We are grateful for expert technical assistance from the UNC Flow Cytometry Core and UNC Microscopy Core. We thank members of the Qian lab and the Liu lab for helpful discussions and critical reviews of the manuscript. This study was supported by NIH/NHLBI R00 HL109079 grant to Dr. Liu and American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 and the Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 to Dr. Qian.

Die hier vorgestellte Protokoll verwendet neugeborenen Mäusen. Tierpflege und Experimente werden in Übereinstimmung mit den von der Abteilung für Labortiermedizin (DLAM) an der University of North Carolina, Chapel Hill festgelegten Richtlinien durchgeführt. 1. Herstellung von Puffern und Medien <ol><li> Bereiten Fibroblasten (FB) Medium: Nachtrag 500 ml IMDM Medium mit 100 ml fötalem Rinderserum (FBS) und 6 ml Penicillin / Streptomycin. </li><li> Bereiten iCM Medium: Nachtrag 400 ml DMEM-Medium mit 100 ml M199 Medien und 50 ml FBS. </li><li> Bereiten B27 Medium: Nachtrag 490 ml RPMI1640 Medium mit 10 ml B27 Medien. </li><li> Bereiten Plat-E Kulturmedium: Nachtrag 500 ml DMEM-Medium mit 50 ml FBS, 5 ml Penicillin / Streptomycin und 5 ml Nicht-essentiellen Aminosäuren. </li><li> Bereiten Plat-E Transfektionsmedium: Nachtrag 500 ml DMEM-Medium mit 50 ml FBS und 5 ml Nicht-essentiellen Aminosäuren. </li><li> Prepare Gelatine beschichtete Platte mit 24 Vertiefungen: 0,5 ml 0,1% Gelatinelösung zu einer gut 24-Well-Platte, bei 37 ° C für mindestens 10 min und saugen rechts vor dem Gebrauch. </li><li> Vorbereitung FACS Markierungspuffer: Beilage 500 ml DPBS mit 10 ml FBS, 2 ml EDTA (0.5 M), um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Die Lösung durch ein 0,22 um Filter und bei 4 ° C. </li><li> Vorbereitung MACS Sortierpuffer: Beilage 500 ml DPBS mit 2,5 g BSA und 2 ml EDTA (0.5 M), um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Die Lösung durch ein 0,22 um Filter und bei 4 ° C. </li><li> Vorbereitung 2x HBS-Puffer für die Transfektion: Zusätzliche 500 ml HEPES-Puffer (50 mM) mit 280 mM NaCl (8,1816 g), 10 mM KCl (0,37275 g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM Glucose (1,08096 g ). In etwa 650 &amp; mgr; l 10 N NaOH auf pH-Wert auf 7,05 bis 7,12 anpassen. Man filtriert durch ein 0,22 um Porenfilter und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten 2,5 M CaCl 2 -Lösung zur Transfektion: Fügen 18,376 g CaCl 2 bis 50 ml ddH 2 O. Man filtriert durch ein 0,22 um Porenfilter und bei 4 ° C. </li><li> Bereitet ICC (Immunzytochemie) Fixierungspuffer: 5 ml Paraformaldehyd (PFA, 32%) zu 35 ml DPBS, um eine Endkonzentration von 4% erreicht werden. </li><li> Bereitet ICC Permeabilisierung Puffer: 0,1 ml Triton 100 ml DPBS, um eine Endkonzentration von 0,1% zu erreichen. </li><li> Bereitet ICC Blockierungspuffer: 5 g Rinderserumalbumin (BSA) und 100 ml DPBS auf eine Endkonzentration von 5% zu erreichen. </li><li> Bereitet ICC Färbepuffer: 1 g BSA auf 100 ml DPBS auf eine Endkonzentration von 1% zu erreichen. </li></ol> 2. Erzeugung von Neonatal Maus kardialen Fibroblasten <ol style="margin-left: 40px;"><li> Generieren kardialen Fibroblasten aus Explantatkultur Verfahren <ol><li> Sauber neonatalen &amp; alpha; MHC-GFP transgenen Maus (P1 bis P2) mit 75% Ethanol. Schneiden Sie den Kopf mit einer sterilen Schere. Dann machen Sie einen horizontalen Schnitt von unter einem Achselhöhle zu den anderen. Verwenden Sie eine sterilestumpf und gebogenen Pinzette zu sezieren das Herz heraus und legen Sie sie in einem Brunnen der 24 Well-Platte mit eiskaltem PBS-Puffer. <ol><li> Alternativ Squeeze-out der Herzen nach dem horizontalen Schnitt. </li></ol></li><li> Überprüfen GFP-Expression in Herz von Fluoreszenzmikroskop. Da der GFP-Expression durch &amp; alpha; MHC-Promotor, der ein herzspezifischen Promotor angetrieben wird, sollte der Kern aus