We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).

1. FUCCI transduction et culture cellulaire <ol><li> FUCCI transduction <ol><li> Créer des lignées cellulaires exprimant de manière stable le FUCCI construit mKO2-hCdt1 (30-120) et GAM-hGem (1-100) 15 en utilisant la co-transduction lentivirus 7 comme décrit précédemment. Remarque: Le système FUCCI est maintenant disponible dans le commerce. </li><li> Générer sous-clones avec une vive fluorescence par tri seule cellule. Trier simples cellules positives pour les deux AG et KO (jaune) par fluorescence tri cellulaire activé dans une plaque de 96 puits tel que décrit précédemment 7,16. </li></ol></li><li> Culture de cellules de mélanome <ol><li> C8161 Culture des cellules de mélanome humain tels que décrits précédemment 7,17. </li></ol></li></ol> 2. Formation 3D Spheroid (comme décrit précédemment 3,9) <ol><li> La préparation des plaques d&#39;agarose <ol><li> Dissoudre 1,5% d&#39;agarose (gélose noble ou) dans 100 ml de sel équilibré la solution de Hank (HBSS) ou phosphate Buffèred saline (PBS) par ebullition dans le micro-ondes pendant 3 à 5 min en agitant. Assurez-vous que l&#39;agarose est complètement dissous. </li><li> Répartir immédiatement 100 pi de la solution d&#39;agarose par puits à une plaque de 96 puits de culture de tissu à fond plat avec une pipette multi-canal. Remarque: Agarose peut se solidifier dans les conseils après une courte période de temps, pour surmonter ce problème conseils doivent être changés entre les plaques se faisant plus d&#39;une plaque d&#39;agarose. </li><li> Laissez plaque de 96 puits sur une surface plane à durcir agarose pendant au moins 1 h. </li></ol></li><li> La préparation des cellules et la superposition sur agarose <ol><li> Cultiver les cellules à environ 80% de confluence dans un flacon T75. Laver avec 10 ml de HBSS. </li><li> Détacher les cellules en utilisant 1,5 ml de trypsine à 0,05% d&#39;acide / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et remettre en suspension dans 10 ml de milieu normal. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre 18 ou une autre méthode de comptage automatisé. </li><li> Remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 25.000 cellules / ml dans la normemoyen al. </li><li> Superposez puits agarose avec 200 pi de la suspension de cellules pour un nombre final de 5000 cellules par puits. </li><li> Plaques de retour à l&#39;incubateur de culture cellulaire (5% de CO 2 et 37 ° C) pour former des sphéroïdes plus environ 3 jours. Remarque: Le temps nécessaire pour former un sphéroïde varie entre différentes lignées cellulaires. Certaines lignées cellulaires ne forment pas des sphéroïdes en utilisant cette méthode à tous. </li><li> Image en morphologie sphéroïde avec un microscope inversé en utilisant un objectif de 4X et un filtre à contraste de phase. Une lignée de cellules qui forme avec succès sphéroïdes produiront agrégats cellulaires compacts, plus ou moins sphériques, et il devrait y avoir qu&#39;un seul sphéroïde par puits. Note: Facultatif: Une fois sphéroïdes ont formé, ils peuvent être transplantées dans du collagène ou une autre matrice pour une analyse approfondie de la croissance et de l&#39;invasion 3,7,17. Pour supprimer sphéroïdes à partir de collagène, traiter avec 500 pi de 2 mg / ml de collagénase à 37 ° C jusqu&#39;à ce que le collagène est dissous assez pour le SpherOID à venir librement dans les médias (environ 30 min). Retirez délicatement sphéroïdes utilisant une pipette de 1 ml. </li><li> Pour sectionnement / imagerie sphéroïdes fixes (soit isolés à partir de collagène ou cultivées pendant 3-5 jours sur agarose) à 10% du formol tamponné neutre (ATTENTION: formol doit être utilisé dans une sorbonne) pendant au moins 2 heures à la température ambiante (RT) , ou toute la nuit (O / N) à 4 ° C. Sphéroïdes peuvent être stockées dans du HBSS à 4 ° C pendant plusieurs jours. </li></ol></li></ol> 3. Spheroid Vibratome sectionnement <ol><li> Dissoudre 5 g d&#39;agarose à faible point de fusion dans 100 ml de HBSS dans un flacon en verre de 500 ml dans un four micro-ondes. Utilisez un réglage de feu moyen en remuant. ATTENTION: Gardez le couvercle lâche lors de l&#39;ébullition de la solution ainsi que la pression peut être libérée. Utilisez des gants de protection résistant à la chaleur pour protéger les mains contre les brûlures lors de la manipulation de la bouteille de verre chaud. