We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).

1. FUCCI trasduzione e colture cellulari <ol><li> FUCCI trasduzione <ol><li> Creare linee cellulari che esprimono stabilmente la FUCCI costruisce mKO2-hCdt1 (30-120) e MAG-hGem (1-100) 15 usando lentivirus co-trasduzione come descritto in precedenza 7. Nota: il sistema FUCCI è ora disponibile in commercio. </li><li> Generare sub-cloni con fluorescenza mediante selezione singola cellula. Ordina cellule singole positive sia per AG e KO (giallo) per la fluorescenza delle cellule attivate l&#39;ordinamento in una piastra a 96 pozzetti come in precedenza descritto 7,16. </li></ol></li><li> Coltura cellulare Melanoma <ol><li> Cellule di melanoma umano Cultura C8161 come precedentemente descritto 7,17. </li></ol></li></ol> 2. 3D Spheroid Formazione (come descritto in precedenza 3,9) <ol><li> Piatto preparazione Agarosio <ol><li> Sciogliere 1,5% agarosio (o nobile agar) in 100 ml di soluzione di Hank salina bilanciata (HBSS) o Buffere fosfatod (PBS), facendo bollire nel microonde per 3-5 minuti, rimestando. Assicurarsi che l&#39;agarosio sia completamente dissolto. </li><li> Immediatamente dispensare 100 microlitri della soluzione di agarosio per bene ad una piastra a 96 pozzetti di coltura tissutale a fondo piatto con una pipetta multicanale. Nota: Agarosio può solidificare nelle punte dopo un breve periodo di tempo, per superare questo consigli problema deve essere cambiato tra piastre se effettuare più di una piastra di agarosio. </li><li> Lasciare piastra a 96 pozzetti su una superficie piana per indurire agarosio per almeno 1 ora. </li></ol></li><li> La preparazione delle cellule e di sovrapposizione su agarosio <ol><li> Crescere le cellule a circa l&#39;80% di confluenza in un pallone T75. Lavare con 10 ml di HBSS. </li><li> Staccare le cellule con 1,5 ml di 0,05% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e risospendere in 10 ml di terreno normale. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro 18 o un altro metodo di conteggio automatizzato. </li><li> Risospendere le cellule a una concentrazione finale di 25.000 cellule / ml a normaal medio. </li><li> Overlay pozzi agarosio con 200 microlitri della sospensione cellulare per un numero finale di 5000 cellule per pozzetto. </li><li> Piastre ritorno alla incubatore di coltura cellulare (5% di CO 2 e 37 ° C) per formare sferoidi oltre circa 3 giorni. Nota: Il tempo impiegato per formare uno sferoide varia tra diverse linee cellulari. Alcune linee cellulari non formano sferoidi utilizzando questo metodo a tutti. </li><li> Immagine sferoide morfologia con un microscopio invertito con obiettivo 4X e un filtro a contrasto di fase. Una linea di cellule che si forma con successo sferoidi produrranno compatti, aggregati di cellule più o meno sferiche, e non ci dovrebbero essere solo uno sferoide per pozzetto. Nota: Opzionale: Una volta sferoidi si sono formate, possono essere trapiantate in collagene o altro matrice per ulteriori analisi di crescita e l&#39;invasione 3,7,17. Per rimuovere sferoidi da collagene, trattare con 500 ml di 2 mg / ml di collagenasi a 37 ° C fino a quando il collagene è sciolto abbastanza per il spherOID di entrare gratis nei media (circa 30 minuti). Rimuovere delicatamente sferoidi con una pipetta 1 ml. </li><li> Per il sezionamento / immagini sferoidi fix (o isolati da collagene o coltivate per 3-5 giorni in agarosio) nel 10% formalina tamponata