We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).

1. Fucci Transduktion und Zellkultur <ol><li> Fucci Transduktion <ol><li> Erstellen Zelllinien stabil exprimieren die Fucci Konstrukte mKO2-hCdt1 (30-120) und Mag-hGem (1-100) 15 mit Lentivirus-Cotransduktion wie zuvor beschrieben 7. Hinweis: Die Fucci System ist jetzt im Handel erhältlich. </li><li> Generieren Unter Klone mit heller Fluoreszenz durch Einzelzellsortierung. Sortier einzelnen Zellen positiv für beide AG und KO (gelb) durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung in eine 96-Well-Platte wie oben beschrieben 7,16. </li></ol></li><li> Melanom-Zellkultur <ol><li> Kultur C8161 menschlichen Melanomzellen, wie zuvor beschrieben 7,17. </li></ol></li></ol> 2. 3D-Sphäroidbildung (wie zuvor beschrieben 3,9) <ol><li> Agaroseplatte Vorbereitung <ol><li> Aufzulösen 1,5% Agarose (oder Edel Agar) in 100 ml ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) oder Phosphat Buffered Kochsalzlösung (PBS) durch Kochen in der Mikrowelle für 3-5 min unter Schwenken. Achten Sie darauf, die Agarose vollständig gelöst ist. </li><li> Unmittelbar Verteilen von 100 ul der Agarose-Lösung pro Vertiefung auf eine Flachboden-96-Well-Gewebekulturplatte unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. Hinweis: Agarose kann in den Spitzen nach einer kurzen Zeit zu verfestigen, um dieses Problem zu überwinden Spitzen müssen zwischen den Platten geändert werden, wenn die mehr als einen Agarose-Platte. </li><li> Lassen Sie 96-Well-Platte auf einer ebenen Fläche, für mindestens 1 Stunde aushärten Agarose. </li></ol></li><li> Zellpräparation und Overlay auf Agarose <ol><li> Wachsen Zellen auf etwa 80% Konfluenz in einer T75-Flasche. Mit 10 ml HBSS waschen. </li><li> Lösen Zellen unter Verwendung von 1,5 ml 0,05% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und resuspendieren in 10 ml Normalmedium. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer 18 oder andere automatisierte Zählweise. </li><li> Die Zellen in einer Endkonzentration von 25.000 Zellen / ml in normal Medium. </li><li> Lagern Agarose Vertiefungen mit 200 ul der Zellsuspension für eine endgültige Anzahl von 5.000 Zellen pro Well. </li><li> Rückplatten zu der Zellkultur-Inkubator (5% CO 2 und 37 ° C), um Sphäroide zu bilden über etwa 3 Tagen. Anmerkung: Die Zeit, die ein Sphäroid zu bilden, variiert zwischen verschiedenen Zelllinien. Einige Zelllinien sind nicht Sphäroiden mit dieser Methode überhaupt. </li><li> Bild Sphäroid Morphologie mit einem inversen Mikroskop mit einem 4X Objektiv und eine Phasenkontrastfilter. Eine Zelllinie, die erfolgreich bildet Sphäroiden wird kompakt, annähernd kugelförmige Zellaggregate zu produzieren, und es sollte nur ein Sphäroid pro Vertiefung sein. Anmerkung: Optional: Sobald Sphäroide gebildet haben, können sie in Kollagen oder anderen Matrix zur weiteren Analyse des Wachstums und der Invasion 3,7,17 ​​transplantiert werden. Sphäroide aus Kollagen zu entfernen, Behandlung mit 500 ul 2 mg / ml Collagenase bei 37 ° C, bis das Kollagen genug für die spher gelösteoids zu kommen kostenlos in die Medien (ca. 30 min). Sphäroiden mit einer 1 ml Pipette vorsichtig entfernen. </li><li> Zum Schneiden / Imaging fix Sphäroiden (entweder isoliert von Kollagen oder für 3-5 Tage auf Agarose gezüchtet) in 10% neutral gepuffertem Formalin (ACHTUNG: Formalin sollte im