transgenen Maus in grün 15, während der negative Herz dim jeden Fluoreszenz. </li><li> Nehmen Sie 3-4 GFP positive Herzen in eine 60 mm-Center auch Kulturschale und zerkleinern sie in kleine Stücke von weniger als 1 mm 3 in der Größe von sterilen Schere und Pinzette. </li><li> Zeigen 3-4 Hackfleisch Herzen in einer 10 cm Schüssel mit 2 ml FB Medien. Lassen Sie sich die Gewebe niederzulassen für 3 Stunden. </li><li> Langsam 8 ml vorgewärmten FB Medien zu den Schalen mit Herzgewebe. Das Gewebe nicht stören für drei Tage. </li><li> Ersetzen Sie die Medien alle drei Tage. </li><li> Am Tag 7 aspiraß das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit DPBS. 3 ml 0,05% Trypsin zu jeder Platte und Digest bei 37 ° C für 5 min. </li><li> 5 ml FB Medien Trypsin quenchen. Leicht lösen die Zellen mit einem Zellschaber. Pipettieren Sie die Medien auf und ab, um weiter mechanisch das Gewebe zu distanzieren. </li><li> Sammeln Zellen und filtriert über 40 um Zellsiebe, um eine Kontamination von Herzgewebefragmente zu vermeiden und zu pelletieren dann die Zellen durch Zentrifugieren bei 200 xg für 5 min. </li><li> Wash Zellen einmal mit MACS-Puffer und Zellen sind bereit für die Sortierung. </li></ol></li><li> Generieren kardialen Fibroblasten aus Enzymverdau Verfahren <ol><li> Ernte-GFP positive Herzen als 2.1.1. Übertragen Sie alle Herzen in einen 10 cm-Schale mit 10 ml eiskaltem DPBS. </li><li> Squeeze Ventrikel mit einer sterilen Pinzette, um Blut zu entfernen und einmal gründlich mit eiskaltem DPBS. </li><li> Schneiden Sie die Herzen frei von anderen Geweben und fettfrei sein. </li><li> Cut jedes Herz in etwa 4 Stücke, die noch lose verbunden sind. </li><li> Wenn weniger als 20 Herzen, zu übertragen, die Herzen in ein 15 ml konischen Rohr mit 8 ml warmes 0,05% Trypsin-EDTA, und bei 37 ° C für 15 min. <ol><li> Wenn es 20-30 Herzen, zu übertragen, die Herzen in ein 50 ml konisches Röhrchen mit 10 ml warmem 0,05% Trypsin-EDTA, und bei 37 ° C für 15 min. </li></ol></li><li> Entsorgen Sie die Trypsin und 5 ml (für weniger als 20 Herzen) oder 10 ml (20-30 Herzen) warme Typ II Kollagenase (0,5 mg / ml) in HBSS. </li><li> Vortex die Röhre auf Vortexer für 1 min bei einer Geschwindigkeit Niveau um 4 bis 6 (wenn die Flüssigkeit nicht aufstehen, um den Deckel, so wird die Geschwindigkeit ist in Ordnung). </li><li> Das Röhrchen bei 37 ° C Wasserbad für 3-5 min. </li><li> Das Röhrchen vortexen für 1 min. </li><li> Sediment für 1 min durch die Schwerkraft, bis die Gewebestücke niederzulassen, sammeln die Flüssigkeit in ein neues Röhrchen mit 5 ml kaltem FB Medium. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6-2.2.10 3-5 mal. </li><li> Kombinieren Sie all die Sammlungen durch Filtrieren durch 40 &amp; mgr; m Zellsiebzur Einzelzellsuspension zu machen. </li><li> Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen in 10 ml MACS-Puffer und Zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Optional: Wenn es eine Menge von Blutzellen, resuspendieren Zellen mit 1 ml RBC-Lyse-Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 und 0,1 mM EDTA), auf Eis halten für 1 min, dann mit 10 ml MACS verdünnen Puffer und Zentrifugieren bei 200 xg für 5 min. Ein weiteres Mal mit MACS-Puffer waschen. </li></ol></li><li> Isolierung von Thy1.2 + Fibroblasten durch MACS (magnetic cell separation) <ol><li> Bestimmen Sie Anzahl lebensfähiger Zellen durch Trypanblau-Färbung. <ol><li> Nehmen Sie 10 ul Zellen aus 10 ml Zellsuspension in Schritt 2.2.14. Mischen Sie es mit 10 &amp; mgr; l 0,4% Trypanblau-Lösung. </li><li> Das Gemisch in einem Hämocytometer. Lassen Sie es für 3-5 Minuten stehen gelassen und dann umgehend prüft unter dem Mikroskop. Die toten Zellen sind in blau und lebensfähigen Zellen gefärbt sind ungefärbt. </li><li&gt; Graf alle lebensfähigen Zellen in vier 1 mm Eckquadrate der Zählkammer. Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen: die durchschnittliche Zahl pro Quadrat x 2 (Verdünnungsfaktor) x 10 4 x 10 (Gesamtvolumen der Zellsuspension). </li></ol></li><li> Weniger als 1 x 10 7 Zellen Die Zellen werden mit 10 ul Thy1.2 Mikrokügelchen in 90 &amp; mgr; l MACS-Puffer gekühlt. Fügen Sie mehr Perlen proportional, wenn es mehr als 1 × 10 7 Zellen. Gut mischen und inkubieren im Kühlschrank (2-8 ° C) für 30 Minuten. </li><li> 10 ml MACS-Puffer und Spin-Proben bei 200 × g für 5 min; sofort abwaschen mit 10 ml MACS-Puffer und Zentrifuge wieder. </li><li> Bringt Volumen auf 2 ml in MACS-Puffer. </li><li> Up ein MACS Separator in Haube eingestellt. Legen Sie eine LS-Säule in den Separator. Eine 3 ml MACS zu dem Säulenpuffer, um sie äquilibrieren. </li><li> Übergeben Sie die Zellsuspension durch die äquilibriert LS Spalte. </li><li> 3 x waschen mit 2 ml MACS-Puffer jedes Mal. </li><li> Nehmen Sie die Spalte LS off ter Separator und eluieren 3 mal mit 2 ml MACS in eine neue 50-ml-Tube zu puffern. </li><li> Spin bei 200 × g für 5 min. </li><li> Die Zellen in 10 ml FB Medien, zählen Sie die Zellen und Samen in Platten an geeigneten Dichte. Fibroblasten aus Explantatkultur Verfahren erzeugt wird, kann die Aussaat Zellen Dichte um 2-3 × 10 4 Zellen / Vertiefung Platte mit 24 Vertiefungen sein. Fibroblasten aus Enzymverdau Verfahren erzeugt wird, könnte die Zellen Dichte um 4-5 × 10 4 Zellen / Vertiefung Platte mit 24 Vertiefungen sein. </li></ol></li></ol> 3. Erzeugung von Retrovirus für iCM Reprogrammierung Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte in einem BSL2 Biologische Sicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen. Die ordnungsgemäße Entsorgung von transfizierten Zellen, Pipettenspitzen und Röhren wird empfohlen, um das Risiko von Umwelt- und Gesundheitsgefahren zu vermeiden. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Aufrechtzuerhalten PLAT-E-Zellen in PLAT-E-Medium mit 1 &amp; mgr; g / ml Puromycin und 10 ug / ml b ergänztlasticidin bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Am Tag 2, ersetzen Sie das Medium durch Plat-E Kulturmedium fehlt Puromycin und Blasticidin. </li><li> Am Tag 0, aufgeteilt PLAT-E-Zellen, in 10-cm-Schalen am Tag vor der Transfektion auf etwa 4-5 x 10 6 Zellen pro Platte. Zellen sollten 80-90% konfluent waren am Tag der Transfektion werden ~. </li><li> An Tag 1, ändern Nährmedien in Transfektionsmedium auf Zellen innerhalb 1 h vor der Transfektion. Transfektionsverfahren ist wie folgt: <ol><li> Transfektion mit kommerziellen Kits <ol><li> Mischungs 20 ul Transfektionsreagenz (zB Lipofectamin) und 500 &amp; mgr; l reduziert Serum Medien (zB Opti-MEM). In 10 ug des retroviralen Plasmid, um weitere 500 &amp; mgr; l Serum-Medien reduziert. Inkubieren jeder Mischung bei Raumtemperatur (RT) für 5 min. </li><li> Langsam die Plasmid-Mischung auf Transfektionsgemisch. Dieser Schritt kann 15-30 Sekunden dauern. Inkubieren Sie die Mischung für 20 min bei RT (Lösung kann eine Trübung). </li&gt; <li> In Mischung tropfenweise zu den Zellen. </li><li> Beimpft und über Nacht in einem 37 ° C Inkubator. </li></ol></li><li> Transfektion mit Calciumphosphat. <ol><li> Mix 40 ul 2,5 M CaCl 2 und 440 &amp; mgr; l ddH 2 O, dann fügen Sie 20 ug des retroviralen Plasmid (stellen Sie die Menge ddH 2 O, so dass Gesamtvolumen von 500 &amp; mgr; l). </li><li> Gib 500 ul 2x HBS zu einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Mischen Sie den HBS und in der Zwischenzeit fügen die Calcium-DNA-Gemisch zu der HBS tropfenweise. Dieser Schritt dauert etwa 30 Sekunden für jede Probe. So maximal 3-4 Proben gleichzeitig zu tun. </li><li> Inkubation bei RT für 3 min Inkubation für längere Zeit führt zu größeren Niederschlag und weniger Zellen nehmen den Niederschlag. </li><li> In die Mischung tropfenweise zu den Zellen und beobachten unter 20X Mikroskop. Feine Ausscheidungen (viele kleine sind gut, aber ein paar Großen sind nicht gut) gesehen werden sollte. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C Inkubator. </li&gt; </ol></li></ol></li><li> Am Tag 2 ändern Medien auf Zellen mit 8 ml vorgewärmtem Kulturmedien. Inkubationszeit von 24 h. </li><li> An Tag 3 und Tag 4, sammeln Kulturüberstand aus den Schalen unter Verwendung einer sterilen 10 ml-Einwegspritze, Filtrieren über eine 0,45 um Porengrße Celluloseacetat-Filter und Überführen in eine 50 ml Röhre. 2 ml Retrofällungslösung zu jedem 8 ml virushaltigen Überstands. Vorsichtig mischen und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Am Tag 5 zu drehen, die das virale Mischung bei 1.500 × g bei 4 ° C für 30 min. Die viralen Partikel sollten in weißes Pellet am Boden des Röhrchens angezeigt. </li><li> Überstand verwerfen. Spin down Restlösung durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 5 min. Entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch Absaugen, wobei große Sorgfalt nicht, um die ausgefällten retrovirale Partikel in Pellet stören. </li><li> Resuspendieren retroviralen Pellets mit 100 ul DPBS-Puffer für jeweils 8 ml Virusüberstand. Aliquotdas Virus auf Eis. Verwenden Sie sofort oder bei -80 ° C. </li></ol> 4. Reprogrammierung von kardialen Fibroblasten <ol><li> In 4 ul 10 mg / ml Polybren Lösung in den 10 ml iCM Medium und vorsichtig mischen durch Auf-und Abpipettieren. Die Endkonzentration von Polybren 4 ug / ml. </li><li> Fügen Sie 500 ul iCM Medien, die Polybren zu jeder Vertiefung der 24-Well-Platte mit Fibroblasten beimpft. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l-Retrovirus in jede Vertiefung, die entweder von 2-3 × 10 4 Zellen von Explantatkultur oder 4-5 x 10 4 Zellen von Enzym-Aufschlußverfahren. Die Virusmenge, sollte proportional zu einer erhöhten Zellzahl in verschiedenen Kulturschalen oder Schalen erhöht werden. Legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator für 24-48 h, um die Virusinfektion zu ermöglichen. Die Zeitlinie für die Herz Neuprogrammierung wird in Abbildung 1 gezeigt. </li><li> Nach virale Transduktion, ersetzen Virus haltigen Medien mit 500 ul regelmäßigen iCM Medien. </li><li> Ändern Medien alle 2-3 Tage. Für die positive Selektion von viralen transduzierten Zellen, fügen iCM Medien mit Puromycin ergänzt mit 2 ug / ml an die Zielzellen. Halten Sie es für drei Tage. Danach halten Puromycin im ICM-Medium bei einer Konzentration von 1 ug / ml. </li><li> Drei Tage nach der Virusinfektion, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop (20x), um die GFP-Expression zu beobachten. Anmerkung: Zehn Tage nach der Virusinfektion, könnte Zellen für die FACS-Analyse und ICC-Analyse, um die Umprogrammierung Effizienz bestimmen geerntet werden (in Schritt 5 und 6). </li><li> Vierzehn Tage nach der Virusinfektion, ersetzen iCM Medien mit B27 Medien. Ändern Medien alle drei Tage. Spontane Schlagen Zell Loci kann aus drei (Zellen aus Enzym Verdauungsmethode) oder vier (Zellen aus Explantatkultur Methode) Wochen nach Virusübertragung angezeigt. </li></ol> 5. Immunzytochemische Analyse der Reprogrammierung Efficiency <ol><li> Rinse-Zellenmit eiskaltem PBS dreimal; Entfernen überschüssiger Lösung. </li><li> 0,5 ml ICC Fixierungspuffer zu jeder Vertiefung der Platten mit 24 Vertiefungen. Befestigen Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 15-20 min. </li><li> Spülen Zellen dreimal mit PBS. </li><li> 0,5 ml ICC Permeabilisierung Puffer in jede Vertiefung der 24-Well-Platten. Permeabilisierung der Zellen bei RT für 15 min. </li><li> Spülen Zellen dreimal mit PBS. </li><li> 0,5 ml ICC Blocking-Puffer in jede Vertiefung der Platte mit 24 Vertiefungen, Inkubation bei RT für 1 h. </li><li> Verdünnten primären Antikörper mit ICC Färbepuffer. Fügen