We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil R&#233;gional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.

1. Herstellung der Proben <ol><li> Herstellung von Lösungen und Einrichten <ol><li> Pflegen Sie alle Drosophila melanogaster Linien bei 24 ° C auf Standard-Lebensmittelmedium. Rear und halten sie in geringer Dichte in der Ampulle, standardisierte Größe und das Gewicht von Fliegen zu erzeugen. <ol><li> In 10 jungfräulichen Weibchen mit 10 Männern in einem Fläschchen, lassen Sie sie sich paaren und übertragen Sie alle 2 Tage in ein frisches Röhrchen. Dann wurden 10 Tage später, als die Fliegen beginnen zu schlüpfen, ernten die Fliegen jeden Tag. Halten Sie eine genaue Aufzeichnung der im Alter von den Fliegen und halten sie in gutem Zustand. </li><li> Am Tag 3, trennen Sie die Männchen von den Weibchen und halten die Weibchen 20 Fliegen pro Fläschchen. Nehmen Sie die Fliegen bei 4 oder 5 Tage alt. </li></ol></li><li> Vorbereitung Ringerlösung mit den folgenden Konzentrationen: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM HEPES und 36 mM Saccharose und den pH-Wert der Lösung genau 7.3. Bereiten Perfusionslösungen von 25 μ; M Nikotin und 100 mM KCl in Ringer-Lösung. </li><li> Bereiten 1.000 ul Pipettenspitze: mit einer Rasierklinge Form Spitze bis schräg (ca. 35 ° vom Ende der Spitze), und entfernen Sie überschüssige Base über 1 ½ Zentimeter von der Spitze. </li><li> Vorbereitung Kasten für die Lagerung (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) der Probe während der Inkubation. Legen Sie zwei Schwämme (12 cm x 8 cm x 3 cm) mit Wasser gesättigt in Boden unter einem kleinen Rack Gerät [auf Probe Austrocknung zu verhindern], um die Proben auf ihre Vorbereitung abgeschlossen zu platzieren. </li><li> Bereiten Fliegen Proben, so dass sie mindestens 1 Kopie des UAS-GFP-Aequorin und eine Kopie eines Gal4 Linie Expression von GFP-Aequorin zu fahren. OK107 Gal4 Linie (eine Linie die Expression vor allem in den Pilzkörpern) mit UAS-GFP-Aequorin in dieser Zubereitung gekreuzt. HINWEIS: Das Innere der Box muss wasserfest sein und die Außenseite muss Licht in Box, um den Abbau von Coelenterazin während der Inkubation zu verhindern blockieren. </li></ol></li><li> Preptung von Proben <ol><li> Eis anästhesiert Drosophila indem sie in eine Glasampulle und auf Eis für 2 min zu halten, bevor sie an der gekühlten Petrischale zur Positionierung in der Pipettenspitze bewegt. Bereiten Pipettenspitzen auf leicht angefeuchteten Filterpapier in 100 ml Petrischale auf Eis unter dem Dissektionsmikroskop. </li><li> Vorsichtig mit einer Pinzette Ort fliegen Innenseite Pipettenspitze. </li><li> Mit einem Pinsel vorsichtig schieben und ausrichten fly so dass der Kopf vollständig über den Rand der Spitze und der Rückenbereich ist teilweise durch den Abschnitt während der Spitzenformung (2B) entfernt ausgesetzt. </li><li> Kombinieren eine kleine (ungefähr 3-4 &amp; mgr; l) Abschnitte der beiden Komponenten des Dentalkleber. Tragen Sie den Klebstoff vorsichtig um die vorderen und hinteren Kopf und Hals auf und rund um die Pipettenspitze Kante - die Vermeidung der Krone des Kopfes. Lassen Sie den Kleber trocken für 2 min. </li><li> Platz Pipettenspitze mit geklebten fly durch Loch im Aufnahmeraum (2D) und Gen-tly drücken, um an Ort und Stelle zu sichern. </li><li> Kombinieren Sie die beiden Komponenten der Silikonkleber (ungefähr 3-4 &amp; mgr; l). Leim auf der flachen Seite der Kammer entlang der Kante, wo die Kammer und Pipettenspitze treffen, um Leck von der Ringerlösung zu verhindern. Lassen Sie den Kleber trocken für 2 min. </li></ol></li><li> Präparation <ol><li> Bringen Sie Klebeband über die Perfusionskanal kurzen Kante und sich an der Rückseite der Kammer. </li><li> Zeigen Kammer mit