neutra (ATTENZIONE: formalina deve essere usato sotto cappa) per almeno 2 ore a temperatura ambiente (RT) , o per una notte (O / N) a 4 ° C. Sferoidi possono essere conservati in HBSS a 4 ° C per diversi giorni. </li></ol></li></ol> 3. Spheroid Vibratome sezionamento <ol><li> Sciogliere 5 g di agarosio a basso punto di fusione in 100 ml di HBSS in una bottiglia di vetro da 500 ml in un forno a microonde. Utilizzare un calore medio, rimestando. ATTENZIONE: Tenere il coperchio sciolto quando bolle la soluzione in modo che la pressione può essere rilasciata. Usare guanti protettivi resistenti al calore per proteggere le mani da ustioni quando si maneggia la bottiglia di vetro caldo. </li><li> Attendere che l&#39;agarosio si raffredda un po &#39;- quindi la bottiglia può essere toccato senza bruciare le mani. </li><li> Pour approssiTely 2 ml di agarosio nella parte inferiore di un contatore Coulter tazza o simile plastica stampo. Aspirare immediatamente un sferoide fisso (vedi paragrafo 2.2.8) con una pipetta 1 ml nel più piccolo volume di liquido possibile. Aggiungere sferoide alla agarosio. Alcuni sferoidi (fino a 10) possono essere aggiunti per tazza. </li><li> Coprire i sferoidi con 2 ml più agarosio. Fare questo rapidamente per evitare l&#39;indurimento agarosio prima di aggiungere il secondo strato. </li><li> Lasciare che il agarosio indurire a temperatura ambiente al buio per almeno 3 ore. A questo punto tazze possono essere conservati per un breve periodo a 4 ° C con 2-3 ml di HBSS sovrapposti per evitare la disidratazione. </li><li> Rimuovere agarosio dalla tazza. Tagliare l&#39;agarosio contenente sferoidi modo che si inserisca sul blocco di metallo vibratome, e sferoidi sono vicino alla parte superiore della agarosio. Sferoidi possono essere visti come piccoli oggetti bianchi dentro il agarosio. Super Glue l&#39;agarosio al blocco. </li><li> Riempire il vibratome con acqua distillata e montare il blocco nel vibratome. Impostare ilvibratome per tagliare 100 micron sezioni utilizzando bassa velocità (impostazione 2) e ad alta vibrazione (impostazione 8). Impostare l&#39;angolo lama di taglio a 16 °. Accendere vibratome su, accendere la luce vibratomo e tagliare sezioni dalla cima della agarosio fino a 100 micron sezioni sferoidali sono tagliati. Posizionare tagliate sezioni sferoidali in HBSS in una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Scegli sezioni centrali per l&#39;analisi delle immagini. Montare sezioni su vetrini mediante il trasferimento della sezione piatta sul vetrino con una pinzetta. Riempire una siringa da 10 ml con grasso per vuoto; aggiungere una linea sottile di grasso per vuoto intorno ai bordi della sezione per evitare che il supporto di montaggio di scappare bordi della diapositiva e contribuire a sigillare la sezione sotto il coprioggetto. Coprire la sezione con mezzo di montaggio e un vetrino. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto. Conservare scivola a 4 ° C prima di imaging. </li></ol> 4. confocale Image Acquisition <ol><li> Prendete una immagine z fetta di una sezione centrale sferoide FUCCI utilizzando un 10Xo obiettivo 20X come descritto in precedenza 7. Assicurarsi che non si sovrappongono o diafonia si verifica tra il Kusabira Orange2 e Azami Verde. Se si confrontano analisi delle immagini tra più sezioni sferoidali, mantenere potenza del laser e altre impostazioni dello stesso tra i campioni. </li></ol> 5. Hoechst Dye