Sie 200 ul Antikörperlösungen in jede Vertiefung beimpft und über Nacht bei 4 ° C. Die Antikörperverdünnungsfaktoren sind in Materialien aufgeführt. </li><li> Am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. </li><li> Fügen Sie 200 ul sekundären Antikörperlösungen zu den Zellen und Inkubation für 1 h bei RT im Dunkeln. </li><li> Wasche die Zellen mit PBS dreimal. </li><li> Fügen Sie 150 ul Montagelösung, die DAPI in jede Vertiefung. Ermöglichen, Keime für 1 min färben. Dannauf jede Auftragsstelle runden Deckglas und drücken Sie vorsichtig den Schlupf gegen die Bodenfläche mit einer Pinzette, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Absaugen überschüssige Lösung und die Proben sind bereit für Bildgebung. Die repräsentativen Bilder, welche die umprogrammiert Zellen, die zum Ausdruck bringen Herzmarker cTnT und αActinin bei d14 sind in 2B gezeigt. </li></ol> 6. FACS Analyse der Reprogrammierung Efficiency <ol><li> Gründlich waschen Zellen einmal mit DPBS. Zugabe von 0,3 ml Trypsin (0,05%) in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Klopfen Sie leicht die Platte zu erleichtern, die Aufhebung der Zellen. Überprüfen Sie die Zellablösung unter Mikroskop. 1 ml FACS-Puffer in jede Vertiefung gegeben, wenn die meisten Zellen werden dissoziiert. Pipette nach oben und unten, um weiter mechanisch distanzieren die Zellen. </li><li> Übertragen Sie Zellen in der 24-Well-Platte auf eine 96-Well Tiefbrunnenplatte auch gut. Schleudern bei 200 xg für 5 Minuten bei 4 ° C, um die Zellen zu sammeln. </li><li> Wasche die Zellen einmal mitFACS-Puffer. </li><li> 100 ul Fixierung / Permeabilisierung Lösungen um Zellen für 20 min bei 4 ° C zu suspendieren. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x Waschlösung, Pellet und Überstand zu entfernen. </li><li> Bereiten primären Antikörperlösung gegen GFP und cTnT in 1x Waschpuffer. Jede Probe mit 50 ul Antikörper-Lösung gründlich resuspendieren und Inkubieren bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal in 1x Waschlösung, Pellet und Überstand zu entfernen. </li><li> Zugabe von 50 &amp; mgr; l sekundärem Antikörper enthaltenden Lösung Alexa Fluor 488 konjugiert Esel-Anti-Kaninchen-IgG und Alexa Fluor 647 konjugiert Esel-anti-Maus-IgG zu jeder Probe. Inkubieren bei 4 ° C für 30 Minuten im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal in 1x Waschlösung, Pellet und Überstand zu entfernen. </li><li> Die Zellen in 400 ul Fixierungspuffer (DPBS mit 1% PFA). Bringen Zelle in FACS-Röhrchen mit Zellsieb Kappe. Die Proben sind bereit für die FACS-Detektion. Der Vertreter der FACS-Analyse von Umprogrammierung efficiency mit pMxs-Puromycin-MGT-Konstrukts mit oder ohne Puromycin-Selektion ist in 2A gezeigt. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+in+vitro+and+in+vivo+direct+reprogramming+of+cardiac+fibroblasts+to+cardiomyocytes.">MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes.</a> Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).</li><li>Muraoka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-133+promotes+cardiac+reprogramming+by+directly+repressing+Snai1+and+silencing+fibroblast+signatures.">MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures.</a> Embo J. 33, 1565-1581 (2014).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141, 4267-4278 (2014).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+fibroblasts+toward+a+cardiac+fate.">Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).</li><li>Protze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+transcription+factor+screening+for+reprogramming+of+fibroblasts+to+cardiomyocyte-like+cells.">A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).</li><li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro.">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+Molecules+Enable+Cardiac+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+with+a+Single+Factor,+Oct4.">Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4.