We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).

1. FUCCI Transdução e Cultura de Células <ol><li> Transdução FUCCI <ol><li> Criar linhas de células que expressam estavelmente o FUCCI constrói mKO2-hCdt1 (30-120) e MAG-hGem (1-100) 15 utilizando co-transdução de lentivírus, como descrito anteriormente 7. Nota: O sistema FUCCI já está disponível comercialmente. </li><li> Gerar sub-clones com fluorescência brilhante pela triagem de uma única célula. Ordenar as células individuais positivas tanto para AG e KO (amarelo) por fluorescência de células activadas por triagem em uma placa de 96 poços como anteriormente descrito 7,16. </li></ol></li><li> A cultura de células de melanoma <ol><li> Células de melanoma humano C8161 cultura como anteriormente descrito 7,17. </li></ol></li></ol> 2. Formação esferoidal 3D (como descrito anteriormente 3,9) <ol><li> Placa preparação de agarose <ol><li> Dissolve-se 1,5% de agarose (ou ágar nobre) em 100 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) ou fosfato Buffered salina (PBS) por ebulição no microondas por 3-5 min com agitação. Certifique-se a agarose é completamente dissolvido. </li><li> Dispensar imediatamente 100 uL da solução de agarose por poço para uma placa de 96 poços de cultura de tecidos de fundo plano, utilizando uma pipeta multi-canal. Nota: Agarose pode solidificar nas pontas após um curto período de tempo, para ultrapassar este problema pontas deve ser mudado entre as placas, se fazer mais do que uma placa de agarose. </li><li> Deixar placa de 96 poços sobre uma superfície plana de agarose a endurecer durante pelo menos 1 h. </li></ol></li><li> Preparação de Células e de sobreposição em agarose <ol><li> Cultivar células de aproximadamente 80% de confluência num frasco T75. Lava-se com 10 ml de HBSS. </li><li> Separe as células utilizando 1,5 ml de tripsina a 0,05% / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e ressuspender em 10 ml de meio normal. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro 18 ou outro método de contagem automatizada. </li><li> Ressuspender as células até uma concentração final de 25.000 células / ml em normamédio al. </li><li> Overlay poços de agarose com 200 ul da suspensão de células para um número final de 5.000 células por poço. </li><li> Placas de retorno para a incubadora de cultura celular (5% de CO 2 e 37 ° C) para formar esferóides durante aproximadamente 3 dias. Nota: O tempo necessário para formar um esferóide varia entre diferentes linhas celulares. Algumas linhas de células de não formar esferóides utilizando este método de todo. </li><li> Imagem esferóide morfologia com um microscópio invertido usando uma objetiva de 4X e um filtro de contraste de fase. Uma linha de células que forma com sucesso esferóides irá produzir agregados de células, aproximadamente esféricos compactos, e deve haver apenas um esferóide por poço. Nota: Opcional: Uma vez que os esferóides se terem formado, que podem ser transplantadas em colagénio ou outra matriz para análise de crescimento e invasão 3,7,17. Para remover esferóides de colagénio, trata-se com 500 ul de 2 mg / ml de colagenase, a 37 ° C até que o colagénio é dissolvido suficiente para o spheroids para vir livre no meio (cerca de 30 min). Remova cuidadosamente esferóides utilizando uma pipeta de 1 ml. </li><li> Para realizar o corte / imagiologia esferóides fix (quer isolados a partir de colagénio ou cultivadas durante 3-5 dias em agarose) em 10% de formalina tamponada neutra (CUIDADO: Formalina deve ser utilizado em uma câmara de exaustão) durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente (TA) , ou durante a noite (O / N) a 4 ° C. Os esferóides podem ser armazenados em HBSS a 4 ° C durante vários dias. </li></ol></li></ol> 3. Spheroid Vibratome Seccionamento <ol><li> Dissolve-se 5 g de agarose de baixo ponto de fusão em 100 ml de HBSS em uma garrafa de vidro de 500 ml num forno de microondas. Use uma configuração fogo médio com agitação. CUIDADO: Mantenha a tampa solta quando ferver a solução para que a pressão pode ser liberada. Use luvas heatproof de proteção para proteger as mãos de queimaduras ao manusear a garrafa de vidro quente. </li><li> Aguarde até que a agarose esfria um pouco - para que a garrafa pode ser tocado sem as mãos em