Fliege auf Dissektion Block unter dem Mikroskop wiederum auf Leuchtstofflampe. Pipettieren 1 ml Ringer-Lösung in die Kammer. </li><li> Verwenden Sie feine chirurgische Messer, um Nagelhaut entfernen. Machen parallele Einschnitte von der Rückseite des Kopfes, um anten Region. Dann entlang der Kante des Auges geschnitten dann einen senkrechten Schnitt über Antenne, welche die früheren Inzisionen. Einen endgültigen Schnitt parallel zu der an der Rückseite des Kopfes. Mit den feinen scharfen Pinzette Kutikula (2C) zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie feinen scharfen Pinzette vorsichtig greifen eind entfernt ausgesetzt klar abgeschlagen Atemwegsgewebe, bis das Gehirn und [fluoreszierenden] Pilzkörper wird übersichtlich visualisiert. </li><li> Verwenden Sie ultra-scharfen Pinzette vorsichtig greifen und kneifen abdeckt Gehirn, um für die Permeation des Coelenterazin ermöglichen neuroepithelialen Gewebe. HINWEIS: Alternativ Papain kann die Neuroepithels 9 permeabilisiert werden. </li><li> Unter Verwendung einer Pipette, waschen zweimal mit Ringer-Lösung, um alle Fremdkörper aus Präparation und Ort Probe im dunklen Kasten zu entfernen. </li><li> Pipette 1 ml Ringer-Lösung, die 5 uM benzyl-Coelenterazin in die Kammer. Schließen Sie die Box und lassen Inkubation mit Coelenterazin bei RT für ein Minimum von 2 Stunden. </li></ol></li></ol> 2. Imaging <ol><li> Konfiguration <ol><li> Starten Sie die Aufnahme-System: Schalten Sie Mikroskop, Computer, Kamera und Entwässerungssystem und stellen Raum Umweltkontrollen bis 25 ° C. </li><li> Offene Measurement and Automation Explorer-Programm auf dem Computer. Klicke auf &amp;#8220; Geräte und Schnittstellen &quot;, doppelklicken Sie dann auf&quot; NI Motion Devices &quot;und schließlich klicken Sie rechts auf&quot; PCI-7334 &quot;und wählen Sie&quot; Gerät initialisieren &quot;. </li><li> Öffnen Photon Imager. Neuen Ordner anlegen und benennen erste Aufnahmedatei. Kamera darf -80 ° C zu erreichen, bevor System wird funktionieren. </li><li> Richten Sie Perfusionssystem - fügen KCl, Nikotin und Ringer-Lösung zu Lagerstätten und so das jeder Lösung Entladungen bei 2 ml / min einzustellen. Mit Lösung Ringer vor Beginn der Experiments waschen. </li></ol></li><li> Bereiten Probe <ol><li> Platz Bildgebung Montageblock Teller auf dem Berg unter dem Mikroskop zu 5fache Vergrößerung und legen Perfusion Rohr in den Kanal durch Punktion. </li><li> Set Mikroskop Fluoreszenzmodus dann Zentrum und bringen Pilzkörper (MBS) in den Fokus. Passen Sie auf 20X und Wiederzentrum und Fokus. </li><li> Position Drainagevorrichtung über Drainagebecken, Höhe einstellen des Drainage Shunt so dass die Spitze ist nur Above-Pool, und führen Ringer-Lösung für 30 Sekunden, um das Abfließen zu gewährleisten. </li><li> Pull-Down-Schild den Inhalt vor Licht abzudichten Gerät. Unter Verwendung des automatisierten Systems in Photonen-Imager Feineinstellungen, um den Fokus und nehmen Sie ein Referenzfluoreszenzbild der MBs. </li></ol></li><li> Aufnahme <ol><li> Einstellen Photonengeschwindigkeit auf gewünschte Aufnahmegeschwindigkeit (von 50 ms bis zu 1 s oder mehr). Photonen-Modus auswählen und offener Blende. Nehmen Genotyp, Geschlecht, Alter und Probennummer im Log-Einträge. Stellen Sie die Position ROI Boxen über Kelch und Zellkörper (CCB) und mediale Lappen durch Klicken auf die ROI-Boxen und Ziehen bei gedrückter Steuerungs. </li><li> Record Grundlinie für etwa 5 bis 10 min (je nach Wunsch). </li><li> Gelten Nikotin für 1 min. Beachten Sie, Start / Stopp in log. Mit Ringerlösung für 5 min waschen. </li><li> Warten Sie 5 Minuten für die Wiederherstellung und bereiten KCl Protokolleintrag und Timer. </li><li> Gelten KCl für 1 min. Beachten Sie, Start / Stopp in log. Mit Ringerlösung während 1 min waschen. </li><li> SchalterFluoreszenzmodus, nehmen Sie endgültige Fluoreszenzbild und schalten Sie Ringerlösung. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Stop&quot;. Dialogfeld werden Sie gefragt, zum Ausschalten des Systems. Wählen Sie &quot;Nein&quot;, um die Aufnahme fortzusetzen. </li><li> Öffnen Schild, verschieben Drainagesystem, Schaltlinsenobjektiv bis 5X, entfernen Perfusion Rohr. Entfernen Probe / Aufnahme Gericht aus Stufe reinigen 20X Linse durch Spülen und zweimal wischen Sie das Objektiv mit Wasser. </li><li> Drücken Sie die Play-Taste weiß am oberen Rand des Programmfensters, um die nächste Aufzeichnung zu starten. </li></ol></li></ol> 3. Analyse und Video Creation <ol><li> Auszug Photonenwerte <ol><li> Öffnen Sie das Photon-Analyse-Programm (zB Photon Viewer) und offene erste Probentabellendatei. </li><li> Wählen Sie die Display-Steuerung Registerkarte. Wählen Sie die ROI, indem Sie auf die Region bei gedrückter Steuerungs. Passen Sie Größe, Ausrichtung und Form der Bereiche von Interesse, um GFP beleuchtet CCB und mediale Lappen umfassen. </li><li> Fügen Sie einen Zusatzal ROI, indem Sie auf und auf &quot;ROI definieren&quot; und Ziehen auf dem Bildschirm, um die neue ROI erstellen. </li><li> Wählen Sie die &quot;Movie&quot;, um Photonen-Video zu spielen. Stellen Sie &quot;s Breite&quot; und &quot;sec Schritte&quot; nach Wunsch. Nachstellen ROI Platzierung wie nötig. </li><li> Wählen Vertreter Screenshots der GFP-Fluoreszenz, Nikotin Antwort und KCl Antwort. Crop Screenshots und Bild Paste in eine Präsentationsfolie zur späteren Analyse und Vergleich. </li><li> Passen Sie sowohl die &quot;s Breite&quot; und &quot;sec Schritt&quot;, um die Aufnahmegeschwindigkeit in Sekunden. Wählen Sie Länge von Analyse, indem graue Markierungen auf obere Platte an der Halterung Region vor Stimulus Initiierung und unmittelbar nach Ansprechen Ende. </li><li> Wählen Sie &quot;Suspend Blick während des Spielens&quot; Presse &quot;&lt;&lt; REW&quot; und drücken Sie &quot;PLAY&gt;&quot;. Wählen Sie die Registerkarte &quot;Zählrate Chart&quot; und passen Einheiten wie gewünscht und Linienfarben, um ROI Farbe. </li><li> Wenn die Analyse abgeschlossen istDrücken Sie &quot;Export Zählratendaten&quot;. Wählen Sie Screenshots von kombinierten Aufnahmen CCB und mediale Lappen Region von Interesse von jeder Seite. Crop Screenshots und Bild Paste in einem Objektträger mit Reaktions Bilder. Diese Folie wird später in der endgültigen Analyse verwendet werden. </li></ol></li><li> Beispiel Analyse: eine Methode zur Analyse der extrahierten Photonendaten detailliert <ol><li> Öffnen Sie das Tabellenkalkulationsdateien in &quot;Zählrate Exporte&quot; -Ordner. </li><li> Formatieren Sie die Zellen der ersten Spalte mit der Zeit, um die Zeit in Stunden und Minuten angezeigt. </li><li> Verweisen Sie auf das entsprechende Schieber für die Probe. Entfernen Sie alle Werte außer den Spalten für die Zeit und die beiden Vertreter ROIs. </li><li> Bestimmen Sie Nikotin-Stimulation Startzeit - im Protokolleintrag Datei im Haupt Ordner- Zusatzdaten vor der Inbetriebnahme oder Highlight-Wert zu entfernen. </li><li> Finden höchste / Spitzenwert sowohl für CCB und mediale Keule und Zeichen / Highlight. </li><li> Bestimmen Sie Antwort Start- und Endzeit für beideCCB und mediale Lappen durch die Schaffung einer Schätzung unter Verwendung von Zeitpunkt aus entsprechenden grafisch dargestellt Reaktion auf Folie und wählen Sie Ist-Wert von Wertewandel in der Nähe zu diesen Punkten. Streichen den Bereich zwischen diesen Punkten in sowohl der CCB und mediale Lappen. Alternativ können Sie einen Makro-9. </li><li> Kombinieren Sie alle Proben einer Versuchsgruppe auf einem neuen Arbeitsblatt. </li><li> Richten Sie am Gipfel