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose refroidit légèrement - de sorte que la bouteille peut être touché sans brûler les mains. </li><li> Verser approximationron 2 ml d&#39;agarose dans le fond d&#39;un compteur Coulter tasse ou un moule plastique analogue. Aspirer immédiatement un sphéroïde fixe (voir section 2.2.8) en utilisant une pipette de 1 ml dans le plus petit volume de liquide possible. Ajouter à la sphéroïde agarose. Quelques sphéroïdes (jusqu&#39;à 10) peuvent être ajoutés par tasse. </li><li> Couvrir les sphéroïdes avec 2 ml plus d&#39;agarose. Pour ce faire rapidement pour éviter le durcissement agarose avant la deuxième couche est ajouté. </li><li> Laisser la gélose à durcir à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant au moins 3 h. A ce point les tasses peuvent être stockés pendant une courte période à 4 ° C avec 2-3 ml de HBSS superposées pour éviter la déshydratation. </li><li> Retirer agarose de la tasse. Coupez le agarose contenant les sphéroïdes afin qu&#39;il tienne sur le bloc de métal vibratome et sphéroïdes sont à proximité du sommet de la gélose. Sphéroïdes peuvent être considérés comme de petits objets blancs à l&#39;intérieur de l&#39;agarose. Super Glue l&#39;agarose au bloc. </li><li> Remplissez le vibratome avec de l&#39;eau distillée et monter le bloc dans la vibratome. Met levibratome pour couper 100 um sections à vitesse lente (réglage 2) et de fortes vibrations (réglage 8). Réglez l&#39;angle de lame de coupe à 16 °. Tournez sur vibratome, allumer la lumière vibratome et couper des sections du haut de l&#39;agarose jusqu&#39;à 100 um sections sphéroïde sont coupés. Placez sections sphéroïde couper en HBSS dans une plaque de 24 puits. </li><li> Choisissez sections intermédiaires pour l&#39;analyse d&#39;image. Sections de montage sur diapositives en transférant la section à plat sur la diapositive à l&#39;aide des pinces. Remplir une seringue de 10 ml baril avec de la graisse à vide; ajoutez une fine ligne de graisse à vide sur les bords de la section afin d&#39;empêcher les médias de montage de courir sur les bords de la diapositive et aider à sceller la section sous la lamelle. Couvrir la section avec un milieu de montage et une lamelle. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Magasin glisse à 4 ° C avant l&#39;imagerie. </li></ol> 4. confocale Image Acquisition <ol><li> Prenez une image z-tranche d&#39;une section de sphéroïde milieu de FUCCI utilisant un 10Xou un objectif 20X comme décrit précédemment 7. Assurez-vous pas de chevauchement ou de la diaphonie se produit entre les Kusabira Orange2 et Azami vert. Si l&#39;on compare l&#39;analyse d&#39;image entre les sections de sphéroïde multiples, maintenir la puissance du laser et d&#39;autres paramètres de la même entre les échantillons. </li></ol> 5. Hoechst Dye Diffusion Essai de débit Tri <ol><li> Transfert sphéroïdes vivants (3-5 jours après l&#39;ensemencement) d&#39;agarose dans un tube de 15 ml. Soit sphéroïdes gravité se déposent au fond du tube. Plusieurs sphéroïdes peuvent être colorées par tube. Environ 20 sphéroïdes sont nécessaires pour obtenir le nombre de cellules suffisant pour cytométrie de flux. </li><li> Retirer moyen excès et ajouter 1 ml de 10 um Hoechst diluées dans le milieu normal. Incuber sphéroïdes à 37 ° C pendant environ 1 heure. Utilisez pichenette douce pour remettre en suspension les sphéroïdes une ou deux fois pendant l&#39;incubation. Remarque: Le temps d&#39;incubation peut être modifiée pour modifier la façon dont loin le colorant Hoechst pénètre dans les sphéroïdes. Cela varie en fonction dela taille de l&#39;ellipsoïde, de la densité et de la lignée cellulaire. Pour certains grands sphéroïdes denses / il peut y avoir une pénétration de colorant maximale qui est inférieure à 100%. </li><li> Laver les sphéroïdes doucement avec 5 ml de HBSS utilisant gravité décantation. <ol><li> Facultatif: Pour l&#39;imagerie de la pénétration de colorant: Fix sphéroïdes avec 10% du formol tamponné neutre pendant au moins 2 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C. Préparer vibratome sections, monter sur des lames et de l&#39;image sur le confocale comme décrit dans les étapes 3 et 4 ci-dessus. </li></ol></li><li> Pour préparer les cellules pour cytométrie de flux, Trypsiniser sphéroïdes avec 1 ml de trypsine à 0,05% / EDTA à 37 ° C pendant environ 30 min avec effleurant toutes les 10 min pour briser les sphéroïdes de l&#39;autre. Remarque: Sphéroïdes sont difficiles à obtenir en suspension de cellule unique, les conditions peuvent