chamas. </li><li> Despeje approximamadamente 2 ml de agarose para o fundo de um copo de contador de Coulter ou moldes de plástico semelhante. Imediatamente aspirar um esferóide fixo (ver secção 2.2.8) usando uma pipeta de 1 ml em o menor volume de líquido possível. Adicionar esferóide à agarose. Algumas esferóides (até 10) podem ser adicionados por chávena. </li><li> Cubra os esferóides com 2 ml mais de agarose. Fazê-lo rapidamente para evitar o endurecimento de agarose antes da segunda camada é adicionada. </li><li> Permitir que a agarose endureça à TA no escuro durante pelo menos 3 horas. Em vista disso, do ponto de copos pode ser armazenada por um curto período de tempo, a 4 ° C com 2-3 ml de HBSS sobrepostos para evitar a desidratação. </li><li> Remover agarose do copo. Apare a agarose contendo os esferóides para que ele se encaixa no bloco de metal vibratome, e esferóides estão perto do topo da agarose. Esferóides podem ser vistos como pequenos objetos brancos dentro da agarose. Super cola a agarose para o bloco. </li><li> Encha o vibratome com água destilada e montar o bloco no vibratome. Colocou ovibratome para cortar 100 mm seções usando velocidade baixa (definição 2) e vibração elevada (ajuste 8). Defina o ângulo de lâmina de corte de 16 °. Vire em vibratome, acender a luz vibratome e cortar seções do topo da agarose até 100 mm seções esferóides são cortadas. Coloque seções esferóides cortado em HBSS em uma placa de 24 poços. </li><li> Escolha seções do meio de análise de imagem. Seções de montagem em lâminas de transferência da seção plana para o slide usando uma pinça. Encha uma seringa de 10 ml com graxa de vácuo; adicionar uma linha fina de pasta de vácuo em torno das extremidades da secção, a fim de impedir que o meio de montagem de funcionar fora das extremidades da lâmina e ajudar a selar à secção sob a lamela. Cubra a seção com a montagem médio e uma lamela. Selar bordas da lamela com unha polonês. Loja desliza a 4 ° C antes de imagem. </li></ol> 4. confocal Image Acquisition <ol><li> Tome uma imagem z-slice de uma seção esferóide meio FUCCI usando um 10Xou objectiva 20X como descrito anteriormente 7. Certifique-se de qualquer sobreposição ou crosstalk ocorre entre o Kusabira Orange2 e Azami Green. Se comparando análise de imagem entre várias seções esferóide, mantenha potência do laser e outras definições da mesma entre as amostras. </li></ol> 5. Hoechst Dye Difusão Ensaio para Fluxo Seleção <ol><li> Transferir esferóides vivos (3-5 dias após a semeadura agarose) para um tubo de 15 ml. Vamos esferóides gravidade se depositam no fundo do tubo. Vários esferóides pode ser manchado por tubo. Aproximadamente 20 esferóides são necessários para obter números de células suficientes para citometria de fluxo. </li><li> Remover o excesso de meio e adicionar 1 ml de 10 mM a Hoechst diluídos em meio normal. Incubar esferóides a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora. Use flicking suave para voltar a suspender as esferóides uma ou duas vezes durante a incubação. Nota: O tempo de incubação pode ser variado para alterar o modo como o corante Hoechst longe penetra nos esferóides. Isto irá variar com base naso tamanho do esferóide, densidade e linha celular. Para algumas esferóides grandes / densas, pode haver uma penetração máxima de corante que é inferior a 100%. </li><li> Lavar os esferóides suavemente com 5 mL de HBSS, utilizando a gravidade de sedimentação. <ol><li> Opcional: Para imagiologia de penetração do corante: Fix esferóides com 10% de formalina tamponada neutra para, pelo menos, 2 h à TA ou O / N a 4 ° C. Prepare vibratome seções, montar em slides e imagem no confocal, como descrito nas etapas 3 e 4 acima. </li></ol></li><li> Para preparar as células para citometria de fluxo, Trypsinize esferóides com 1 ml de tripsina a 0,05% / EDTA a 37 ° C durante aproximadamente 30 min, com sacudindo a cada 10 min para quebrar os esferóides separados. Nota: Os esferóides são difíceis de entrar em suspensão de célula única, as condições podem necessitar de ser optimizado. Viabilidade de C8161 4 dias de idade esferóides após este processo é de aproximadamente 95%. </li><li> Células mancha com um ao vivo near-infrared / mancha mortos de acordo com o protocolo do fabricante. Lavar com HBSS, em