Diffusion Assay for Flow Ordinamento <ol><li> Trasferire sferoidi vivi (3-5 giorni dopo la semina agarosio) ad un tubo da 15 ml. Sia sferoidi gravità si depositano sul fondo della provetta. Diversi sferoidi possono essere colorati per provetta. Circa 20 sferoidi sono necessari per ottenere il numero di cellule sufficiente per citometria a flusso. </li><li> Rimuovere eccesso di terreno e aggiungere 1 ml di 10 micron Hoechst diluiti in mezzo normale. Incubare sferoidi a 37 ° C per circa 1 ora. Utilizzare dolce rapido passaggio per risospendere sferoidi una o due volte durante l&#39;incubazione. Nota: Il tempo di incubazione può essere variata di modificare fino a che punto il colorante Hoechst penetra nei sferoidi. Questo varia in basela dimensione sferoide, densità e linea cellulare. Per alcuni grandi / sferoidi densi ci può essere una massima penetrazione colorante che è inferiore al 100%. </li><li> Lavare i sferoidi delicatamente con 5 ml di HBSS con gravità sedimentazione. <ol><li> Opzionale: Per l&#39;imaging di penetrazione del colorante: Fix sferoidi con il 10% formalina tamponata neutra per almeno 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Preparare vibratome sezioni, montare sulle diapositive e immagini sul confocale come descritto ai punti 3 e 4 di cui sopra. </li></ol></li><li> Per preparare le cellule per citometria a flusso, trypsinize sferoidi con 1 ml di 0,05% tripsina / EDTA a 37 ° C per circa 30 minuti con sfogliando ogni 10 min per rompere sferoidi parte. Nota: Spheroids sono difficili da ottenere in sospensione singola cella, le condizioni possono avere bisogno di essere ottimizzato. Viabilità di C8161 4 giorni di età sferoidi dopo questo processo è di circa il 95%. </li><li> Cellule macchia con un live nel vicino infrarosso / macchia morti secondo il protocollo produttori. Lavare con HBSS quindi fissare con 1ml di 10% formalina tamponata neutra per circa 30 min. Le cellule possono essere conservate in HBSS a 4 ° C per diversi giorni prima analisi del flusso. </li></ol> 6. Citometria a flusso Analisi di Hoechst Stained Fucci Spheroids <ol><li> Assicurarsi che le cellule non sono raggruppate insieme facendoli passare attraverso un colino cella. Risospendere il Hoechst macchiato sferoidi Fucci in ghiaccio freddo FACS lavaggio (PBS con 5% Fetal Calf Serum) ad una concentrazione di 1-5 x 10 6 cellule / ml. Trasferire 200 ml di campione in 5 ml provette rotonde di fondo. </li><li> Preparare i seguenti singoli campioni di controllo del colore, come indicato al paragrafo 6.1: cellule di melanoma non-macchiato; cellule di melanoma aderenti colorate con 10 mM Hoechst per 1 ora; Azami verde solo esprimendo cellule di melanoma; e Kusabira arancione solo esprimendo cellule di melanoma. Nota: controlli monocromatici possono essere fissati in formalina e conservati in FACS lavare con 0,1% sodio azide a 4 ° C per settimane o mesi. </li><li> Sospensioni di cellule singole o Runna citometria a flusso analizzatore con i laser appropriati e singolo colore / controlli non colorati come descritto in precedenza 7,16. </li><li> Utilizzare il software citometria commerciale come FlowJo per analizzare l&#39;interno contro cellule sferoidali esterne come segue: <ol><li> Rimuovere i detriti dal gating sulla popolazione di cellule principale in Light Forward Scattered (FSC) vs. Luce sparsi laterale (SSC). </li><li> Rimuovere doppiette da gating su singole cellule utilizzando FSC (Regione) vs. FSC (altezza) </li><li> Porta per le cellule dal vivo di gating sulla popolazione dal vivo / morto basso. </li><li> Definire Hoechst cellule di alta gated, in base al segnale positivo dalle cellule aderenti colorate con Hoechst, come cellule &quot;esterni&quot;. </li><li> Definire Hoechst cellule bassi o negativi, gated sulla base del segnale dal controllo non-tinto, come cellule &quot;interni&quot;. </li><li> Dopo gating per le popolazioni interne ed esterne, le cellule possono essere ulteriormente gated per FUCCI rosso (G1), giallo (inizio S), verde (S / G2 / M) o negativo (G1 precoce). Nota: Cn aiuto compensativo utilizzando i comandi a singolo colore può essere richiesto di definire in modo adeguato le popolazioni rosso, giallo, verde e negativi Fucci. </li></ol></li><li> Una volta che il test è stato ottimizzato e la penetrazione Hoechst convalidato tramite microscopia confocale, eseguire cellule senza fissaggio su un cell sorter di flusso come descritto in precedenza 7,16 per ulteriori analisi di cellule vive sotto-popolazioni. </li></ol> Analisi 7. Immagine di FUCCI sferoide Sezioni <ol><li> Aprire il software ad es. Volocity, scegliere l&#39;unica configurazione quantificazione. </li><li> Creare una nuova libreria. Importare il FUCCI sferoide file immagine confocale nel software trascinando il file di dati grezzi dal confocale nella libreria. In alternativa, utilizzare il comando File&gt; Importa. </li><li> Vai alla scheda misure per costruire un protocollo di analisi delle immagini. Il protocollo è costruito trascinando i comandi appropriati nell&#39;ordine corretto come segue nella finestra del protocollo. </li><li> Trova objette nel canale verde: Trascinare il comando (che si trova in &#39;Finding&#39;) nella finestra del protocollo il ritrovamento di oggetti, selezionare il canale corretto negli oggetti find protocol.Add un comando di apertura (che si trova in &#39;Processing&#39;), poi un toccare oggetti separati il comando (che si trova in &#39;trattamento&#39; - questo sarà separare le cellule). Escludere gli oggetti di dimensioni &lt;50 micron (che si trova in &#39;filtraggio&#39; - questo esclude piccoli oggetti non cellulari). Nota: Le variabili quali oggetti il ​​ritrovamento di soglia, il numero di iterazioni aperte, le dimensioni degli oggetti da separare e le dimensioni degli oggetti da escludere deve essere ottimizzata manualmente fino maschere oggetto corrispondenza dell&#39;immagine. </li><li> Trova gli oggetti nel canale rosso: Ripetere trovare oggetti come sopra per il canale rosso. Potrebbe essere necessario modificare separatamente protocolli verde e rosso. Nota: A causa di nuclei essere in G2, nuclei verdi sono spesso leggermente più grandi. </li><li> Confermare oggetti ritrovati sono accurate Confermare rosso e oggetti verdi corrispondono allanuclei rosso e verde nell&#39;immagine spegnendo e sui canali verde e rosso (con la pelle o mostrare comando canale) durante la visualizzazione delle maschere rosso e verde, trovate da protocollo. Le opzioni di retroazione (Misurazioni&gt; opzioni di retroazione) possono essere utilizzati per modificare l&#39;aspetto delle maschere oggetto. </li><li> Trova gli oggetti gialli (cellule in fase precoce S): Per trovare celle gialle, aggiungere un intersecano rosso con le cellule verdi di comando (si trovano in &#39;combinazione&#39;). Escludere gli oggetti per dimensione (&lt;50 micron, si trovano in &#39;filtraggio&#39;) di