avoir besoin d&#39;être optimisé. Viabilité de C8161 4 jours anciens sphéroïdes après ce processus est d&#39;environ 95%. </li><li> Cellules tache avec une tache de vivre proche infrarouge / morts selon le protocole des fabricants. Laver avec de l&#39;HBSS puis fixer avec 1ml de 10% de formaline tamponnée neutre pendant environ 30 min. Les cellules peuvent être stockées dans du HBSS à 4 ° C pendant plusieurs jours avant l&#39;analyse de flux. </li></ol> 6. cytométrie de flux de Hoechst Stained FUCCI Sphéroïdes <ol><li> Assurer cellules ne sont pas agglutinés en les faisant passer à travers un tamis cellulaire. Reprendre le Hoechst tachée sphéroïdes FUCCI dans la glace froide lavage de FACS (PBS avec 5% de sérum de veau foetal) à une concentration de 1-5 x 10 6 cellules / ml. Transférer 200 ul d&#39;échantillon de 5 ml rondes tubes inférieurs. </li><li> Préparer les échantillons uniques de contrôle des couleurs suivantes comme décrit dans 6.1: cellules de mélanome de l&#39;ONU teinté; les cellules de mélanome adhérentes colorées avec 10 uM Hoechst pendant 1 h; Azami Vert exprimant seulement des cellules de mélanome; Kusabira orange et exprimant uniquement des cellules de mélanome. Remarque: simples contrôles de couleur peuvent être fixés dans du formol et entreposés dans FACS laver avec 0,1% d&#39;azoture de sodium à 4 ° C pendant des semaines, voire des mois. </li><li> Suspensions cellulaires seul passage ona cytométrie en flux analyseur avec des lasers appropriés et couleur unique / contrôles non colorées comme décrit précédemment 7,16. </li><li> Utilisez un logiciel de cytométrie commercial comme FlowJo d&#39;analyser l&#39;intérieure vs cellules sphéroïdes extérieures comme suit: <ol><li> Enlever les débris gating sur la principale population de cellules dans l&#39;avenir lumière diffusée (FSC) vs. Side lumière diffusée (SSC). </li><li> Retirer doublets par gating des cellules uniques en utilisant FSC (Région) vs. FSC (Hauteur) </li><li> Porte pour les cellules vivantes par fenêtrage morts la population en direct / faible. </li><li> Définir Hoechst cellules élevés, gated sur la base du signal positif à partir des cellules adhérentes colorés avec Hoechst, que les cellules «extérieur». </li><li> Définir Hoechst cellules faibles ou négatifs, gated basé sur le signal de la commande de non souillé, que les cellules «internes». </li><li> Après déclenchement pour les populations intérieures et extérieures, les cellules peuvent en outre être déclenchés pour FUCCI rouge (G1), jaune (début S), vert (S / G2 / M) ou négative (G1 début). Remarque: CÉMUNÉRATION en utilisant les commandes d&#39;une seule couleur peut être nécessaire de bien définir les populations rouges, jaunes, verts et négatifs FUCCI. </li></ol></li><li> Une fois que le test a été optimisé et la pénétration Hoechst validé par microscopie confocale, les cellules de fonctionner sans fixer sur un trieur de cellules de flux comme décrit précédemment 7,16 pour une analyse approfondie des sous-populations de cellules vivantes. </li></ol> Analyse 7. Image FUCCI sphéroïdes Sections <ol><li> Ouvrir le logiciel, par exemple. Volocity, choisir la configuration SEULEMENT quantification. </li><li> Créer une nouvelle bibliothèque. Importez le FUCCI sphéroïde fichier image confocale dans le logiciel en faisant glisser le fichier de données brutes du confocale dans la bibliothèque. Sinon, utilisez la commande Fichier&gt; Importer. </li><li> Allez à l&#39;onglet des mesures pour construire un protocole d&#39;analyse d&#39;image. Le Protocole est construit en faisant glisser les commandes appropriées dans le bon ordre comme suit dans la fenêtre de protocole. </li><li> Trouver objECTS dans le canal vert: Faites glisser le trouver des objets commande (trouvé dans &quot;constatation&quot;) dans la fenêtre de protocole, sélectionner le canal correct dans les objets de trouvaille protocol.Add une commande d&#39;ouverture (qui se trouve dans le «traitement»), puis un toucher les objets séparés commande (trouvé dans &quot;transformation&quot; - cela va séparer les cellules). Exclure les objets de taille &lt;50 pm (trouvé dans «filtrage» - cela va exclure les petits objets non-cellulaires). Remarque: Les variables telles que le seuil trouver des objets, ouvertes nombre d&#39;itérations, la taille des objets à séparer et la taille des objets à exclure doit être optimisé manuellement jusqu&#39;à ce que les masques d&#39;objet correspondant à l&#39;image. </li><li> Trouvez des objets dans