Abzug verwendet werden) für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht (O / N) bei 4 ° C. Sphäroide in HBSS bei 4 ° C für mehrere Tage gelagert werden. </li></ol></li></ol> 3. Spheroid Vibratom Schnitte <ol><li> Aufzulösen 5 g niedrigschmelzender Agarose in 100 ml HBSS in einer 500 ml Glasflasche in einer Mikrowelle. Verwenden Sie eine mittlere Heizstufe mit wirbelnden. ACHTUNG: Halten Sie den Deckel lose bei Kochen der Lösung, so dass der Druck freigegeben werden kann. Verwenden Sie hitzebeständige Schutzhandschuhe, um die Hände vor Verbrennungen zu schützen beim Umgang mit dem heißen Glasflasche. </li><li> Warten Sie, bis die Agarose kühlt leicht - so die Flasche berührt werden können, ohne zu brennen Händen. </li><li> Gießen Sie approximadig 2 ml Agaroselösung in den Boden eines Coulter-Counters Tasse oder ähnlichen Kunststoffform. Sofort absaugen eine feste Sphäroid (siehe Abschnitt 2.2.8) unter Verwendung einer 1 ml Pipette in der kleinsten Flüssigkeitsvolumen möglich. Sphäroid hinzuzufügen, um die Agarose. Einige Sphäroide (bis zu 10) pro Schale zugegeben werden. </li><li> Decken Sie die Sphäroide mit 2 ml mehr aus Agarose. Tun dies schnell, um die Agarose Aushärtung zu vermeiden, bevor die zweite Schicht hinzugefügt wird. </li><li> Ermöglichen die Agarose bei RT im Dunkeln für mindestens 3 Stunden aushärten. An dieser Stelle kann Cups für eine kurze Zeit bei 4 ° C mit 2-3 gespeichert ml HBSS überlagert, um eine Austrocknung zu verhindern. </li><li> Entfernen Agarose aus der Tasse. Schneiden Sie die Agarose mit den Sphäroiden, so dass es auf die Vibratom Metallblock passt, und Sphäroiden sind in der Nähe der Spitze der Agarose. Sphäroiden können als kleine weiße Gegenstände in der Agarose zu sehen. Superkleber die Agarose auf den Block. </li><li> Füllen Sie das Vibratom mit destilliertem Wasser und montieren Sie den Block in der Vibratom. Stellen Sie dieVibratom 100 um Abschnitte mit geringer Geschwindigkeit (Einstellung 2) und hohe Vibrations (Einstellung 8) zu schneiden. Stellen Sie die Schneideklinge Winkel bis 16 °. Schalten Vibratom auf, schalten Sie die Vibratom Licht und Zuschnitte von der Spitze der Agarose, bis 100 &amp; mgr; m Sphäroid Abschnitte geschnitten. Zeigen geschnitten Sphäroid Abschnitte in HBSS in einem 24-Well-Platte. </li><li> Wählen Mittelabschnitte zur Bildanalyse. Berg Schnitte auf Objektträgern durch die Übertragung der Abschnitt flach auf den Objektträger mit einer Pinzette. Füllen Sie eine 10 ml Spritzenzylinder mit Vakuumfett; fügen Sie eine dünne Linie der Vakuumfett um die Ränder des Abschnitts, um die Befestigungsmittel aus läuft die Kanten des Schlittens zu verhindern und helfen, dichten den Abschnitt unter dem Deckglas. Bedecken Sie den Abschnitt mit Eindeckmittel und einem Deckglas. Siegel Kanten des Deckglases mit Nagellack. Objektträger bei 4 ° C vor der Bilderzeugung. </li></ol> 4. Die konfokale Bildaufnahme <ol><li> Werfen Sie einen z-Scheibe Bild einer mittleren Fucci Sphäroid Abschnitt mit einem 10Xoder 20x-Objektiv wie zuvor beschrieben 7. Achten Sie darauf, zwischen dem Kusabira Orange2 und Azami Grün keine Überlappung oder Übersprechen auftritt. Wenn einem Vergleich der Bildanalyse zwischen mehreren Sphäroid Abschnitte, halten Laserleistung und andere Einstellungen das gleiche zwischen den Proben. </li></ol> 5. Hoechst Dye Diffusion Assay für Fluss Sortierung <ol><li> Übertragen Sie Live-Sphäroiden (3-5 Tage nach Agarose-seeding) auf einen 15-ml-Tube. Lassen Sphäroide Schwerkraft zu dem Boden des Röhrchens absetzen. Mehrere Sphäroiden können pro Röhrchen gefärbt werden. Etwa 20 Sphäroide notwendig sind, um ausreichende Zellzahlen für die Durchflusszytometrie zu gewinnen. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Medium und 1 ml von 10 &amp; mgr; M Hoechst in Normalmedium verdünnt. Sphäroide bei 37 ° C für ca. 1 Std. Schon flicking, um die Kügelchen während der Inkubation einmal oder zweimal zu resuspendieren. Anmerkung: Die Inkubationszeit variiert werden kann, um zu ändern, wie weit der Hoechst-Farbstoff in die Sphäroide eindringt. Dies wird auf variierendas Sphäroid Größe, Dichte und Zelllinie. Für einige große / dichte Kügelchen kann es zu einer maximalen Durchfärbung, die weniger als 100% sein. </li><li> Vorsichtig mit 5 ml HBSS mit Schwerkraftabsetzung Waschen Sie die Sphäroiden. <ol><li> Optional: Für die Bildgebung der Farbeindringprüfung: Fix Sphäroiden mit 10% neutral gepuffertem Formalin für mindestens 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. Bereiten Vibratom Abschnitte, Mount auf Dias und Bild auf der konfokalen wie in Schritt 3 und 4 oben beschrieben. </li></ol></li><li> Um Zellen für die Strömung mit 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA bei 37 ° C etwa 30 min mit Ausklopfen alle 10 min bis der Sphäroide auseinanderzubrechen vorzubereiten Zytometrie trypsinize Sphäroide. Anmerkung: Sphäroide schwierig in Einzelzellsuspension zu erhalten, müssen Bedingungen, die optimiert werden. Lebensfähigkeit C8161 4 Tage alte Sphäroide nach diesem Prozeß beträgt ca. 95%. </li><li> Stain-Zellen mit einem Nah-Infrarot-Live / Dead-Färbung nach dem Protokoll des Herstellers. Waschen mit HBSS dann mit 1 fixml 10% neutral gepuffertem Formalin für ca. 30 min. Zellen können in HBSS bei 4 ° C mehrere Tage vor Flussanalyse gespeichert werden. </li></ol> 6. Durchflusszytometrie Analyse von Hoechst Stained Fucci Spheroids <ol><li> Sicherzustellen Zellen nicht miteinander, indem sie durch ein Zellsieb verklumpt. Resuspendieren der Hoechst gefärbt Fucci Sphäroiden in eiskaltem Wasch FACS (PBS mit 5% fötales Kälberserum) in einer Konzentration von 1-5 × 10 6 Zellen / ml. Übertragen Sie 200 ul der Probe auf 5 ml Rundbodenröhrchen. </li><li> Bereiten Sie die folgenden einzelnen Farbkontrollproben wie in 6.1 beschrieben: un-angefärbt Melanomzellen; haft Melanom-Zellen mit 10 &amp; mgr; M Hoechst 1 Stunde gefärbt; Azami Grün nur ausdrücken Melanomzellen; und Kusabira orange nur ausdrücken Melanomzellen. Hinweis: Einzelne Farbe Kontrollen können in Formalin fixiert und in FACS gespeichert werden abwaschen mit 0,1% Natriumazid bei 4 ° C für Wochen oder sogar Monate. </li><li> Führen Sie Einzelzellsuspensionen ona Durchflusszytometrie Analysator mit geeigneten Lasern und einzelne Farbe / ungefärbten Kontrolle wie vorher beschrieben 7,16. </li><li> Verwenden kommerziellen Zytometrie Software wie FlowJo zur Analyse der inneren vs. Außen Sphäroid-Zellen wie folgt: <ol><li> Entfernen Sie die Ablagerungen durch Gating auf der Hauptzellpopulation im Vorwärtsstreulicht (FSC) gegen Seitwärtsstreulichts (SSC). </li><li> Dubletten entfernen durch Gating an einzelnen Zellen unter Verwendung von FSC (Region) vs. FSC (Höhe) </li><li> Tor für lebende Zellen