</a> Cell Rep. , (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+Gata4,+Mef2c,+and+Tbx5+Influences+the+Efficiency+and+Quality+of+Induced+Cardiac+Myocyte+Reprogramming.">Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming.</a> Circ Res. , (2014).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485, 599-604 (2012).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485, 593-598 (2012).</li><li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cardiac+cellular+reprogramming+efficacy+is+enhanced+by+angiogenic+preconditioning+of+the+infarcted+myocardium+with+vascular+endothelial+growth+factor.">In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor.</a> J Am Heart Assoc. 1, e005652 (2012).</li><li>Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+thymosin+beta4+and+cardiac+reprogramming+factors.">Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors.</a> Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).</li><li>Muraoka, N., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+transcription+factors+is+critical+for+cardiac+reprogramming.">Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming.</a> Circ Res. , 116-216 (2015).</li><li>Srivastava, D., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+factors+for+cardiac+reprogramming.">Critical factors for cardiac reprogramming.</a> Circ Res. 111, 5-8 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Für erfolgreiche iCM Erzeugung bei der Verwendung dieses Protokoll gibt es mehrere wichtige Faktoren, die einen Einfluss auf den Gesamtwirkungsgrad zu haben. Insbesondere die Bedingungen für die Start Fibroblasten und die Qualität der Retrovirus-Codierung MGT kann großen Einfluss auf die Reprogrammierung Effizienz. Es wichtig ist, Fibroblasten zu erzeugen, wie frisch und gesund wie möglich. Für Explantatkultur Verfahren können Fibroblasten verwendet werden, bevor sieben Tage nach der ...

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide, accounting for 17.3 million deaths per year1. Loss of cardiomyocytes resulting from myocardial infarction (MI) or progressive heart failure is a major cause of morbidity and mortality2. Due to limited regenerative capacity, adult mammalian hearts usually suffer from impaired pump function and heart failure following injury3-6. As such, efficient (re)generation of cardiomyocytes in vivo and in vitro for treatment of heart disease and for disease modeling is a critical issue needing to be addressed.
Recent development of direct reprogramming, which directly reprograms cells from one differentiated phenotype to another without transitioning through the pluripotent state, offers a promising alternative approach for regenerative medicine. The mammalian heart contains abundant cardiac fibroblasts (CFs), which account for approximately half of the cells in heart and massively proliferate upon injury7-9. Thus, the vast pool of CFs could serve as an endogenous source of new CMs for regenerative therapy if they could be directly reprogrammed into functional CMs. It has been shown that a combination of transcription factors, such as Gata4 (G), Mef2c (M) and Tbx5 (T), with or without microRNAs or small molecules can reprogram fibroblasts into iCMs10-26. Importantly, this conversion can also be induced in vivo, and results in an improvement in cardiac function and a reduction in scar size in an infarcted heart16,27-29. These studies indicate that direct cardiac reprogramming may be a potential avenue to heal an injured heart. However, the low efficiency of iCM reprogramming has become a major hurdle for further mechanistic studies. In addition, the reproducibility of cardiac reprogramming is another controversial issue of this technology11,30,31. 