le canal rouge: Répétez trouver des objets comme ci-dessus pour le canal rouge. Peuvent avoir besoin d&#39;être ajustée séparément protocoles verts et rouges. Remarque: En raison de noyaux étant en G2, noyaux verts sont souvent légèrement plus grande. </li><li> Confirmez objets trouvés sont exacts: Confirmation du rouge et objets verts correspondent à lanoyaux rouges et verts dans l&#39;image en éteignant et sur les canaux vert et rouge (en utilisant le masquer ou afficher la commande de canal) tout en affichant les masques rouges et verts trouvés par le protocole. Options de rétroaction (Mesures&gt; options de retour) peuvent être utilisés pour modifier l&#39;apparence des masques d&#39;objets. </li><li> Trouvez des objets jaunes (cellules en phase S précoce): Pour trouver des cellules jaunes, ajouter une intersection rouge avec cellules vertes commande (dans «La combinaison &#39;). Exclure les objets par taille (&lt;50 um, trouvés dans «filtrage») d&#39;exclure les petits objets non-cellulaires. </li><li> Trouvez des objets exclusivement rouges (cellules en phase G1): Pour trouver noyaux exclusivement rouges, soustraire les cellules jaunes de globules rouges (trouvés dans &#39;La combinaison&#39;). Exclure les objets par taille &lt;50 um, (qui se trouve dans «filtrage») pour enlever tous les petits objets non-cellulaires créées. </li><li> Trouvez des objets exclusivement vertes (cellules en phase S / G2 / M): Répétez l&#39;opération pour le canal vert pour trouver exclusivement verte. Nonte: Si il ya encore des objets non-cellulaires restants, une commande de la population de filtre peut être ajouté à des protocoles rouges ou verts Exclusif (trouvés dans «filtrage») pour ne retenir que les objets avec un facteur de forme supérieur à 0,25. Cela permettra d&#39;éliminer les objets non-circulaires. </li><li> Trouver le contour sphéroïde: Trouver le contour de l&#39;aide d&#39;un sphéroïde trouver des objets commande (trouvé dans &quot;constatation&quot;) avec le canal vert ou rouge (selon celui qui a plus de cellules sur le bord du sphéroïde). Un seuil beaucoup plus bas (qui se trouve dans le Trouvez des objets de variables) devra être utilisé pour trouver le contour sphéroïde par rapport à des cellules individuelles. <ol><li> Utilisez une commande proche de rejoindre objets trouvés dans (&#39;Traitement&#39;), puis remplir les trous dans les objets trouvés dans (&#39;Traitement&#39;), puis utiliser un filtre fin (trouvé dans «filtrage») pour supprimer le bruit à partir d&#39;objets. Enfin, exclure des objets de la taille d&#39;enlever des objets plus petits &lt;30 000 um (en fonction de la taille de sphéroïde). Note: Ce protocole devra être optimisée manuellement jusqu&#39;à ce que le contour sphéroïde est exacte. Une image en fond clair peut également être utilisé - mais cela est généralement moins précis avec une section sphéroïde, et une commande Inverser (trouvé dans &#39;La combinaison&#39;) devra être utilisé. </li></ol></li><li> Mesurer les distances de noyaux d&#39;esquisser sphéroïde: Mesurer les distances (trouvés dans «relative») des populations jaunes, exclusivement vertes et exclusivement rouges du centre de gravité de la cellule au bord du sphéroïde outline.To visualiser les distances minimales, qui devrait être de la cellule au bord sphéroïde plus proche, activer l&#39;option Afficher les distances dans l&#39;onglet relations dans les options de rétroaction (Mesures&gt; Options&gt; Rapports de rétroaction). </li><li> Enregistrez le protocole. Ce protocole peut être ré-appliquer à d&#39;autres images en utilisant les mesures&gt; Restaurer commande de protocole. </li><li> Créer un élément de mesure (Mesures&gt; Faire Mesure Point). Les données peuvent être analysées en utilisant l&#39;analysefonctions. <ol><li> Allez à l&#39;onglet d&#39;analyse par le produit des mesures. Allez dans le menu Analyse (Analyse&gt; Analyser) et d&#39;analyser la distance minimale entre le centre de gravité de la cellule (rouge, vert ou jaune) au bord sphéroïde, résumée par le comte et organisée par la population. </li><li> Pour compter le nombre de cellules qui se trouvent à une certaine distance du bord créer un filtre (Analyse&gt; Filtre). Le filtre de distance minimale à la figure 2 est basé sur la pénétration Hoechst (par exemple, la distance minimale est inférieure à 80 donne la population «externe»). Alternativement, l&#39;exportation des données brutes vers un tableur pour une analyse ultérieure. </li></ol></li></ol>