durch Gating auf dem Live / Dead geringer Bevölkerungs. </li><li> Definieren Hoechst High-Zellen, bezogen auf das positive Signal von der adhärenten Zellen mit Hoechst gefärbt gated, als &quot;äußere&quot; Zellen. </li><li> Definieren Hoechst niedrigen oder negativen Zellen, basierend auf dem Signal von dem nicht-gefärbten Steuer gated, als &quot;innere&quot; Zellen. </li><li> Nach Gating für den inneren und äußeren Populationen können Zellen weiter Fucci rot (G1), gelb (frühe S), Grün (S / G2 / M) oder negativ (frühen G1) ausgeblendet werden. Anmerkung: Compensation mit den einzelnen Farbsteuerung erforderlich sein, um die Fucci rot, gelb, grün und negativen Populationen richtig zu definieren. </li></ol></li><li> Nachdem der Assay wurde optimiert und Hoechst Eindringen über die konfokale Mikroskopie bestätigt, laufen Zellen ohne Fixierung auf eine Fließzellsortierer, wie zuvor beschrieben 7,16 für die weitere Analyse der Lebendzellunterpopulationen. </li></ol> 7. Bildanalyse von Fucci Spheroid Sections <ol><li> Offene Software zB. Volocity, wählen Sie die Quantifizierung NUR Konfiguration. </li><li> Erstellen Sie eine neue Bibliothek. Importieren Sie die Fucci Sphäroid konfokale Bilddatei in die Software, indem Sie die Rohdatendatei von der konfokalen in die Bibliothek. Alternativ können Sie den Befehl Datei&gt; Importieren. </li><li> Gehen Sie zur Registerkarte Messungen, um eine Bildanalyse-Protokoll zu bauen. Das Protokoll wird per Drag &amp; Drop die entsprechenden Befehle in der richtigen Reihenfolge, wie im Protokoll Fenster folgt aufgebaut. </li><li> Finden objECTS im grünen Kanal: Ziehen Sie das Suchen von Objekten Befehl (in &quot;Finding &#39;gefunden) in das Protokollfenster, wählen Sie den richtigen Kanal in der gewünschten Objekte protocol.Add einen offenen Befehl (in&quot; Verarbeitung &quot;gefunden), dann ein separater berührende Objekte Befehl (in &quot;Verarbeitung&quot; gefunden - dies Zellen zu trennen). Objekte Größe &lt;50 &amp; mgr; m auszuschließen sind (in &#39;Filtering&#39; gefunden - dies kleine nicht-zelluläre Objekte auszuschließen). Hinweis: Variablen wie dem Suchen von Objekten Schwelle, Anzahl der offenen Iterationen, um die Größe von Objekten getrennt werden und die Größe der Objekte ausschließen müssen manuell optimiert werden, bis die Objektmasken passen Sie das Bild. </li><li> Suchen von Objekten im roten Kanal: Wiederholen Objekte, wie oben für den roten Kanal zu finden. Grüne und rote Protokolle müssen separat eingestellt werden. Hinweis: Aufgrund der Kerne als in G2, sind grün Kerne oft etwas größer. </li><li> Bestätigen gefundenen Objekte sind genau bestätigen rote und grüne Objekte entsprechen denrote und grüne Kerne in dem Bild, das durch Aus- und Einschalten der grünen und roten Kanälen (mit dem ein- oder ausblenden Kanalbefehl), während die Anzeige der roten und grünen Masken durch das Protokoll gefunden. Feedback-Optionen (Measurements&gt; Feedback-Optionen) können verwendet werden, um das Erscheinungsbild der Objektmasken ändern. </li><li> Finden gelbe Objekte (frühen S-Phase-Zellen): Um gelben Zellen zu finden, fügen Sie einen schneiden Rot mit grünen Zellen-Befehl (in &quot;Die Kombination&quot; gefunden). Objekte nach Größe (&lt;50 um, in &#39;Filtering&#39; gefunden), um kleine nicht-zelluläre Objekte auszuschließen auszuschließen. </li><li> Finden Sie ausschließlich