Very recently, we generated a complete set of polycistronic constructs encoding G,M,T in all possible splicing orders with identical 2A sequences in a single mRNA. These polycistronic constructs yielded varied G, M and T protein expression levels, which led to significantly different reprogramming efficiency25. The most efficient construct, named MGT, which showed a relatively high Mef2c and low Gata4 and Tbx5 expression, significantly improved reprogramming efficiency and produced large amounts of iCMs with CM markers expression, robust calcium oscillation and spontaneous beating25. Moreover, by using MGT polycistronic construct, our study avoided the use of multiple vectors and generated cells with homogenous expression ratio of G,M,T, thus providing an improved platform for cardiac reprogramming research. To increase experimental reproducibility, here we describe in detail how to isolate fibroblasts, produce retrovirus carrying MGT cassette, generate iCMs and evaluate the reprogramming efficiency.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1088">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:461px;">anti-cardiac troponin T</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:200px;">MS-295-PO</td>
			<td style="width:191px;">1:200 for FACS and 1:400 for ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-GFP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">A11122</td>
			<td>1:500 for both FACS and ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti- aActinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>1:500 for both FACS and ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Connexin43</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6219</td>
			<td>1:500 for&#160; ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anit-Mef2c</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:200px;">ab64644</td>
			<td>1:1000 for ICC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Gata4</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:200px;">sc-1237</td>
			<td>1:200 for ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Tbx5</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17866</td>
			<td>1:200 for ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor 488&#8211;conjugated donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>1:500 for both FACS and ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor 647&#8211;conjugated donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>1:500 for both FACS and ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:461px;">Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining</td>
			<td style="width:236px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:200px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rhod-3 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">R10145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thy1.2 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:200px;">130-049-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectashield solution with DAPI</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td style="width:200px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:461px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">F-2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:236px;">Corning</td>
			<td style="width:200px;">25-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PRMI1640 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IMDM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M199 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">10-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM, high glucose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:236px;">Corning</td>
			<td style="width:200px;">30-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">11130-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">11668500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">blasticidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">A11139-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">puromycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:200px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:236px;">Fisher</td>
			<td style="width:200px;">BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CaCl2</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:200px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Retrovirus Precipitation Solution</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td style="width:200px;">VC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4%Trypan blue solution</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gelatin</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">G1393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x)</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:236px;">Corning</td>
			<td style="width:200px;">21022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:200px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m cellulose acetate filter&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:200px;">190-2545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24-well plates</td>
			<td style="width:236px;">Corning</td>
			<td style="width:200px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10cm Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:200px;">172958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">60mm center well culture dish&#160;&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:200px;">3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 Well Clear V-Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td style="width:200px;">P9639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:461px;">Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:236px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:200px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:236px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:200px;">5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortexer MINI</td>
			<td style="width:236px;">VWR</td>
			<td style="width:200px;">58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EVOS&#174; FL Auto Cell Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">AMAFD1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:200px;">130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:200px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:461px;">Round glass cover slip</td>
			<td style="width:236px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:200px;">72195-15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved generation of induced cardiomyocytes using a polycistronic construct expressing optimal ratio of gata4, mef2c and tbx5

Direkte Umwandlung von kardialen Fibroblasten (CFS) in Kardiomyozyten induziert (ICMS) birgt ein großes Potential für die regenerative Medizin, indem sie alternative Strategien für die Behandlung von Herzkrankheiten. Diese Umwandlung wurde durch erzwungene Expression von definierten Faktoren wie Gata4 (G), Mef2c (M) und Tbx5 (T) erreicht ist. Traditionell ICMS werden von einem Cocktail von Viren, die diese individuellen Faktoren generiert. Reprogrammierung Effizienz ist jedoch relativ gering und die meisten der in vitro G, M, T-transduzierten Fibroblasten nicht zu voll umprogrammiert, so dass es schwierig ist, die Umprogrammierung Mechanismen zu studieren. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Stöchiometrie der G, M, T ist entscheidend für die effiziente iCM Neuprogrammierung. Eine optimale Stöchiometrie von G, M, T mit relativ hohen und niedrigen Pegeln M von G und T durch unseren polycistronischen MGT-Vektor (im Folgenden als MGT bezeichnet) deutlich erhöht Umprogrammierung Effizienz erzielt und eine verbesserte Qualität iCM in vitro. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung der Methode, nach der ICMS mit MGT Konstrukt von kardialen Fibroblasten zu generieren. Isolierung von kardialen Fibroblasten, Generation von Virus zur Neuprogrammierung und Bewertung der Umprogrammierung sind ebenfalls enthalten, um eine Plattform für die effiziente und reproduzierbare Erzeugung von ICMS bereitzustellen.