seguida, fixar com umml de 10% de formalina tamponada neutra por aproximadamente 30 min. As células podem ser armazenadas em HBSS a 4 ° C durante vários dias antes da análise de fluxo. </li></ol> 6. Citometria de Fluxo Análise de Hoechst manchados Fucci Spheroids <ol><li> Assegurar que as células não são aglutinados, passando-os através de um filtro de células. Ressuspender o Hoechst coradas esferóides FUCCI em gelo frio de lavagem de FACS (PBS com 5% de soro fetal de vitela) a uma concentração de 1-5 x 10 6 células / ml. Transferir 200 ul de amostra de 5 ml de fundo redondo tubos. </li><li> Prepare as seguintes amostras de controle de cores individuais, conforme descrito em 6.1: células de melanoma manchado de un; células de melanoma aderentes coradas com 10 mM Hoechst, durante 1 hora; Azami Verde só expressando células de melanoma; e Kusabira Laranja única expressando células de melanoma. Nota: os controlos de cor individuais podem ser fixadas em formalina e armazenado em FACS lava-se com 0,1% de azida de sódio a 4 ° C durante semanas ou mesmo meses. </li><li> Executar suspensões de células únicas de ofluxo na citometria analisador com lasers apropriados e única cor / controles não coradas como descrito anteriormente 7,16. </li><li> Use um software de citometria comercial, como FlowJo para analisar o interior vs. células esferóides exteriores da seguinte forma: <ol><li> Remover detritos por gating na população de células principal em luz dispersa (FSC) vs. Luz Side Espalhados (SSC). </li><li> Remover doublets por gating em células individuais usando FSC (Area) vs. FSC (Altura) </li><li> Portão de células vivas por gating na população de baixa ao vivo / morto. </li><li> Definir a Hoechst células gated elevados, com base no sinal positivo a partir das células aderentes corados com Hoechst, como células &quot;exteriores&quot;. </li><li> Definir Hoechst células baixas ou negativas, fechado com base no sinal de controlo coradas-un, como células &quot;internos&quot;. </li><li> Após as populações de gating para interior e exterior, as células podem ainda ser fechado para FUCCI vermelho (G1), amarelo (S precoce), verde (S / G2 / M) ou negativo (G1 precoce). Nota: Compensation utilizando os controlos de cor única pode não ser necessária para definir adequadamente as populações vermelho, amarelo, verde e negativos FUCCI. </li></ol></li><li> Uma vez que o teste foi otimizado e Hoechst penetração validado via microscopia confocal, as células correr sem fixar em um classificador de célula de fluxo, como descrito anteriormente 7,16 para posterior análise de sub-populações de células ao vivo. </li></ol> 7. Análise de Imagem de FUCCI Spheroid Secções <ol><li> Abrir software por exemplo. Volocity, escolha a única configuração quantificação. </li><li> Criar uma nova biblioteca. Importe o arquivo de imagem confocal FUCCI esferóide para o software arrastando o arquivo de dados brutos do confocal para a biblioteca. Como alternativa, use o Arquivo&gt; Importar comando. </li><li> Vá até a aba medições para construir um protocolo de análise de imagem. O Protocolo é construído, arrastando e soltando os comandos apropriados na ordem correta como se segue na janela de protocolo. </li><li> Encontre objECTS no canal verde: Arraste comando (encontrado em &#39;Finding&#39;) na janela do protocolo a encontrar objetos, selecione o canal correto nos objetos find protocol.Add um comando de abertura (que se encontra em «tratamento»), então um tocantes objetos separados comando (encontrado em &#39;Processamento&#39; - o que irá separar as células). Excluir objetos de tamanho &lt;50 mm (encontrado em &#39;Filtragem&#39; - isso irá excluir os pequenos objetos não celulares). Nota: As variáveis ​​tais como a encontrar objetos limiar, o número de iterações aberto, o tamanho dos objectos a serem separadas e o tamanho dos objectos a excluir deve ser optimizado manualmente até que as máscaras de objectos corresponder à imagem. </li><li> Encontre objetos no canal vermelho: Repetir a encontrar objetos como acima para o canal vermelho. Protocolos de verde e vermelho pode ter de ser ajustada separadamente. Nota: Devido a estar em núcleos G2, núcleos verdes são muitas vezes um pouco maior. </li><li> Confirme objetos encontrados são precisos: Confirmar