<ol><li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).</li>
<li>Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Melanoma+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Healthcare%22%5BJournal%5D)">Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo.</a> Healthcare. 2, 27-46 (2014).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+tumor+microenvironment+models+for+anticancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery.</a> Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).</li>
<li>Reid, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+multicellular+tumor+spheroid+models+for+high-content+imaging+and+screening+in+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+chemical+genomics+and+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery.</a> Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+the+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Haass, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+cycle+imaging+during+melanoma+growth%2C+invasion%2C+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+cell+%26+melanoma+research%22%5BJournal%5D)">Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response.</a> Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).</li>
<li>Lucas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NOXA+and+MCL-1+as+a+strategy+for+sensitizing+melanoma+cells+to+the+BH3-mimetic+ABT-737%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).</li>
<li>Smalley, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).</li>
<li>Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems+modeling+tumor+growth+determinants+in+cancer+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery.</a> Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).</li>
<li>Santini, M. T., Rainaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+model+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pathobiology+%3A+journal+of+immunopathology%2C+molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid model in tumor biology.</a> Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+tumour+heterogeneity+in+melanoma+therapy%3A+how+do+we+address+this+in+a+novel+model+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Manag%22%5BJournal%5D)">Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system?</a> Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+oncology%2Fhematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance.</a> Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulated+expression+of+zonula+occludens+protein-1+in+human+melanoma+associates+with+N-cadherin+and+contributes+to+invasion+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion.</a> The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).</li>
<li>Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2015).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glutamine+transport+to+suppress+melanoma+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer.+Journal+international+du+cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth.</a> International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).</li>
<li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+division%22%5BJournal%5D)">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell division. 6, 22(2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+deep+imaging+of+live+cellular+spheroids+with+light-sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy.</a> Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).</li>
<li>Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Hoechst+33342+for+cell+selection+from+multicell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).</li>
<li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroid+models+to+explore+cell+cycle+checkpoints+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.</a> BMC cancer. 13, 73(2013).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li>
<li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li>
</ol>