escludere i piccoli oggetti non cellulari. </li><li> Trova gli oggetti esclusivamente rossi (cellule in fase G1): Per trovare i nuclei esclusivamente rossi, sottrarre le cellule gialle dai globuli rossi (che si trova in &#39;combinazione&#39;). Escludere gli oggetti in base alle dimensioni &lt;50 micron, (che si trova in &#39;filtraggio&#39;) per eliminare eventuali piccoli oggetti non cellulari creati. </li><li> Trova gli oggetti esclusivamente verdi (S / G2 / M celle di fase): Ripetere la procedura per il canale verde di trovare esclusivamente verde. Note: Se ci sono ancora oggetti non cellulari restanti, un comando popolazione filtro può essere aggiunta ai protocolli di rosso verde o esclusive Exclusive (che si trova in &#39;filtraggio&#39;) di mantenere solo gli oggetti con un fattore di forma maggiore di 0,25. Questo eliminerà gli oggetti non circolari. </li><li> Trova il contorno sferoide: Trova il contorno sferoide utilizzando un ritrovamento di comando (che si trova in &#39;Finding&#39;) con il canale verde o rosso (a seconda di quale ha più celle intorno al bordo dello sferoide) oggetti. Una soglia molto più bassa (che si trova nel trovare gli oggetti variabili) dovrà essere usato per trovare il contorno sferoide rispetto alle singole celle. <ol><li> Utilizzare un comando di chiusura per unire gli oggetti (che si trova in &#39;Processing&#39;), poi riempire i fori negli oggetti (che si trova in &#39;Processing&#39;), quindi utilizzare un filtro fine (che si trova in &#39;filtraggio&#39;) per rimuovere il rumore da oggetti. Infine, escludere gli oggetti in base alle dimensioni per rimuovere gli oggetti più piccoli &lt;30.000 micron (a seconda delle dimensioni sferoide). Nota: Questo protocollo dovrà essere ottimizzato manualmente finché il contorno sferoide è accurato. Un&#39;immagine brightfield può essere utilizzato anche - ma questo è generalmente meno accurato con una sezione sferoide, e un comando di inversione (trovato in &#39;Combinando&#39;) dovrà essere utilizzato. </li></ol></li><li> Misurare le distanze di nuclei a contorno sferoide: Misurare le distanze (che si trova in &#39;Relative&#39;) dalle popolazioni di colore giallo, esclusivamente verde e rosso esclusivamente dal baricentro cella a bordo della sferoide outline.To visualizzare le distanze minime, che dovrebbe essere dal cella a bordo sferoide più vicino, attivare Mostra distanze nella scheda relazioni di opzioni di feedback (Misure&gt; Le opzioni di retroazione&gt; Relazioni). </li><li> Salvare il protocollo. Questo protocollo può essere ri-applicato ad altre immagini utilizzando le misurazioni&gt; Comando Restore protocollo. </li><li> Creare un elemento di misure (Misure&gt; Fai Misura articolo). I dati possono essere analizzati utilizzando l&#39;analisifunzioni. <ol><li> Passare alla scheda analisi della voce misurazioni. Vai al menu Analysis (Analisi&gt; Analisi) e analizzare la minima distanza dal baricentro delle cellule (rosso, verde o giallo) al bordo sferoide, riassunta dal conte e organizzato per popolazione. </li><li> Per contare il numero di cellule che si trovano ad una certa distanza dal bordo creare un filtro (Analisi&gt; Filter). Il filtro per la distanza minima in figura 2 si basa sulla penetrazione Hoechst (es distanza minima è inferiore a 80 dà popolazione &quot;esterna&quot;). In alternativa, esportare i dati grezzi di un foglio di calcolo per ulteriori analisi. </li></ol></li></ol>