Die Umprogrammierung Schritte werden von schematischen in Figur 1 zusammengefasst. Nach MGT Transduktion, konnte die GFP-Expression in Zellen Umprogrammierung bereits an Tag 3. Puromycin-Selektion von transduzierten Zellen ab Tag 3 und wird während der ersten zwei Wochen aufrechterhalten erkannt werden, wenn pMX-puro -MGT Konstrukt verwendet. Von Tag 10 bis Tag 14 konnte die Expression von herzspezifische Marker wie cTnT und αActinin sowohl ICC (2B, Schritt 5) und FACS (2A,</s...

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Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming.

Verbesserte Generierung induzierter Kardiomyozyten Mit einem Polycistronische Construct Ausdruck optimale Verhältnis von Gata4, Mef2c und Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K Aufrufe.  University of North Carolina, Chapel Hill. We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming. 

Serie: Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

Isolierung und Kryokonservierung von neonatalen Rattenkardiomyozyten

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from various somatic cell types by transducing four Yamanaka transcription factors: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. The study of iPSCs remains at the cutting edge of biological and clinical research. In particular, patient-specific iPSCs can be used as a pioneering tool for the study of disease pathobiology, since iPSCs can be induced from the tissue of any individual. Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease, classified by the destruction of cartilage and bone structure in the joint. Synovial hyperplasia is one of the major reasons or symptoms that lead to these results in RA. Fibroblast-like Synoviocytes (FLSs) are the main component cells in the hyperplastic synovium. FLSs in the joint limitlessly proliferate, eventually invading the adjacent cartilage and bone. Currently, the hyperplastic synovium can be removed only by a surgical procedure. The removed synovium is used for RA research as a material that reflects the inflammatory condition of the joint. As a major player in the pathogenesis of RA, FLSs can be used as a material to generate and investigate the iPSCs of RA patients. In this study, we used the FLSs of a RA patient to generate iPSCs. Using a lentiviral system, we discovered that FLSs can generate RA patient-specific iPSC. The iPSCs generated from FLSs can be further used as a tool to study the pathophysiology of RA in the future.

Here we describe a protocol for generating human induced-pluripotent stem cells from patient-derived fibroblast-like synoviocytes, using a lentiviral system without feeder cells.

Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their potential applications in cardiac research, including drug discovery, disease modeling, tissue engineering, and regenerative medicine. However, cells produced by existing protocols display a range of immaturity compared with native adult ventricular cardiomyocytes. Many efforts have been made to mature hPSC-CMs, with only moderate maturation attained thus far. Therefore, an engineered system, called biowire, has been devised by providing both physical and electrical cues to lead hPSC-CMs to a more mature state in vitro. The system uses a microfabricated platform to seed hPSC-CMs in collagen type I gel along a rigid template suture to assemble into aligned cardiac tissue (biowire), which is subjected to electrical field stimulation with a progressively increasing frequency. Compared to nonstimulated controls, stimulated biowired cardiomyocytes exhibit an enhanced degree of structural and electrophysiological maturation. Such changes are dependent upon the stimulation rate. This manuscript describes in detail the design and creation of biowires.

The cardiac biowire platform is an in vitro method used to mature human embryonic and induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CM) by combining three-dimensional cell cultivation with electrical stimulation. This manuscript presents the detailed setup of the cardiac biowire platform.

Reifung von humanen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten in Biowires Verwendung elektrischer Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...