durch die Bestimmung der Zeilenwert ist für jede CCB Spitzenwert. Subtrahieren Sie die unteren Werte von höchsten Zeilenwert um ungefähre Zeilenwert, wo die Probe Daten müssen erneut kopiert werden, zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass alle Spitzenwerte ausgerichtet sind. </li><li> Kopieren Sie das Blatt zweimal und entweder der medialen Lappens Spalten oder die CCB Spalten Erstellen von Seiten von nur CCB oder medialen Lappens Werte zu löschen. </li><li> Daten zu entfernen, nachdem die alle CCB Antworten wurden beendet. Erstellen Sie vier Zeilen markiert Gesamt Photonen, Antwortlänge (Dauer), Peak-Amplitude und Antwortlatenz. Kopiere den wieder unter den Originalen. </li><li>Verwenden Sie die Funktion SUMME, um insgesamt Photonen während der Reaktion zu bestimmen. Verwenden Sie die COUNT-Funktion, um Länge der Antwort zu bestimmen. Kopieren und verbinden höchsten Wert Zelle zu Spitzenamplitudenwert zu bestimmen. Verwenden Sie COUNT-Funktion - vom Beginn der Perfusion von Nikotin zu Beginn der Reaktion zu wählen - den Antwortlatenzzeit zu bestimmen. </li><li> Copy-Werte mit Hilfe der Verknüpfungsfunktion und mehrfach (alle außer Spitzenamplitude) durch Aufzeichnung Geschwindigkeit in Sekunden. </li><li> Bar / box Graphen kann für berechneten Parameter wie Total Photonen, Spitzenamplitude und Antwortlänge erzeugt werden, wenn dies gewünscht wird (Bsp .: 5B, C, D). </li><li> In der Spalte nach der Rohdaten Photonenreaktion, der Mittelwert der Rohdatenpunkte für jeden Zeitpunkt unter Verwendung von Durchschnittsfunktion. Wenn mit einer Säule zur Festlegung der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) gewünschten folgen, für jeden der gemittelten Photonenwerte zu einem Zeitpunkt. </li><li> Verwenden Sie die durchschnittliche Spalte, um eine durchschnittliche Antwort profil konstruierene [Graph] für die CCB Probengruppe. Wählen Sie dazu die Spalte die Angabe der Zeit wie die x-Achse Werte und die Spalte des durchschnittlichen Photonenwerte als der y-Achse und schließlich die Streudiagrammerstellung Werkzeug auswählen. </li><li> Wiederholen dieses Analyseverfahren mit den Daten aus den medialen Lappen. </li></ol></li><li> Erstellen von Images für das Video <ol><li> Offene Photonen Betrachter. </li><li> Wählen Sie die Display-Steuerung Registerkarte. Klicken Sie auf ROI bei gedrückter Steuerungs auszuwählen, zu entfernen und / oder zu minimieren, ist es. </li><li> Ändern &quot;sec Breite&quot; (Akkumulationszeit), wie gewünscht, den Inhalt jedes Rahmens zu bestimmen. </li><li> Ändern &quot;sec Schritt&quot;, um die Überlappung der einzelnen Frames zu definieren. </li><li> Wählen Sie &quot;Export Blick während des Spielens&quot; Presse &quot;&lt;&lt; REW&quot; und dann &quot;PLAY&gt;&quot;. Die Bilder für das Video wird an den &quot;Blick Exporte&quot; Ordner als eine Reihe von PNG-Dateien exportiert werden. </li></ol></li><li> Eine Methode für Video c: Verwenden von Virtual Dub Video zu machen,reation detaillierten <ol><li> Erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Namen &quot;resultats&quot; in der Ordneransicht Exporte mit den Bildern. </li><li> Bringen Sie script (renommer.VBS) in den Ordner mit Bildern. </li><li> Klicken Sie doppelt auf renommer.VBS zu laufen. </li><li> Bilder werden automatisch numerisch umbenannt und auf &quot;resultats&quot; Ordner kopiert werden. </li><li> Offene VirtualDub.exe. </li><li> Wählen offenen Video-Datei - wählen Sie zuerst eine Bild (nachfolgenden Bildern wird automatisch geladen). </li><li> Wählen Sie Video - wählen Framerate wie gewünscht einzustellen. </li><li> Wählen Sie Video - wählen Kompression wählen Cinepak Codec von Radius. </li><li> In Datei wählen Sie Speichern als AVI-Video wird automatisch erstellt. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+imaging:+fluorescence+or+bioluminescence,+which+to+choose.">In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose.</a> J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidized+coelenterazine,+the+active+group+in+the+photoprotein+aequorin.">Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+data+on+the+bioluminescent+protein,+aequorin.">Further data on the bioluminescent protein, aequorin.</a> J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).</li><li>Baubet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein-aequorin+as+bioluminescent+Ca2++reporters+at+the+single-cell+level.">Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).</li><li>Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biogenic+amine+and+a+neuropeptide+act+identically:+tyramine+signals+through+calcium+in+Drosophila+tubule+stellate+cells.">A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells.</a> Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).</li><li>Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+patterns+of+calcium+transients+during+neural+induction+in+Xenopus+laevis+embryos.">Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos.</a> J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).</li><li>Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Br&#251;let, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca2++signalling+in+the+brain+of+Drosophila.">In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2 (3), e275 (2007).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Ca2++stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons.">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., R&#233;al, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-stores+mediate+adaptation+in+axon+terminals+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+Drosophila.">Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 12, 105 (2011).</li><li>Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+and+cAMP/CNG+channels+independently+regulate+the+cholinergic+Ca2+-response+of+Drosophila+mushroom+body+neurons.">PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons.</a> eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).</li><li>Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functional+calcium+imaging+of+induced+or+spontaneous+activity+in+the+fly+brain+using+a+GFP-apoaequorin-based+bioluminescent+approach.">In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach.</a> BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).</li><li>Lima, S. Q., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+properties+of+recombinant+semisynthetic+aequorins+and+recombinant+fluorescein-conjugated+aequorin+for+measuring+cellular+calcium.">Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium.</a> Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).</li><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Fiala, A., Spall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+of+brain+activity+in+Drosophila+by+transgenic+cameleon+expression.">In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression.</a> Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Olfactory+Representations+in+the+Drosophila+Antennal+Lobe.">Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe.</a> Science. 303 (5656), 366-370 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das kürzlich entwickelte Biolumineszenz basierende GFP-Aequorin hier vorgestellte Ansatz ermöglicht in vivo funktionelle Aufnahme von Ca 2+ -Aktivität in verschiedenen Neuronen sowie wenn gewünscht, mit anderen Arten von Zellen, wie zum Beispiel Nierensternzellen nach Cabrero et al. 2013 5. Modifikationen, Fehlersuche, zusätzliche Komponenten und kritischen Schritte Drosophila...

