Diese Technik kann verwendet werden, um unser Verständnis des Umgangs mit Kalzium in Neuronen zu verbessern und zu verstehen, wie kompartimentiertes Kalzium verschiedene Mechanismen regulieren kann, die für die neuronale Funktion in vivo wichtig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnellere In-vivo-Bildgebung mit höherer Auflösung unter physiologischen Bedingungen in C. elegans ermöglicht, die mit anderen fluoreszierenden Werkzeugen kombiniert werden kann. Diese Technik könnte Einblicke in den Mechanismus geben, der die Kalzium-Signalübertragung in Neuronen in vielen verschiedenen Kontexten reguliert.
Zum Beispiel während des Alterns, neuronaler Verletzungen und Neurodegeneration. Dieses Verfahren demonstriert Ennis Deihl, Forschungstechniker. Kaz Knight, eine Doktorandin, und Rachel Doser, eine Postdoktorandin aus meinem Labor.
Beginnen Sie mit der Klonierung von Expressionsvektoren, die einen Promotor enthalten, gefolgt von einem Kalziumindikator und drei primären UTRs Ihrer Wahl. Erzeugung transgener C. elegans-Stämme durch Mikroinjektion einer DNA-Mischung, die die Rettungs-DNA Lin-15 plus im Kalziumindikator-Transgen enthält, in die Keimdrüse eines einen Tag alten erwachsenen C. elegans. Halten Sie die injizierten Elternwürmer bei 20 Grad Celsius, bis die F1-Nachkommen das Erwachsenenalter erreichen.
Wählen Sie transgene Erwachsene aus, indem Sie auf das Fehlen des Multivulva-Phänotyps screenen. Dies deutet auf die Expression des extrachromosomalen Arrays hin, das den Kalziumindikator enthält. Klonale Passage adulter F1-Nachkommen, die nicht den Multivulva-Phänotyp haben.
Durchführung von Experimenten an nachfolgenden Generationen der transgenen Stämme mit optimaler Expression des Calcium-Indikators. Verwenden Sie ein Mikroskop, das Langzeitaufnahmen im Zeitraffer ermöglicht. Lokalisieren Sie den Wurm unter einem Objektiv mit geringer Vergrößerung und wechseln Sie dann zu einem Objektiv mit hoher Vergrößerung, um die Neuronen zu lokalisieren.
Nehmen Sie die Bilder mit einer hochempfindlichen Kamera auf, die eine schnelle Bildaufnahme mit mehr als 50 Bildern pro Sekunde ermöglicht. Verwenden Sie als Nächstes einen Standard-Emissionsfilter für den Kalziumindikator. Fügen Sie einen Z-Drift-Korrektor für die Aufnahme von Bildströmen hinzu, die länger als 10 Sekunden sind.
Bereiten Sie in einem 13 x 100 Millimeter großen Glaskulturröhrchen drei Milliliter 10%iges Agar vor, indem Sie molekularen Agar in M9 auflösen und einige Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen. Um die Agar-Pads herzustellen, bereiten Sie zunächst zwei Objektträger vor, indem Sie zwei Schichten Laborklebeband hinzufügen. Legen Sie dann einen Objektträger zwischen die beiden Objektträger.
Schneiden Sie die Spitze einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze ab und pipettieren Sie damit einen kleinen Tropfen Agar auf die Mitte des Deckglases. Glätten Sie den Agar, indem Sie einen weiteren Schieber auf den Agar drücken. Schneiden Sie den Agar nach dem Abkühlen mit der Öffnung eines 10-Milliliter-Röhrchens in eine kleine Scheibe und entfernen Sie dann den umgebenden Agar.
Als nächstes bereiten Sie die Schneckenwalzlösung vor, indem Sie Muscimol-Pulver in M9 auflösen, um einen 30-Millimol-Bestand zu erzeugen. Verdünnen Sie das Material im Verhältnis eins zu eins mit Styroporperlen, um die Walzlösung herzustellen. Um den Wurm für die Bildgebung zu positionieren, geben Sie zunächst 1,6 Mikroliter der Rolllösung auf die Mitte des Agarpads.