PerkinElmer contributed to the costs of publication.

Semi-automatisé d&#39;analyse d&#39;image identifié la région intérieure sphéroïde G1 arrêté, et la prolifération des couches externes. Ce procédé peut être utilisé sur des sphéroïdes sous tension au moyen d&#39;un article optique, ou dans des sections de sphéroïdes fixes, afin d&#39;identifier des changements dans non seulement du cycle cellulaire, mais l&#39;expression du marqueur (par immunofluorescence), la mort cellulaire, ou la morphologie des cellules dans les différentes régions. Motilité cel...

Sphéroïdes multicellulaires 3D ont été connu comme un modèle de tumeur pendant des décennies, mais il est seulement récemment qu&#39;ils sont venus dans l&#39;usage plus fréquent comme un modèle in vitro pour de nombreux cancers solides. Ils sont de plus en plus utilisés dans les écrans de découverte de médicaments à haut débit comme un intermédiaire entre complexe, coûteux et chronophage de modèles in vivo et le simple, le modèle monocouche faible coût 2D 1-6. Études en culture 2D sont souvent incapables de répliquer in vivo. Modèles sphéroïde nombreux types de cancer sont capables d&#39;imiter les caractéristiques de croissance, la sensibilité de la drogue, la pénétration du médicament, interactions cellule-cellule, la disponibilité restreinte du oxygène et de nutriments et le développement de la nécrose qui est vu dans vivo dans les tumeurs solides 6-11. Sphéroïdes développent un coeur nécrotique, une région de repos ou G1 arrêté entourant le noyau, et les cellules en prolifération, à la périphérie de la sphéroïde 7. Le développement de ces régionspeut varier en fonction de la densité cellulaire, le taux de prolifération et la taille de l&#39;ellipsoïde 12. Il a été émis l&#39;hypothèse que l&#39;hétérogénéité cellulaire vu dans ces différentes sous-régions peut contribuer au cancer résistance au traitement 13,14. Par conséquent, la capacité d&#39;analyser les cellules dans ces régions est cruciale séparément réponse aux médicaments compréhension tumorales. Le système d&#39;indicateurs du cycle cellulaire par fluorescence d&#39;ubiquitination (FUCCI) est basé sur le rouge (Kusabira Orange - KO) et vert (Azami Vert - AG) marquage fluorescent de CDT1 et Geminin, qui sont dégradés dans les différentes phases du cycle cellulaire 15. Ainsi les noyaux cellulaires apparaissent en rouge dans le G1, jaune au début de S et vert dans S / phase G2 / M. Nous décrivons ici deux méthodes complémentaires à la fois à l&#39;aide FUCCI pour identifier le cycle cellulaire, de même que l&#39;utilisation d&#39;un logiciel d&#39;imagerie ou d&#39;un flux de diffusion de colorant cytométrie essai pour déterminer si les cellules se trouvent dans le centre de la G1 arrêté ou externe proliferating bague, et la distance des cellules individuelles à partir du bord de la sphéroïde. Ces méthodes ont été développées dans notre publication précédente, où nous avons démontré que les cellules de mélanome dans les régions hypoxiques dans le centre du sphéroïde ou / et en présence de thérapies ciblées sont en mesure de rester dans G1 arrestation pendant de longues périodes de temps, et peut re- entrer dans le cycle cellulaire lorsque des conditions plus favorables proviennent 7.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>agarose low melting point</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td>For sectioning</td></tr><tr><td>noble agar&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5431</td><td>For making spheroids</td></tr><tr><td>agarose for spheroids</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>For making spheroids</td></tr><tr><td>0.05% trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>10% formalin</td><td>Sigma</td><td>HT5014-1CS</td><td>CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do &amp;nbsp;not breath fumes (open in a fume cupboard).</td></tr><tr><td>live/dead near IR</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>vibratome</td><td>Technical Products International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coulture cup</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SIE936</td><td>Mold for sectioning spheroids</td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Invitro</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>collagenase</td><td>Sigma</td><td>C5138&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer analyser</td><td>Becton Dickinson</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>flowjo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>Flow cytometry software</td></tr><tr><td>Vaccuum grease</td><td>Sigma</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI (commercial constructs)</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>Transient transfection only</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;#956;m</td><td>In Vitro</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom 5 ml tubes (sterile)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom 5 ml tubes (non-sterile)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352008</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3d melanoma spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Il existe plusieurs procédés de production de sphéroïdes de tumeur, ce protocole utilise la méthode de croissance non-adhérente, où les cellules sont mises en culture sur de la gélose ou agarose 3,7,9. La figure 1 montre un exemple d&#39;un sphéroïde C8161 de mélanome dans les 3 jours sur de la gélose. Sphéroïdes C8161 forment sphéroïdes de taille régulière avec un diamètre de 500 - 600 um (moyenne = 565, SD = 19, n = 3) après 3 jours. D&#39;autres lignée...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids at JoVE.com