rote Objekte (G1-Phase-Zellen): Um ausschließlich roten Kerne zu finden, subtrahieren Sie die gelben Zellen von den roten Blutzellen (in &quot;Die Kombination&quot; gefunden). Objekte ausschließen, indem Größe &lt;50 &amp; mgr; m (in &#39;Filtering&#39; gefunden), um kleine nicht-zelluläre erstellte Objekte zu entfernen. </li><li> Finden Sie ausschließlich grüne Objekte (S / G2 / M-Phasen-Zellen): Wiederholung für den grünen Kanal ausschließlich grün zu finden. Neinte: Wenn es immer noch nicht-zelluläre Objekte verbleibenden, ein Filter Bevölkerung Befehl kann zur exklusiven grün oder rot Exclusive-Protokolle (in &#39;Filtering&#39; gefunden), nur zu halten hinzugefügt werden Objekte mit einem Formfaktor größer als 0,25. Dies wird nicht kreisförmige Objekte zu entfernen. </li><li> Finden Sie die Sphäroid Gliederung: Finden Sie die Sphäroid Umriss mit einem Fundobjekte Befehl mit der grünen oder roten Kanal (je nachdem, was mehr Zellen am Rand des Sphäroids ist) (in &quot;Finding&quot; gefunden). Eine viel niedrigere Schwelle (in der find gefundenen Objekte Variablen) müssen verwendet werden, um das Sphäroid Umrisse im Vergleich zu einzelnen Zellen zu finden. <ol><li> Verwenden Sie einen Schließbefehl an Objekten (in &quot;Verarbeitung&quot; gefunden) anzuschließen, dann füllen Sie Löcher in Objekten (in der &quot;Verarbeitung&quot; gefunden), dann mit einem Feinfilter (in &#39;Filtering&#39; gefunden), um Lärm von Objekten zu entfernen. Schließlich schließen Objekte nach Größe, um kleinere Gegenstände &lt;30.000 &amp; mgr; m (abhängig von der Sphäroid Größe) zu entfernen. Notiz: Dieses Protokoll müssen manuell optimiert, bis das Sphäroid Umrisse korrekt werden. Ein Hellfeld Bild können auch verwendet werden - allerdings ist dies in der Regel weniger genau mit einem Sphäroid Schnitt und einer Invert-Befehl (in &quot;Die Kombination &#39;gefunden) müssen verwendet werden. </li></ol></li><li> Entfernungen messen von Kernen zum Sphäroid Gliederung: Messen Sie Abstände von den gelben, grünen und ausschließlich exklusiv roten Populationen aus der Zelle Schwerpunkt an den Rand des Sphäroids outline.To die Mindestabstände zu visualisieren (in &#39;Bezogen&#39; gefunden), die aus dem sein sollte Zelle zur nächsten Sphäroid Kante, schalten Sie zeigen Wege auf der Registerkarte Beziehungen in Feedback-Optionen (Measurements&gt; Feedback-Optionen&gt; Beziehungen). </li><li> Speichern Sie das Protokoll. Dieses Protokoll kann auf andere Bilder mit den Messungen erneut angewendet werden&gt; Protokollbefehl wiederherstellen. </li><li> Erstellen Sie einen Messpunkt (Measurements&gt; Make Mess Artikel). Daten können unter Verwendung der Analyse analysiert werden,Funktionen. <ol><li> Gehen Sie auf die Registerkarte Analyse im Messpunkt. Zum Menü Analyse (Analysis&gt; Analyze) und Analyse der Mindestabstand von der Zellenschwerpunkt (rot, grün oder gelb) an das Sphäroid Kante, von Graf zusammengefasst und durch die Bevölkerung organisiert. </li><li> Um die Anzahl der Zellen in einem bestimmten Abstand von der Kante gefunden zählen erstellen Sie einen Filter (Analyse&gt; Filter). Der Filter für Mindestabstand in Figur 2 ist an Hoechst Eindringen basiert (zB minimale Abstand kleiner als 80 gibt die &quot;äußeren&quot; Bevölkerung). Alternativ Export von Rohdaten in eine Tabellenkalkulation zur weiteren Analyse. </li></ol></li></ol>