Die grundlegende Strukturierung und Funktion der Aktivitäten innerhalb des Gehirns und seiner diskreten Strukturen sind seit langem ein Gebiet intensiver Studie auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Vielleicht einige der frühesten erfolgreiche Ansätze verwendet werden, um dieses Problem zu beheben waren direkte physiologische Messung der Änderung in der elektrischen Aktivität - aber alternative Methoden, die Live-Darstellung von Spannungsänderungen, pH-Wert oder Calciumkonzentrationen (als Proxy für die Aktivität) zu ermöglichen haben zusätzliche Fähigkeiten gebracht die Untersuchung der neuronalen Aktivität 1. Bildgebungstechniken tragen eine Vielzahl von Vorteilen, wie reduzierte Invasivität und die Fähigkeit, im gesamten Gehirnstrukturen zu überwachen Aktivität. Außerdem bei Tieren mit gefügig Genetik einschließlich der Fruchtfliege Drosophila, die Entwicklung von genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren, wie Cameleon, GCaMPs und andere 1 haben Forscher erlaubt, einzelne Nervenzellen, neuronale Populationen und ganzer Gehirn überwachenStrukturen. Während traditionelle fluoreszierende Kalzium-bildgebenden Verfahren unter Verwendung GCaMPs (GFP an Calmodulin fusioniert) oder FRET (CFP und YFP an Calmodulin abgesichert) haben sich als nützliche Techniken eine gute räumliche und zeitliche Auflösung zu sein, die zugrunde liegende Prozess der Lichtanregung erzeugt einige Einschränkungen auf seine experimentelle Anwendungen. Aufgrund der Natur der Lichtanregung, Autofluoreszenz, Photobleaching und Phototoxizität unvermeidlich erzeugt wird, was folglich begrenzt die Tiefe der Strukturen, die abgebildet werden kann, die Dauer der Aufnahme sowie die Echtzeit-kontinuierliche Aufzeichnung. In anderen Worten muss Aufzeichnungen oft intermittierend durchgeführt werden, um diese unerwünschten Nebenwirkungen zu vermeiden. Wegen dieser Probleme wurden zusätzliche alternative Verfahren der Calcium Bildgebung entwickelt. Einer der vielversprechendsten Methoden ist biolumineszierenden Bildgebung, die auf Licht, das durch eine enzymatische Reaktion nach der Calciumbindung hergestellt beruht. Bioluminescent-Bildgebung erfordert keine Lichtanregung und damit nicht die gleichen Schwierigkeiten wie herkömmliche Calcium Imaging zu erleben. Die Biolumineszenz Reporter Aequorin - von Aequorea victoria isoliert, das gleiche Quallen, von dem GFP wurde auch isolated- bindet Kalzium über seine drei EF-Hand-Strukturen und eine Konformationsänderung, die zur Oxidation von seinem Co-Faktor Coelenterazin und die Freisetzung von blauem Licht (λ = 469 nm) 2,3. Aequorin hat eine sehr niedrige Affinität für Calcium (K d = 10 &amp; mgr; M), was es ideal für die Überwachung Calciumtransienten weil sie erzeugt nur wenig Hintergrundrauschen und nicht mit der intrazellulären Calcium-Puffersystem 4 eingreifen lässt. Obwohl Aequorin bereits verwendet wurde, um den Prozess der neuronalen Induktion im Xenopus-Ei 5 das erzeugte Licht zu überwachen, ist zu schwach, um für eine Echtzeitabbildung der neuronalen Aktivität verwendet werden. In dem Bemühen, diese Herausforderung, Philippe Br &amp; Adresse# 251; lassen und Kollegen am Institut Pasteur erstellt ein genetisches Konstrukt Verschmelzen GFP und Aequorin Genen, imitiert den nativen Zustand in der Quallen 4. Dieses Fusions Genprodukt bindet Calcium wieder über die drei EF-Handstrukturen Aequorin, das eine Konformationsänderung führt zu Oxidation von Coelenterazin, die Energie strahlungslos auf die GFP überläuft. Diese Energieübertragung führt zur Freisetzung von grünem Licht (λ = 509 nm) von GFP anstelle von blauem Licht von Aequorin. Die Fusion von GFP und Aequorin verleiht auch höhere Proteinstabilität hilft das Fusionsprotein produzieren Licht 19-65 mal heller als allein 4 Aequorin. Unter Verwendung eines Biolumineszenz-Ansatz im Gehirn erweitert die aktuelle experimentelle Anwendung von Calcium-Bildgebung sowohl in Bezug auf die Dauer der kontinuierlichen Aufzeichnung und die Anzahl der Strukturen innerhalb des Gehirns, die aufgezeichnet werden können. Im Großen und Ganzen im Rahmen der bisherigen Arbeit es bedeutet, dass sowohl globale als auch eine größereVielzahl von regionalisierten &quot;Aktivität&quot; des Gehirns (über den Proxy von Calciumtransienten) überwacht werden. Noch wichtiger Aktivität kann mehr überwacht werden, in einem Echtzeit und kontinuierlicher Weise, die ohne weiteres eignet sich für die Ausübung der ein vollständiges Verständnis der Basisfunktion im Gehirn. In den letzten Jahren haben unser Labor und andere transgene Fliegen, die das GFP-Aequorin unter der Steuerung des binären Expressionssystem (GAL4 / UAS-GFP-Aequorin) 5,6 exprimieren entwickelt. Wir GFP-Aequorin-Biolumineszenz