Die Optogenetik wurde verwendet, um höhere Titer mehrerer Chemikalien und Proteine im Vergleich zu typischen Induktoren zu erreichen. Mit diesem Protokoll können andere ihre eigenen Prozesse mit lichtbasierter Steuerung verbessern. Die Kontrolle der Optogenetik ist nichtinvasiv, hochgradig abstimmbar und reversibel.
Diese Eigenschaften ermöglichen eine optimierte Optimierung mikrobieller Prozesse und eröffnen sogar einzigartige Möglichkeiten wie dreiphasige Fermentationen und multichromatische Kontrolle. Für jede neue Chemikalie unterscheiden sich die optimalen Lichtverhältnisse. Wenn also eine geringe Produktion unter Verwendung der Parameter in diesem Protokoll beobachtet wird, sollten verschiedene Lichtbedingungen getestet werden.
Beginnen Sie mit der Gewinnung eines Saccharomyces cerevisiae-Stammes mit HIS3-Oxytrophie, einem für OptoINVRT-Plasmide notwendigen Marker. Wenn Sie versuchen, ein in Saccharomyces cerevisiae natives Gen zu kontrollieren, stellen Sie sicher, dass die endogene Kopie des Gens gelöscht wird, bevor Sie fortfahren. Um mit der Dehnungskonstruktion zu beginnen, linearisieren Sie das Plasmid, das die OptoINVRT7-Schaltung enthält, z. B. EZL439.
Wenn Sie EZL439 verwenden, das die Komponenten enthält, um den PIGA one-Promotor im Licht zu unterdrücken und im Dunkeln zu aktivieren, linearisieren Sie ihn an der Pme1-Restriktionsstelle. Integrieren Sie das Plasmid unter Verwendung von Standard-Lithiumacetat-Transformationsmethoden in einen HIS3-auxotrophen Stamm. Nach der Transformation zentrifugieren Sie die Zellen bei 150 G für eine Minute.
Suspendieren Sie die Zellen sanft in 200 Mikrolitern frischem SC-HIS-Medium. Das gesamte Zellvolumen auf eine SC-HIS-Agarplatte platten und bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Tage inkubieren, bis Kolonien erscheinen. Bereiten Sie kompetente Zellen mit Standard-Lithiumacetat-Transformationsprotokollen vor.
Transformieren Sie die Zellen mit dem Plasmid, das die Gene enthält, die Sie optogenetisch kontrollieren möchten, entweder nach den PIGA1M- oder PIGA1S-Promotoren. Nach der Transformation zentrifugieren Sie die Kultur bei 150 G für eine Minute und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 200 Mikrolitern frischem SC-Drop-out-Medium. Das gesamte Zellvolumen wird auf einer Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Agar-Platte plattiert, wenn sie in Delta-Stellen integriert wird, oder auf einer SC-Drop-out-Platte, wenn sie mit einem Plasmid transformiert wird, das einen Selektionsmarker enthält.
Inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius für 16 Stunden unter konstantem blauem Licht, um das optogenetisch kontrollierte Gen unterdrückt zu halten. Verwenden Sie eine beliebige Lichtquelle der Wellenlänge von 465 Nanometern und platzieren Sie ein LED-Panel etwa 40 Zentimeter über der Platte, so dass die Lichtintensität etwa 80 bis 110 Mikromol pro Quadratmeter pro Sekunde beträgt. Messen Sie die Intensität mit einem Quantenmeter.
Wenn Sie sich in Delta-Standorte integrieren, replizieren Sie die Platte auf Hefeextrakt-Pepton-Dextroseplatten, die einen Bereich von Zeocin-Konzentrationen zwischen 400 Mikrogramm pro Milliliter und 1.200 Mikrogramm pro Milliliter enthalten, um für eine Vielzahl von Integrationskopienzahlen auszuwählen. Inkubieren Sie die Nachbauplatten bei 30 Grad Celsius unter konstantem oder gepulstem blauem Licht für zwei bis drei Tage, bis die Kolonien erscheinen. Um das vorläufige Screening durchzuführen, wählen Sie acht Kolonien aus jeder Platte aus und verwenden Sie sie, um einen Milliliter SC-HIS-Medium, ergänzt mit 2% Glukose in einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte, zu impfen.
Züchten Sie die Zellen über Nacht bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie mit 200 Umdrehungen pro Minute unter konstanter blauer Lichtbeleuchtung. Verdünnen Sie am nächsten Tag jede Kultur in einem frischen SC-HIS-Medium mit 2% Glukose, um die optischen Dichtewerte von 0,01 bis 0,3 bei 600 Nanometern zu erhalten, und züchten Sie die Kulturen im Schüttelzustand 200 Umdrehungen pro Minute unter konstantem oder gepulstem Licht bei 30 Grad Celsius, bis die optische Dichte zwischen zwei und neun liegt. Wickeln Sie dann die Platten mit Aluminiumfolie ein, schalten Sie die Leuchtplatte aus und inkubieren Sie die Platten im Dunkeln vier Stunden lang bei 30 Grad Celsius mit 200 Umdrehungen pro Minute.