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<li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroid+models+to+explore+cell+cycle+checkpoints+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.</a> BMC cancer. 13, 73(2013).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li>
<li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li>
</ol>

PerkinElmer contributed to the costs of publication.

Halbautomatische Bildanalyse identifizierte die Sphäroid Innen G1 festgenommen Region und wuchernden äußeren Schichten. Dieses Verfahren kann auf Live-Sphäroiden mit einem optischen Abschnitt verwendet werden, oder in festen Sphäroid Abschnitte, auf Veränderungen nicht nur des Zellzyklus, sondern Markerexpression (über Immunfluoreszenz), Zelltod oder Zellmorphologie in diesen verschiedenen Regionen zu identifizieren. Zellbeweglichkeit in verschiedenen Regionen Sphäroid kann auch quantifiziert werden -, wenn Live...

Mehrzelligen Sphäroiden 3D haben als Tumor-Modell seit Jahrzehnten bekannt, aber es ist erst vor kurzem, dass sie in häufiger Verwendung als in vitro-Modell für viele soliden Tumoren kommen. Sie werden zunehmend in Hochdurchsatz-Wirkstoffsuche Bildschirme als Vermittler zwischen komplex, teuer und zeitaufwendig in vivo-Modelle und die einfache, kostengünstige 2D-Einzelschicht-Modell 1-6 verwendet. Studies in 2D Kultur sind oft nicht in der Lage, um in vivo repliziert werden. Spheroid Modelle von vielen Arten von Krebs in der Lage, die Wachstumseigenschaften, Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten, Drogen-Penetration, Zell-Zell-Interaktionen, eingeschränkte Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffen und die Entwicklung der Nekrose, die in vivo in soliden Tumoren 6-11 zu sehen ist zu imitieren. Sphäroide Entwicklung einer nekrotischen Kern, eine ruhende oder G1 verhaftet Umgebung des Kerns und proliferierenden Zellen in der Peripherie des Sphäroids 7. Die Entwicklung dieser Regionenkann abhängig von der Zelldichte, der Proliferationsrate und der Größe des Sphäroids 12 variieren. Es wurde vermutet, dass die zelluläre Heterogenität in diesen verschiedenen Teilbereiche ersichtlich kann in der Krebstherapie Widerstand 13,14 beizutragen. Deshalb separat ist die Fähigkeit, Zellen in diesen Bereichen zu analysieren entscheidend für das Verständnis Tumorarzneimittelreaktionen. Und Grün (Azami Green - AG) Fluoreszenzmarkierung von Cdt1 und Geminin, die in verschiedenen Phasen des Zellzyklus 15 abgebaut werden - die Fluoreszenz Ubiquitinierung Zellzyklus-Anzeigesystem (Fucci) auf dem roten (KO Kusabira orange) basiert. So Zellkerne erscheinen rot in G1, gelb in der frühen S und S / G2 / M Phase grün. Wir beschreiben hier zwei sich ergänzende Methoden sowohl mit Fucci den Zellzyklus zu identifizieren, zusammen mit der Verwendung von Bildbearbeitungssoftware oder ein Farbstoffdiffusions Durchflusscytometrieassay um zu bestimmen, ob die Zellen befinden sich in der G1 verhaftet Mitte oder den äußeren proliferating Rings und der Abstand der einzelnen Zellen von der Kante des Sphäroids. Diese Verfahren wurden in unserer früheren Veröffentlichung, wo wir gezeigt, dass Melanomzellen in hypoxischen Regionen in der Mitte des Sphäroids entwickelt und / oder in Gegenwart von zielgerichtete Therapien sind in der Lage, in die G1-Arretierung für längere Zeit zu bleiben, und kann RE- geben Sie den Zellzyklus, wenn günstigere Bedingungen entstehen 7.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>agarose low melting point</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td>For sectioning</td></tr><tr><td>noble agar&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5431</td><td>For making spheroids</td></tr><tr><td>agarose for spheroids</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>For making spheroids</td></tr><tr><td>0.05% trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>10% formalin</td><td>Sigma</td><td>HT5014-1CS</td><td>CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do &amp;nbsp;not breath fumes (open in a fume cupboard).</td></tr><tr><td>live/dead near IR</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>vibratome</td><td>Technical Products International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coulture cup</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SIE936</td><td>Mold for sectioning spheroids</td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Invitro</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>collagenase</td><td>Sigma</td><td>C5138&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer analyser</td><td>Becton Dickinson</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>flowjo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>Flow cytometry software</td></tr><tr><td>Vaccuum grease</td><td>Sigma</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI (commercial constructs)</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>Transient transfection only</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;#956;m</td><td>In Vitro</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom 5 ml tubes (sterile)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom 5 ml tubes (non-sterile)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352008</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3d melanoma spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Es gibt mehrere Verfahren zur Herstellung Tumorsphäroide Dieses Protokoll verwendet die nicht-haftenden Wachstumsverfahren, bei dem Zellen auf Agar oder Agarose 3,7,9 kultiviert werden. 1 zeigt ein Beispiel eines C8161-Melanom Sphäroid nach 3 Tagen auf Agar. C8161 Sphäroide bilden regelmäßige Größe Sphäroiden mit einem Durchmesser von 500 bis 600 &amp; mgr; m (Mittelwert = 565, SD = 19, n = 3) nach 3 Tagen. Andere Melanom-Zelllinien, die Sphäroide bilden gehören: WM793, WM983C, WM98...