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<li>Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Hoechst+33342+for+cell+selection+from+multicell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).</li>
<li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroid+models+to+explore+cell+cycle+checkpoints+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.</a> BMC cancer. 13, 73(2013).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li>
<li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li>
</ol>

PerkinElmer contributed to the costs of publication.

Analisi delle immagini semi-automatica ha identificato la G1 arrestato regione interna sferoide, e proliferare strati esterni. Questo metodo può essere utilizzato su sferoidi vivi utilizzando una sezione ottica, o in sezioni sferoidali fissi, per identificare variazioni non solo il ciclo cellulare ma espressione marcatore (via immunofluorescenza), morte cellulare, o morfologia cellulare in queste regioni diverse. Motilità cellulare in diverse regioni sferoidali può anche essere quantificato - se si aggiunge dal vivo ...

Sferoidi multicellulare 3D sono stati conosciuti come un modello di tumore per decenni, ma è solo di recente che sono venuti in uso più comune come un modello in vitro per molti tumori solidi. Essi sono sempre più utilizzati in high-throughput schermi scoperta di nuovi farmaci come intermedio tra complessi, costosi e in modelli in vivo che richiede tempo e il semplice, il modello 2D monostrato basso costo 1-6. Gli studi in coltura 2D sono spesso incapaci di replicare in vivo. Modelli sferoidali di molti tipi di cancro sono in grado di imitare le caratteristiche di crescita, la sensibilità ai farmaci, di penetrazione della droga, interazioni cellula-cellula, disponibilità limitata di ossigeno e nutrienti e lo sviluppo di necrosi che si vede in vivo nei tumori solidi 6-11. Spheroids sviluppano un nucleo necrotico, una regione arrestato quiescente o G1 che circonda il nucleo, e le cellule proliferanti alla periferia dello sferoide 7. Lo sviluppo di queste regionipuò variare a seconda della densità cellulare, tasso di proliferazione e la dimensione dello sferoide 12. E &#39;stato ipotizzato che l&#39;eterogeneità cellulare visto in queste diverse sotto-regioni può contribuire a cancro resistenza alla terapia 13,14. Pertanto, la capacità di analizzare le cellule in queste regioni è parte fondamentale per la comprensione risposta ai farmaci tumorali. Il sistema di indicatori del ciclo cellulare fluorescenza ubiquitination (FUCCI) si basa sul rosso (Kusabira Orange - KO) e verde (Azami verde - AG) il tagging fluorescente CDT1 e Geminin, che vengono degradati nelle diverse fasi del ciclo cellulare 15. Così nuclei delle cellule appaiono di colore rosso in G1, gialli in S e verde in S / G2 / M di fase. Descriviamo qui due metodi complementari sia con FUCCI per identificare il ciclo cellulare, insieme con l&#39;uso di software di imaging o di un flusso di colorante diffusione citometria test per determinare se le cellule risiedono nel centro G1 arrestato o proliferatin esternog anello, e la distanza delle singole cellule dal bordo dello sferoide. Questi metodi sono stati sviluppati nella nostra pubblicazione precedente, dove abbiamo dimostrato che le cellule di melanoma nelle regioni ipossiche nel centro dello sferoide e / o in presenza di terapie mirate sono in grado di rimanere in G1 arresto per lunghi periodi di tempo, e può ri- entrare nel ciclo cellulare in cui condizioni più favorevoli emergono 7.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>agarose low melting point</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td>For sectioning</td></tr><tr><td>noble agar&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5431</td><td>For making spheroids</td></tr><tr><td>agarose for spheroids</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>For making spheroids</td></tr><tr><td>0.05% trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>10% formalin</td><td>Sigma</td><td>HT5014-1CS</td><td>CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do &amp;nbsp;not breath fumes (open in a fume cupboard).</td></tr><tr><td>live/dead near IR</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>vibratome</td><td>Technical Products International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coulture cup</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SIE936</td><td>Mold for sectioning spheroids</td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Invitro</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>collagenase</td><td>Sigma</td><td>C5138&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer analyser</td><td>Becton Dickinson</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>flowjo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>Flow cytometry software</td></tr><tr><td>Vaccuum grease</td><td>Sigma</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI (commercial constructs)</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>Transient transfection only</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;#956;m</td><td>In Vitro</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom 5 ml tubes (sterile)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom 5 ml tubes (non-sterile)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352008</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3d melanoma spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Esistono diversi metodi per produrre sferoidi tumorali, questo protocollo utilizza il metodo di crescita non aderente, in cui le cellule sono coltivate su agar o 3,7,9 agarosio. La Figura 1 mostra un esempio di uno sferoide C8161 melanoma dopo 3 giorni su agar. Sferoidi C8161 formano sferoidi di dimensioni regolari con un diametro di 500 - 600 micron (media = 565, DS = 19, n = 3) dopo 3 giorni. Altre linee di cellule di melanoma che formeranno sferoidi includono: WM793, WM983C, WM983B, WM164,...