Übertragen Sie dann mit einem bevorzugten Schneckenpickel eine Schnecke des gewünschten Alters in die Rolllösung auf dem Agarpad. Warten Sie etwa fünf Minuten, bis das Muscimol die Bewegung des Wurms reduziert hat, und legen Sie dann ein 22 x 22 Millimeter großes Deckglas auf das Agar-Pad. Für die Bildgebung von Neuriten im ventralen Nervenstrang rollen Sie den Wurm durch leichtes Schieben des Deckglases.
Um die Schnecke auf dem Mikroskop zu montieren, geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas. Finden Sie den Wurm mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung im Hellfeld. Wechseln Sie dann zum 100x-Objektiv und lokalisieren Sie den AVA-Neuriten mit der Beleuchtung des GCaMP oder mito GCaMP mit dem 488-Nanometer-Bildgebungslaser.
Passen Sie für die In-vivo-GCaMP-Bildgebung den Bildgebungslaser in den Aufnahmeeinstellungen an, bis die Basilikum-GCaMP-Fluoreszenz im mittleren Bereich des Dynamikbereichs der Kamera liegt, und stellen Sie die Belichtungszeit auf 20 Millisekunden ein. Nachdem der AVA-Neurit mit der GCaMP-Fluoreszenz bei 100-facher Vergrößerung lokalisiert wurde, stellen Sie den Z-Drift-Korrektor ein und starten Sie den kontinuierlichen Autofokus. Korrigieren Sie die Fokusebene vor der Bildgebung nach Bedarf manuell.
Erfassen Sie einen Strom von Bildern mit 100-facher Vergrößerung. Mit Hilfe dieses Protokolls wurde zytoplasmatisches Kalzium mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung gemessen. Die zellspezifische Expression von GCaMP6F in den glutamatergen Interneuronen des AVA-Kommandos zeigte eine gerichtete Ausbreitung des Calciumeinstroms.
Die subzelluläre Quantifizierung der GCaMP6F-Fluoreszenz zeigte, dass der Beginn des Kalziumeinstroms in einem nur 10 Mikrometer entfernten Teil des Neuriten verzögert war. Auch dendritische wirbelsäulenartige Strukturen, die entlang des AVA-Neuriten gefunden wurden, zeigten Blitze in der GCaMP6F-Fluoreszenz, die unabhängig von der Neuritenaktivierung auftraten und nicht zu einer Ausbreitung des Kalziumeinstroms führten. Weiterhin wurden die relativen Calciumspiegel in den einzelnen Mitochondrien in einzelnen Neuriten mit Hilfe eines Wurmstammes mit einer AVA-spezifischen Expression des mitochondrialen Matrix-lokalisierten Calciumindikators mito GCaMP gemessen.
Die Ergebnisse zeigten die synchrone Aufnahme einer relativ großen Menge Kalzium in eine Untergruppe von Mitochondrien. Insbesondere war die Kalziumaufnahme in einige Mitochondrien synchronisiert, während benachbarte Mitochondrien kein Kalzium aufzunehmen schienen. In ähnlicher Weise zeigten Untergruppen von Mitochondrien eine schnelle Aufnahme und Freisetzung kleiner Mengen an Kalzium.
Dies schien auch synchron zu sein, aber nur für eine Untergruppe von Mitochondrien. Schnelligkeit und feine Manipulationen sind unerlässlich, um Tiere zu positionieren und die neuronale Funktion zu erhalten. Auch die Tiergesundheit steht an erster Stelle.
Schon ein wenig Hunger ist problematisch. Am schwierigsten zu erlernen ist die schnelle Orientierung der Tiere für die konfokale Mikroskopie ohne Schäden. Mein Rat ist viel Übung und eine gute Kontrolle.
Dieses Protokoll könnte auf Experimente angewendet werden, bei denen Kalzium von anderen subzellulären Stellen in Neuronen, anderen Neuronen oder anderen Zellen als Neuronen in C. elegans freigesetzt wird. Da dieser Ansatz bei C. elegans die Tiere intakt lässt, ist es möglich, Fragen zur Regulation des subzellulären Kalziumhandlings in vivo in einzelnen Neuronen eines kompletten Nervensystems zu beantworten.