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Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

imaging-flow-cytometry-based-analysis-cell-position-cell-cycle-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

13.0K Aufrufe.  The Centenary Institute. We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids. 

Serie: Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Forschung

Krebsforschung

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, high-throughput imaging modalities utilizing bright field or fluorescence detection, are unable to resolve the overall 3D structure of the tumor spheroid due to limited light penetration, diffusion of fluorescent dyes and depth-resolvability. Recently, our lab demonstrated the use of optical coherence tomography (OCT), a label-free and non-destructive 3D imaging modality, to perform longitudinal characterization of multicellular tumor spheroids in a 96-well plate. OCT was capable of obtaining 3D morphological and physiological information of tumor spheroids growing up to about 600 &#181;m in height. In this article, we demonstrate a high-throughput OCT (HT-OCT) imaging system that scans the whole multi-well plate and obtains 3D OCT data of tumor spheroids automatically. We describe the details of the HT-OCT system and construction guidelines in the protocol. From the 3D OCT data, one can visualize the overall structure of the spheroid with 3D rendered and orthogonal slices, characterize the longitudinal growth curve of the tumor spheroid based on the morphological information of size and volume, and monitor the growth of the dead-cell regions in the tumor spheroid based on optical intrinsic attenuation contrast. We show that HT-OCT can be used as a high-throughput imaging modality for drug screening as well as characterizing biofabricated samples.

Optical coherence tomography (OCT), a three-dimensional imaging technology, was used to monitor and characterize the growth kinetics of multicellular tumor spheroids. Precise volumetric quantification of tumor spheroids using a voxel counting approach, and label-free dead tissue detection in the spheroids based on intrinsic optical attenuation contrast, were demonstrated.

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the spheroid at the cellular level is important for analysis, yet existing techniques are often expensive, laborious, use non-standard equipment, cause significant size distortion, or are limited to relatively small spheroids. This protocol presents a new method of mounting and clearing spheroids that address these issues while allowing for confocal analysis of the inner structure of spheroids. In contrast to existing approaches, this protocol provides for rapid mounting and clearing of a large number of spheroids using standard equipment and laboratory supplies. Mounting spheroids in a pH-neutral agarose-PBS gel solution before introducing a refractive-index-matched clearing solution minimizes size distortion common to other similar techniques. This allows for detailed quantitative and statistical analysis where the accuracy of size measurements is paramount. Furthermore, compared to liquid clearing solutions, the agarose gel technique keeps spheroids fixed in place, allowing for the collection of three-dimensional (3D) confocal images. The present article elaborates how the method yields high-quality two- and 3D images that provide information about inter-cell variability and inner spheroid structure.

Tumor spheroids are becoming increasingly utilized to assess tumor cell-microenvironment interactions and therapy response. The present protocol describes a robust but simple method for semi-high-throughput imaging of 3D tumor spheroids using rapid optical clearing.

Rapid Optical Clearing für die Semi-Hochdurchsatzanalyse von Tumorsphäroiden

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Medizin

<meta charset="utf8"></head><body>Untersuchung von Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Interaktionen in einem 3D-Kollagenmatrix-Setup

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Ein Makrophagen-Tumor-Sphäroid-Co-Invasions-Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

Zusammenfassung

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