durch natürliche Reize wie Duft 7,8 sowie suchten Zellkomponenten Modulieren Ca 2+ -Aktivität in den Pilzkörpern folgenden Acetylcholinrezeptorstimulation durch direkte nikotinischen Anwendung 9 erzeugte Datensatz Aktivität verwendet. Darüber hinaus haben wir auch verwendet GFP-Aequorin, um eine Reihe von experimentellen Fragen, die nicht in der Lage gewesen zu bisher angegangen werden, wie Langzeit-AdresseBildgebung der spontanen Calciumtransienten und Visualisierung von tieferen Hirnstrukturen 10. In jüngerer Zeit haben wir die GAL4 / UAS-System verwendet, um die Säuger-ATP-Rezeptor P2X 2 11 einen Kationenkanal, in den Projektionsneuronen (PNs) auszudrücken und verwendet die LexA System GFP-Aequorin in den Pilzkörpern exprimieren (MB247-LexA 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (a freundlicher Genehmigung von B. Pfeiffer, Janelia Bauernhof, USA). Dies ermöglichte es uns, die PNs durch Anwendung von ATP, das wiederum aktiviert den Pilzkörpern (a nachgeschalteten Ziel des PNs) zu aktivieren, die Nachahmung natürlicher Bedingungen, wie als Antwort auf eine Geruchsreiz. Insgesamt ist diese Technik kombiniert P2X 2 und GFP-Aequorin erweitert die experimentellen Möglichkeiten. Im Großen und Ganzen bietet es die Möglichkeit, die Aktivitätsmuster im Gehirn besser zu verstehen, die Einleitung neuer Studien darüber, wie verschiedene Reize und Störungen können die basalen Strukturierung der Aktivitäten zu ändern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1023911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL&#160;</td>
			<td>prolabo</td>
			<td>26 764.298</td>
			<td>normapur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>prolabo</td>
			<td>25 108.295</td>
			<td>normapur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzyl-coelenterazine</td>
			<td>Prolume, nanolight&#160;</td>
			<td>Cat #301 Coelenterazine h</td>
			<td>http://www.prolume.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dental glue</td>
			<td>3M ESPE&#8482;</td>
			<td>46954</td>
			<td>Protemp&#8482; IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon glue</td>
			<td>3M ESPE&#8482;</td>
			<td>36958</td>
			<td>Express&#8482; 2 Regular Body Quick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td>122s</td>
			<td>3M Scotch Magic Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>4868</td>
			<td>100-1000&#181;L Univesal Pipette Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chamber and holder (stage)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubation box</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (No 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Micro-dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td>Micro-dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glue applicator&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>5mm Depth 15&#176; stab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td>iXon (cooled to -80&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse-E800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20x Fluor .5w</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection microscope with fluorescence</td>
			<td>Leica MZ Fl III</td>
			<td>N/A</td>
			<td>leica dissection scope and florescent lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tight dark box</td>
			<td>Science Wares</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom built by Science Wares</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Minipuls 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>depends on thickness</td>
			<td>Tygon R3603, St-Gobain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0135 &#160;(VC-66CS)</td>
			<td>Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion regulators</td>
			<td>Leventon</td>
			<td>201108</td>
			<td>Dosi-flow 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>measurement and automation explorer</td>
			<td>Sciences Wares &#38; National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photon imager&#160;</td>
			<td>Science Wares &#38; National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photon viewer</td>
			<td>Science Wares &#38; National Instuments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software https://www.microsoft.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>virtual dub</td>
			<td>open access&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://virtualdub.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-GA2</td>
			<td>Martin et al., 2007, Ref. 1&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;No stocks {currently} publicly available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP&#160;&#160;</td>
			<td>B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.&#160;</td>