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

imaging-flow-cytometry-based-analysis-cell-position-cell-cycle-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

13.0K vues.  The Centenary Institute. We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids. 

Vidéo: Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

Un modèle de peau 3D organotypique mélanome sphéroïde

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, high-throughput imaging modalities utilizing bright field or fluorescence detection, are unable to resolve the overall 3D structure of the tumor spheroid due to limited light penetration, diffusion of fluorescent dyes and depth-resolvability. Recently, our lab demonstrated the use of optical coherence tomography (OCT), a label-free and non-destructive 3D imaging modality, to perform longitudinal characterization of multicellular tumor spheroids in a 96-well plate. OCT was capable of obtaining 3D morphological and physiological information of tumor spheroids growing up to about 600 &#181;m in height. In this article, we demonstrate a high-throughput OCT (HT-OCT) imaging system that scans the whole multi-well plate and obtains 3D OCT data of tumor spheroids automatically. We describe the details of the HT-OCT system and construction guidelines in the protocol. From the 3D OCT data, one can visualize the overall structure of the spheroid with 3D rendered and orthogonal slices, characterize the longitudinal growth curve of the tumor spheroid based on the morphological information of size and volume, and monitor the growth of the dead-cell regions in the tumor spheroid based on optical intrinsic attenuation contrast. We show that HT-OCT can be used as a high-throughput imaging modality for drug screening as well as characterizing biofabricated samples.

Optical coherence tomography (OCT), a three-dimensional imaging technology, was used to monitor and characterize the growth kinetics of multicellular tumor spheroids. Precise volumetric quantification of tumor spheroids using a voxel counting approach, and label-free dead tissue detection in the spheroids based on intrinsic optical attenuation contrast, were demonstrated.

Longitudinale morphologiques et physiologiques surveillance des sphéroïdes de tumeur en trois dimensions à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

Patients physiologiques dérivés sphéroïdes 3D pour le dépistage des médicaments anti-néoplastiques pour cibler les cellules souches cancéreuses

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Évaluation de la viabilité cellulaire et de la mort dans les cultures sphéroïdes 3D des cellules cancéreuses

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

Un nouveau modèle 3D de Sphéroïde de tumeur de Stromal-Modulé pour étudier l’interaction de tumeur-Stroma et la découverte de drogue

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the spheroid at the cellular level is important for analysis, yet existing techniques are often expensive, laborious, use non-standard equipment, cause significant size distortion, or are limited to relatively small spheroids. This protocol presents a new method of mounting and clearing spheroids that address these issues while allowing for confocal analysis of the inner structure of spheroids. In contrast to existing approaches, this protocol provides for rapid mounting and clearing of a large number of spheroids using standard equipment and laboratory supplies. Mounting spheroids in a pH-neutral agarose-PBS gel solution before introducing a refractive-index-matched clearing solution minimizes size distortion common to other similar techniques. This allows for detailed quantitative and statistical analysis where the accuracy of size measurements is paramount. Furthermore, compared to liquid clearing solutions, the agarose gel technique keeps spheroids fixed in place, allowing for the collection of three-dimensional (3D) confocal images. The present article elaborates how the method yields high-quality two- and 3D images that provide information about inter-cell variability and inner spheroid structure.

Tumor spheroids are becoming increasingly utilized to assess tumor cell-microenvironment interactions and therapy response. The present protocol describes a robust but simple method for semi-high-throughput imaging of 3D tumor spheroids using rapid optical clearing.

Nettoyage optique rapide pour l’analyse à semi-haut débit des sphéroïdes tumoraux

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Médecine

<meta charset="utf8"></head><body>Examen des interactions macrophage-sphéroïde tumoral dans une configuration de matrice de collagène 3D

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

Résumé

Explorer plus de vidéos

PLAYLIST