vermelho e objetos verdes coincidir com onúcleos vermelho e verde na imagem, desligando e nos canais verde e vermelho (usando a ocultar ou mostrar comando canal) ao exibir as máscaras vermelhas e verdes encontrados pelo protocolo. Medições opções de realimentação (feedback)&gt; opções pode ser utilizada para modificar a aparência das máscaras de objectos. </li><li> Encontre objetos amarelos (células em fase S inicial): Para encontrar células amarelas, adicione uma interseção vermelho com células verdes de comando (encontrado em &#39;Combinando&#39;). Excluir objetos de tamanho (&lt;50 mm, encontrados em &#39;Filtragem&#39;) para excluir quaisquer objetos pequenos não celulares. </li><li> Encontre objetos exclusivamente vermelhos (células em fase G1): Para encontrar núcleos exclusivamente vermelhos, subtrair as células amarelas das células vermelhas (encontrados em &#39;Combinando&#39;). Excluir objetos de tamanho &lt;50 mm, (encontrado em &#39;Filtragem&#39;) para remover quaisquer pequenos objetos não celulares criados. </li><li> Encontre objetos exclusivamente verdes (células em fase S / G2 / M): Repita o procedimento para o canal verde para encontrar exclusivamente verde. Nãote: Se ainda houver objetos não celulares restantes, um comando população filtro pode ser adicionado ao exclusivo protocolos vermelho, verde ou exclusivas (encontrados em &#39;Filtragem&#39;) para reter apenas os objetos com um fator de forma maior do que 0,25. Isto irá remover objetos não-circulares. </li><li> Encontre o esboço esferóide: Encontre o contorno esferóide usando um achado de comando (encontrado em &#39;Finding&#39;) com o canal verde ou vermelho (o que tem mais células ao redor da borda do esferóide) objetos. Um limiar muito inferior (que se encontra na encontrar objetos variáveis) terá que ser usada para encontrar o contorno esferóide em comparação com as células individuais. <ol><li> Use um comando de fechamento para se juntar objetos (encontrados em «tratamento»), em seguida, preencher buracos em objetos (encontrados em «tratamento»), em seguida, usar um filtro fino (encontrado em &#39;Filtragem&#39;) para remover o ruído de objetos. Finalmente, excluir objetos por tamanho para remover objectos mais pequenos &lt;30.000 ^ m (dependendo do tamanho do esferóide). Nota: Este protocolo terá de ser otimizada manualmente até o contorno esferóide é preciso. Uma imagem de campo claro, também podem ser utilizadas - no entanto, este é geralmente menos preciso com uma secção esferóide, e um comando invertido (encontrada em &#39;Combinando&#39;) terá de ser utilizado. </li></ol></li><li> Medir distâncias dos núcleos de esferóide a delinear: Medir distâncias (encontrado no &quot;relativa a&quot;) a partir das populações de amarelo, verde e exclusivamente exclusivamente vermelhas do centróide célula para o bordo do esferóide outline.To visualizar as distâncias mínimas, que deve ser a partir da célula para o bordo esferóide mais próximo, ligue mostrar distâncias na guia relações de opções de retorno (Medidas&gt; Opções&gt; Relações Comentário). </li><li> Guardar o protocolo. Este protocolo pode ser reaplicado para outras imagens, usando as medidas&gt; Restaurar comando de protocolo. </li><li> Criar um item de medições (Medidas&gt; Faça Medição item). Os dados podem ser analisados ​​utilizando a análisefunções. <ol><li> Vá até a aba análise no item medições. Vá para o menu Análise (Analysis&gt; Analisar) e analisar a distância mínima entre o baricentro celular (vermelho, verde ou amarelo) para a borda esferóide, resumidos por contagem e organizado pela população. </li><li> Para contar o número de células encontradas a uma certa distância da borda criar um filtro (Análise&gt; Filtrar). O filtro para a distância mínima na Figura 2 é baseado em Hoechst penetração (por exemplo a distância mínima é inferior a 80 dá a população &quot;exterior&quot;). Alternativamente, a exportação de dados não processados ​​para uma planilha para análise posterior. </li></ol></li></ol>

<ol><li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).</li>