			<td>(STOCK #1117340)</td>
			<td>pfeifferb@janelia.hhmi.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2X2</td>
			<td>Lima and Misenboeck, Ref. 11&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;No stocks {currently} publicly available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OK107</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>854</td>
			<td>http://flystocks.bio.indiana.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo functional brain imaging approach based on bioluminescent calcium indicator gfp-aequorin

Funktionelle in-vivo-Bildgebung hat sich zu einem leistungsfähigen Ansatz, um die Funktion und Physiologie von Gehirnzellen und Strukturen von Interesse zu studieren. Vor kurzem wurde ein neues Verfahren zur Ca 2+ -Imaging Verwendung des Biolumineszenz-GFP-Reporter Aequorin (GA) ist entwickelt worden. Diese neue Technik beruht auf der Fusion von GFP und Aequorin Genen, wodurch ein Molekül in der Lage zum Binden von Calcium und - unter Zugabe von dessen Co-Faktor Coelenterazin - emittierende helle Licht, das durch ein Photon Sammler überwacht werden können. Transgene Linien Tragen des GFP-Aequorin-Gens für Mäusen und Drosophila erzeugt. Bei Drosophila wurde die GFP-Aequorin-Gen unter der Kontrolle des GAL4 / UAS Binärausdruck Systems für die gezielte Expression und Imaging im Gehirn platziert. Dieses Verfahren wurde später gezeigt, dass sie erfassen kann sowohl nach innen Ca 2+ -Transienten und Ca 2+ aus inneren speichert -released. Am wichtigsten ist es ermöglicht eine größere Dauer in eine kontinuierliche Aufzeichnung, Imaging in größerer Tiefe innerhalb des Gehirns, und die Aufzeichnung mit hoher zeitlicher Auflösung (bis zu 8,3 ms). Hier präsentieren wir die grundlegende Methode für die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung zu erfassen und zu analysieren, Ca 2+ -Aktivität in den Pilzkörpern, die eine Struktur von zentraler Bedeutung für Lernen und Gedächtnis im Fliegenhirn.

Die Fusion der GFP zu Aequorin erlaubt uns, unsere Region von Interesse vor der Biolumineszenz-Bildgebung durch Anregung von GFP in Fluoreszenzmodus am Mikroskop (Abbildung 3A, 4A, 6A, 6E) zu visualisieren. Eine der einfachsten Möglichkeiten, um die Pilzkörper zu stimulieren, durch Aktivierung der ionotropen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren. Obwohl Acetylcholin ist der endogene Ligand dieses Rezeptors haben wir gefunden, dass Nikotin erzeugt reproduzierbarer Antworten in den Pilzkörpern. Dies ist...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin at JoVE.com

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Hier präsentieren wir eine neuartige Ca 2+ -Imaging Ansatz unter Verwendung eines Biolumineszenz Reporter. Dieser Ansatz verwendet einen fusionierten Konstrukts GFP-Aequorin, das Ca 2+ bindet und emittiert Licht, wodurch die Notwendigkeit für Lichtanregung. Deutlich Dieses Verfahren ermöglicht lange kontinuierliche Bildgebung, Zugang zu tiefen Hirnstrukturen und hoher zeitlicher Auflösung.

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

in-vivo-functional-brain-imaging-approach-based-on-bioluminescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

12.2K Aufrufe.  UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud.  Hier präsentieren wir eine neuartige Ca 2+ -Imaging Ansatz unter Verwendung eines Biolumineszenz Reporter. Dieser Ansatz verwendet einen fusionierten Konstrukts GFP-Aequorin, das Ca 2+ bindet und emittiert Licht, wodurch die Notwendigkeit für Lichtanregung. Deutlich Dieses Verfahren ermöglicht lange kontinuierliche Bildgebung, Zugang zu tiefen Hirnstrukturen und hoher zeitlicher Auflösung. 

Serie: In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in the taste sensory organ. By integrating microfluidics into the intravital tongue imaging window, the &#181;Tongue provides reliable functional images of taste cells in vivo under controlled exposure to multiple tastants. In this paper, a detailed step-by-step procedure to utilize the &#181;Tongue system is presented. There are five subsections: preparing of tastant solutions, setting up of a microfluidic module, sample mounting, acquiring functional image data, and data analysis. Some tips and techniques to solve the practical issues that may arise when using the &#181;Tongue are also presented.

 &#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

The article introduces the &#181;Tongue (microfluidics-on-a-tongue) device for functional taste cell imaging in vivo by integrating microfluidics into an intravital imaging window on the tongue.

μTongue: Eine mikrofluidikbasierte funktionelle Bildgebungsplattform für die Zunge in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...