von Neuronen in vivo ähnlich verwendet. Zu diesem Zweck Hippocampus-Zellen sind, in erster Linie frisch aus neugeborenen Ratten-Hippocampus dispergiert und auf poli-D-Lysin beschichteten Deckgläser plattiert. Dann Kulturen werden in kontrollierten Medien für mehrere Tage aufbewahrt oder mehrere wochen zur Untersuchung von jung und alt Neuronen auf. Zweitens werden kultivierten Neuronen mit Fura2 verladen und nach Messungen des cytosolischen Ca 2+ -Konzentration mit digitalen Fluoreszenzverhältnis Bildgebung unterzogen. Drittens werden kultivierten Neuronen mit Plasmiden ein Tandem von geringer Affinität Aequorin und GFP zu Mitochondrien ziel transfiziert. Nach 24 Stunden wird Aequorin in Zellen mit Coelenterazin rekonstituiert und Neuronen zu Biolumineszenz-Bildgebung für die Überwachung der mitochondrialen Ca 2+ -Konzentration ausgesetzt. Dieses Drei-Schritt-Verfahren erlaubt die Überwachung der cytosolischen Ca 2+ und mitochondriale antwortet relevante Stimuli wie zum Beispiel die Glutamat-Rezeptor-Agonisten NMDA und Vergleichen, ob diese und andere Ergebnisse werden durch Alterung beeinflußt. Dieses Verfahren kann neue Erkenntnisse darüber, wie Alterungs Einfluss zytosolischen und mitochondrialen Ca 2+ Antworten auf ausgewählte Stimuli sowie die Prüfung der ausgewählten Medikamente zur Verhinderung von Neuronenzelle gerichtet ergebenTod im altersbedingten Krankheiten.

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, um Ca 2+ Umbau und die Effekte von NMDA auf cytosolische und mitochondriale beurteilen [Ca 2+] in gealterten Neuronen. 1 zeigt die schematische Darstellung des Verfahrens zum Isolieren und Kultivieren von hippocampalen Neuronen aus neugeborenen Ratten. Bevor Sie beginnen, müssen wir sterile, Poly-D-Lysin beschichteten Deckgläser vorbereiten und suchen Sie sie in einem 4-Well-Platte. Dann werden neonatalen Ratten getötet und das Gehirn ...

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Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

fluorescence-bioluminescence-imaging-subcellular-ca2-aged-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

8.3K Aufrufe.  Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas. Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. 

Serie: Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.