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Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Analisi basata su Citometria Imaging- e di flusso della posizione cellulare e ciclo cellulare in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

imaging-flow-cytometry-based-analysis-cell-position-cell-cycle-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

13.0K Views.  The Centenary Institute. We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids. 

Video: Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

Un modello di pelle sferoide 3D Organotypic Melanoma

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, high-throughput imaging modalities utilizing bright field or fluorescence detection, are unable to resolve the overall 3D structure of the tumor spheroid due to limited light penetration, diffusion of fluorescent dyes and depth-resolvability. Recently, our lab demonstrated the use of optical coherence tomography (OCT), a label-free and non-destructive 3D imaging modality, to perform longitudinal characterization of multicellular tumor spheroids in a 96-well plate. OCT was capable of obtaining 3D morphological and physiological information of tumor spheroids growing up to about 600 &#181;m in height. In this article, we demonstrate a high-throughput OCT (HT-OCT) imaging system that scans the whole multi-well plate and obtains 3D OCT data of tumor spheroids automatically. We describe the details of the HT-OCT system and construction guidelines in the protocol. From the 3D OCT data, one can visualize the overall structure of the spheroid with 3D rendered and orthogonal slices, characterize the longitudinal growth curve of the tumor spheroid based on the morphological information of size and volume, and monitor the growth of the dead-cell regions in the tumor spheroid based on optical intrinsic attenuation contrast. We show that HT-OCT can be used as a high-throughput imaging modality for drug screening as well as characterizing biofabricated samples.

Optical coherence tomography (OCT), a three-dimensional imaging technology, was used to monitor and characterize the growth kinetics of multicellular tumor spheroids. Precise volumetric quantification of tumor spheroids using a voxel counting approach, and label-free dead tissue detection in the spheroids based on intrinsic optical attenuation contrast, were demonstrated.

Longitudinale morfologiche e fisiologiche monitoraggio di sferoidi tridimensionale del tumore usando la tomografia a coerenza ottica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

Paziente fisiologico Derivato da spheroid 3D per lo screening farmacologico anti-neoplastico per colpire le cellule staminali tumorali

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

Un nuovo modello di spheroid del tumore strutturato in 3D modulato come fibromastro per studiare l'interazione tumora-stroma e la scoperta di farmaci

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the spheroid at the cellular level is important for analysis, yet existing techniques are often expensive, laborious, use non-standard equipment, cause significant size distortion, or are limited to relatively small spheroids. This protocol presents a new method of mounting and clearing spheroids that address these issues while allowing for confocal analysis of the inner structure of spheroids. In contrast to existing approaches, this protocol provides for rapid mounting and clearing of a large number of spheroids using standard equipment and laboratory supplies. Mounting spheroids in a pH-neutral agarose-PBS gel solution before introducing a refractive-index-matched clearing solution minimizes size distortion common to other similar techniques. This allows for detailed quantitative and statistical analysis where the accuracy of size measurements is paramount. Furthermore, compared to liquid clearing solutions, the agarose gel technique keeps spheroids fixed in place, allowing for the collection of three-dimensional (3D) confocal images. The present article elaborates how the method yields high-quality two- and 3D images that provide information about inter-cell variability and inner spheroid structure.

Tumor spheroids are becoming increasingly utilized to assess tumor cell-microenvironment interactions and therapy response. The present protocol describes a robust but simple method for semi-high-throughput imaging of 3D tumor spheroids using rapid optical clearing.

Clearing ottico rapido per l'analisi semi-ad alto rendimento degli sferoidi tumorali

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Medicina

<meta charset="utf8"></head><body>Esame delle interazioni macrofagi-sferoidi tumorali in una configurazione di matrice di collagene 3D

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Analisi basata su Citometria Imaging- e di flusso della posizione cellulare e ciclo cellulare in 3D Melanoma Spheroids

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