<li>Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Melanoma+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Healthcare%22%5BJournal%5D)">Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo.</a> Healthcare. 2, 27-46 (2014).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+tumor+microenvironment+models+for+anticancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery.</a> Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).</li>
<li>Reid, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+multicellular+tumor+spheroid+models+for+high-content+imaging+and+screening+in+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+chemical+genomics+and+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery.</a> Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+the+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Haass, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+cycle+imaging+during+melanoma+growth%2C+invasion%2C+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+cell+%26+melanoma+research%22%5BJournal%5D)">Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response.</a> Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).</li>
<li>Lucas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NOXA+and+MCL-1+as+a+strategy+for+sensitizing+melanoma+cells+to+the+BH3-mimetic+ABT-737%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).</li>
<li>Smalley, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).</li>
<li>Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems+modeling+tumor+growth+determinants+in+cancer+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery.</a> Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).</li>
<li>Santini, M. T., Rainaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+model+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pathobiology+%3A+journal+of+immunopathology%2C+molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid model in tumor biology.</a> Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+tumour+heterogeneity+in+melanoma+therapy%3A+how+do+we+address+this+in+a+novel+model+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Melanoma+Manag%22%5BJournal%5D)">Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system?</a> Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+oncology%2Fhematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance.</a> Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulated+expression+of+zonula+occludens+protein-1+in+human+melanoma+associates+with+N-cadherin+and+contributes+to+invasion+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion.</a> The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).</li>
<li>Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2015).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glutamine+transport+to+suppress+melanoma+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer.+Journal+international+du+cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth.</a> International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).</li>
<li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+division%22%5BJournal%5D)">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell division. 6, 22(2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+deep+imaging+of+live+cellular+spheroids+with+light-sheet-based+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy.</a> Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).</li>
<li>Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Hoechst+33342+for+cell+selection+from+multicell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).</li>
<li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroid+models+to+explore+cell+cycle+checkpoints+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.</a> BMC cancer. 13, 73(2013).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li>
<li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li>
</ol>

PerkinElmer contributed to the costs of publication.

Análise de imagens semi-automatizado identificou a região G1 presos interior esferóide, proliferando e camadas exteriores. Este método pode ser usado em esferóides vivo usando uma secção óptica, ou em secções fixas esferóides, para identificar mudanças na não só o ciclo celular, mas a expressão do marcador (por imunofluorescência), a morte celular, ou a morfologia das células nestas regiões diferentes. Motilidade celular dentro de diferentes regiões esferóides podem também ser quantificada - se as i...

