Unsere Methode zielt darauf ab, herzfeldspezifische Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus zu erzeugen. Diese Herzfeld-Reporter-Stammzelllinie ermöglicht die Hochdurchsatz-Studie der Mechanismen, die angeborenen Herzerkrankungen zugrunde liegen, und bietet ein System, das für genetische und pharmakologische Manipulationen geeignet ist. Es gibt mehrere kammerspezifische angeborene Herzerkrankungen.
Durch die Rekapitulation der Kardiogenese in vitro ermöglicht dieses Protokoll die Untersuchung des Krankheitsmechanismus und die Entwicklung zukünftiger regenerativer Therapien. Dieses Protokoll kann einen Einblick in die Art und Weise geben, wie Herzvorläuferzellen verschiedener Kammern während der Herzentwicklung spezifiziert werden. Beginnen Sie mit dem Anbau transgener Maus-Embryonalstammzellen in 0,1%gelatinebeschichteten T25-Flaschen in 2i Medium.
Wenn die Zellen 70 bis 80 % Zusammenfluss erreichen, spülen Sie die Kulturen mit PBS ab und fügen Sie einen Milliliter Trypsin pro Kolben hinzu, um die Kultur drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einzelne Zellen zu dissoziieren. Wenn sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie die Reaktion mit vier Millilitern 10 FBS in DMEM und zählen Sie die Zellen nach einer geeigneten Methode. Verdünnen Sie die Zellen auf etwa dreimal 10 bis die fünf Zellen pro frischer mittlerer Konzentration und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Dann das Pellet in fünf Milliliterfrischem 2i-Medium wieder aufsetzen, um es auf neue 0,1%gelatinebeschichtete T25-Flaschen zu replatieren. Für die CPC-Generation aus Herzsphäroiden, sammeln 2,5 mal 10 bis die sechs der abgetrennten transgenen Maus embryonale Stammzellprobe durch Zentrifugation, und resuspendieren die Zellen in 25 Milliliter SFD Medium. Die Zellsuspension für 48 Stunden in eine 150 mal 25 Millimeter sterile Platte für die Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid geben.
Am Ende der Inkubation, sammeln Sie die Herzsphäride in einem konischen Rohr. Sedimentieren Sie die Sphäroide durch Zentrifugation, um die selektive Isolierung der Sphäroide zu erleichtern und einzelne Zellen zu vermeiden. Setzen Sie die Sphäroide in 25 Milliliter frisches SFD-Medium wieder auf, ergänzt durch ein Nanogramm pro Milliliter Aktivin A und 1,5 Nanogramm pro Milliliter Knochenmorphogenetisches Protein vier.
Die Sphäroide für eine 24-Stunden-Inkubation im Zellkultur-Inkubator wieder auf dieselbe Kulturplatte zurücklegen. Am nächsten Tag, erinnern Sie sich an alle Herzsphäroide durch Zentrifugation. Setzen Sie die differenzierten embryoiden Körper in 25 Milliliter frischem SFD-Medium für die Beschichtung in einem ultra-niedrigen Anhang, 75-Zentimeter-Quadratkolben im Zellkultur-Inkubator für 48 Stunden aus.
Zur Isolierung des herzfeldspezifischen CPC mit fluoreszierenden Reportern, sammeln Sie die embryoiden Körper durch Zentrifugation und dissoziieren Sie die 3D-Kulturen mit einem Milliliter Trypsin bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Am Ende der Inkubation gut durch Pipettieren mischen, um die Zellen zu dissoziieren und die Reaktion mit vier Millilitern von 10%FBS in DMEM zu neutralisieren. Übergeben Sie das Gemisch über ein 70-Mikrometer-Sieb, um alle nicht dissoziierten embryonalen Körper zu entfernen, und sedimentieren Sie die gefilterten Zellen durch Zentrifugation.
Um die CPCs nach ihrem fluoreszierenden Reporterausdruck zu sortieren, setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter FACS-Lösung wieder auf und filtern Sie die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenrohr auf Eis. Sortieren Sie dann die Zellen, um die RFP- und GFP-exemitten Zellen durch FACS zu isolieren, und sammeln Sie die Zellen in einem Milliliter FBS. Um CPCs des ersten oder zweiten Herzensfeldes auf der Grundlage ihrer Oberflächenprotein-Cxcr4-Expression zu isolieren, setzen Sie die embryonale Stammzelle RFP-exezierende Herzvorläuferzellen in 300 Mikrolitern von 10%FBS in PBS, ergänzt mit fluoreszenzkonjugiertem Anti-Cxcr4-Antikörper, wieder auf.
Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Zellen dreimal in ein bis zwei Millilitern frischer, kalter PBS pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche die Zellen in 500 Mikroliter FACS-Lösung wieder aussetzen und die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Sieb in ein fünf Milliliter rundes Unterrohr filtern. Sortieren Sie dann die Zellen nach ihrem Cxcr4-Ausdruck und sammeln Sie sowohl die Cxcr4-positiven als auch die negativen Populationen in einzelne Röhren, die einen Milliliter FPS pro Röhre auf Eis enthalten.
Um die FACS-isolierten, herzfeldspezifischen Herzvorläuferzellen neu zu kultitogen, sammeln Sie die sortierten Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie die Pellets im SFD-Medium wieder auf. Dann säen Sie etwa dreimal 10 zu den vier Zellen pro Brunnen in einer 0,1%gelatinebeschichteten, 384-Well-Platte. Wenn nach der Sortierung ein erhöhter Zelltod festgestellt wird, fügen Sie jedem Brunnen einen 10-Mikromolaren-ROCK-Inhibitor hinzu.
Nach zwei Tagen Kultur sollte spontanes Schlagen beobachtet werden. Um die Fähigkeit der plattierten CPCs zu analysieren, sich zu Kardiomyozyten zu unterscheiden, sammeln Sie die Zellen an Tag 12 der Differenzierung mit Trypsin, wie gezeigt, um die einzelnen Kardiomyozyten zu isolieren und die Zellen in 4% Paraformaldehyd wieder auszusetzen. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur die festen Zellen durch Zentrifugieren sammeln und das Pellet in PBS waschen, um die überschüssige Fixierung zu entfernen.
Als Nächstes setzen Sie die Zellen in 10%FBS in PBS wieder aus, und inkubieren Sie die Hälfte der Zellprobe mit dem Antitroponin-T-Antikörper der Maus, und verwenden Sie die andere Hälfte der Probe als negative Kontrolle. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur die Zellen zweimal in frischem PBS waschen und die Proben in 10% FBS plus PBS, ergänzt mit einem geeigneten Sekundärantikörper, wieder aufsetzen. Nach einer weiteren 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Zellen zweimal in frischem PBS pro Waschgang waschen und die Zellen in 200 Mikroliter PBS pro Tube zur Analyse auf einem Durchflusszytometer wieder aufsetzen.
Nach ca. 132 Stunden Differenzierung können Tbx1-RFP und Hcn4-GFP Herzvorläuferzellen durch Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Im Allgemeinen erscheinen sowohl GFP- als auch RFP-Zellen ungefähr zur gleichen Zeit, und die beiden Populationen von Vorläuferzellen dehnen sich weiterhin in unmittelbarer Nähe und typischerweise in einem komplementären Muster aus. Die Anpassung der Konzentrationen von Aktivin A und Knochen morphogenetischem Protein vier wird die Prozentsätze der ersten versus zweiten Herzfeld-Herzvorläuferzellen verändern.
In ähnlicher Weise erscheinen mit einer RFP-Reportermaus embryonale Stammzelllinie nach 132 Stunden Differenzierung RFP-positive Kardiasvorläuferzellen. Nach der Immunfärbung für Cxcr4, RFP-positiv, Cxcr4-positiv und RFP-positiv können Cxcr4-negative Zellen isoliert werden. Die Immunostainierung für Herztroponin T an Tag 12 der Differenzierung bestätigt, dass sich die ersten Herzfeldzellen hauptsächlich in Myozyten differenzieren.
In ähnlicher Weise führen Zellen, die aus RFP-positiven, Cxcr4-negativen Kardinostvorläuferzellen gewonnen werden, zu Kardiomyozyten mit viel höheren Prozentsätzen als bei cxcr4-einzelpositiven Kardinostvorläuferzellen. Gelegentlich können sich embryonale Stammzellen der Maus nicht effizient differenzieren und bilden eine sehr geringe Anzahl herzfeldspezifischer Herzvorläuferzellen. Das Timing, die Konzentration und die Konsistenz der Zugabe der Zytokine und die Anzahl der Zellen sind entscheidend für eine erfolgreiche Erzeugung kammerspezifischer Herzvorläuferzellen.
Nach diesem Verfahren können die Forscher die physiologischen Eigenschaften der verschiedenen Populationen von Herzvorläuferzellen analysieren, um weitere Einblicke in ihre Spezifikation und Funktion zu erhalten.