Zentrifugieren Sie die Kulturen in der 24-Well-Platte bei 234 G für fünf Minuten und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem, synthetischem Komplett-Drop-out-Medium mit 2% Glukose. Versiegeln Sie die Platten, um das Verdampfen des gewünschten Produkts zu verhindern, mit sterilem Mikroplatten-Siegelband. Fermentieren Sie die versiegelten Platten im Dunkeln für 48 Stunden bei 30 Grad Celsius Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute.
Um die Fermentationen zu ernten, zentrifugieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 234 G und übertragen Sie 800 Mikroliter des Überstands in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Abhängig von der interessierenden Chemikalie analysieren Sie mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Gaschromatographie-Massenspektrometrie oder einer anderen analytischen Methode unter Verwendung der Probenvorbereitungstechnik, die für das verwendete Instrument am besten geeignet ist. Wählen Sie acht Kolonien aus jeder Platte aus und verwenden Sie sie, um einen Milliliter SC-HIS-Medium mit 2% Glucose in einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu impfen.
Züchten Sie die Zellen über Nacht im Dunkeln bei 30 Grad Celsius mit 200 Umdrehungen pro Minute Schütteln. Verdünnen Sie am nächsten Morgen jede Kultur in einem frischen SC-HIS-Medium mit einer optischen Dichte von 2% Glucose bis 0,1. Wickeln Sie die Platten in Aluminiumfolie, um Lichteinwirkung zu vermeiden, und züchten Sie die Kultur im Dunkeln bei 30 Grad Celsius mit 200 Umdrehungen pro Minute Schütteln, bis sie eine optische Dichte von drei erreichen.
Dann inkubieren Sie die Platten unter gepulstem Licht für 12 Stunden bei 30 Grad Celsius mit 200 Umdrehungen pro Minute Schütteln. Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 234 G's für fünf Minuten und resuspendieren Sie in frischem SC-HIS-Medium mit 2% Glukose. Versiegeln Sie die Platten, um das Verdampfen des gewünschten Produkts zu verhindern, mit sterilem Mikroplatten-Siegelband.
Fermentieren Sie die versiegelten Platten bei Licht für 48 Stunden bei 30 Grad Celsius Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. Nach der Durchführung optogenetischer Fermentationen wurde die chemische Produktion bei einer Reihe von Zelldichten zum Zeitpunkt der Induktion mit zwei Schaltkreisen getestet. Der OptoINVRT7-Schaltkreis zeigte hohe Titer von Milchsäure und Isobutanol mit einer optimalen Zelldichte des Induktionswertes von 7,0 und 8,75 im Vergleich zu den OptoINVRT1- und 2-Schaltkreisen.
Die Fermentationen mit den OptoAMP-Schaltkreisen wurden in drei Phasen untersucht, die durch unterschiedliche Lichteinschaltzyklen definiert sind. Die Milchsäureproduktion kann durch eine gepulste Wachstumsphase und vollständig ausgeleuchtete Induktions- und Produktionsphasen optimiert werden. Die Isobutanolproduktion wurde mit einer gepulsten Wachstumsphase, einer vollständig beleuchteten Induktionsphase und einer gepulsten Produktionsphase optimiert.
Während die Naringenin-Biosynthese am besten durch eine gepulste wachstumsvoll beleuchtete Induktions- und Dunkelproduktionsphase optimiert wurde. Das OptoLAC-System wurde in E.Coli verwendet, um den Transkriptionsfaktor FDER bei Titern zu erzeugen, die mit denen vergleichbar oder höher sind, die durch chemische Induktion mit IPDG erreicht wurden. OptoLAC-Schaltungen wurden zur Herstellung von Mevalonat eingesetzt, und die Produktion übertrifft die Titer, die mit IPDG-Induktion erreicht wurden.
Die Mevalonatproduktion auf Bioreaktorebene zeigt die Skalierbarkeit und Abstimmbarkeit der optogenetischen Regulation für die chemische und Proteinproduktion in Bakterien über Mikroplattenebenen hinaus. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Lichtintensität im richtigen Bereich für die beleuchteten Schritte liegt und dass Lichtverunreinigungen bei Schritten, die Dunkelheit erfordern, vermieden werden. Diese Technik ebnete den Weg, um Rekordtiter von Isobutanol in Hefe zu erreichen, Konsortienpopulationen mit Licht zu stabilisieren und sogar den metabolischen Fluss mit synthetischen lichtgesteuerten Organellen zu kontrollieren.