Esferóides multicelulares 3D têm sido conhecida como um modelo de tumor durante décadas, no entanto, só recentemente é que eles tenham entrado em uso mais comuns, como um modelo in vitro para muitos cancros sólidos. Eles são cada vez mais utilizados em telas de alto rendimento de descoberta de drogas como um intermediário entre o complexo, caro e em modelos in vivo demorado e o simples, modelo de monocamada 2D baixo custo 1-6. Estudos em cultura 2D são muitas vezes incapazes de ser replicado in vivo. Modelos esferóides de muitos tipos de cancro são capazes de imitar as características de crescimento, de sensibilidade a drogas, a penetração da droga, as interacções célula-célula, a disponibilidade limitada de nutrientes e de oxigénio e de desenvolvimento de necrose que é visto in vivo em tumores sólidos 6-11. Os esferóides desenvolver um núcleo necrótico, uma região preso quiescente ou G1 que rodeia o núcleo, em proliferação e células na periferia do esferóide 7. O desenvolvimento destas regiõespode variar dependendo da densidade celular, a taxa de proliferação e do tamanho do esferóide 12. Postula-se que a heterogeneidade celular visto nestas sub-regiões diferentes podem contribuir para o câncer resistência terapêutica 13,14. Portanto, a capacidade de analisar as células nessas regiões é crucial para as respostas separadamente drogas compreensão tumorais. O sistema indicador de fluorescência ubiquitinação do ciclo celular (FUCCI) baseia-se no vermelho (Kusabira Laranja - KO) e verde (verde Azami - AG) a marcação fluorescente de CDT1 e geminin, que são degradados em diferentes fases do ciclo celular 15. Assim núcleos celulares aparecem em vermelho no G1, amarelo no início S e verde no S / G2 / M fase. Nós descrevemos aqui dois métodos complementares tanto utilizando FUCCI para identificar o ciclo celular, juntamente com o uso de software de imagem ou de um fluxo de difusão do corante citometria de ensaio para determinar se as células residem no centro da G1 preso ou o exterior proliferatinanel G, e a distância de células individuais a partir da borda do esferóide. Estes métodos foram desenvolvidos na nossa publicação anterior, onde foi demonstrado que as células de melanoma em regiões hipóxicas no centro do esferóide ou / e na presença de terapias específicas são capazes de permanecer em G1 prisão por longos períodos de tempo, e pode re- entrar no ciclo celular quando as condições mais favoráveis ​​surgem 7.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>agarose low melting point</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td>For sectioning</td></tr><tr><td>noble agar&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5431</td><td>For making spheroids</td></tr><tr><td>agarose for spheroids</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>For making spheroids</td></tr><tr><td>0.05% trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>10% formalin</td><td>Sigma</td><td>HT5014-1CS</td><td>CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do &amp;nbsp;not breath fumes (open in a fume cupboard).</td></tr><tr><td>live/dead near IR</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>vibratome</td><td>Technical Products International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coulture cup</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SIE936</td><td>Mold for sectioning spheroids</td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Invitro</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>collagenase</td><td>Sigma</td><td>C5138&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer analyser</td><td>Becton Dickinson</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>flowjo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>Flow cytometry software</td></tr><tr><td>Vaccuum grease</td><td>Sigma</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI (commercial constructs)</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>Transient transfection only</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;#956;m</td><td>In Vitro</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom 5 ml tubes (sterile)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom 5 ml tubes (non-sterile)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352008</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3d melanoma spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Existem vários métodos de produção de esferóides tumorais, este protocolo utiliza o método de crescimento não-aderente, em que as células são cultivadas em agar ou agarose 3,7,9. A Figura 1 mostra um exemplo de um esferóide melanoma C8161 após 3 dias em agar. Esferóides C8161 formar esferóides de tamanho regular com um diâmetro de 500-600 mm (média = 565, SD = 19, n = 3) após 3 dias. Outras linhas de células de melanoma que irão formar esferóides incluem: WM793, WM983C, WM9...

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Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

imaging-flow-cytometry-based-analysis-cell-position-cell-cycle-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

13.0K visualizações.  The Centenary Institute. We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids. 

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A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Pesquisa do câncer

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, high-throughput imaging modalities utilizing bright field or fluorescence detection, are unable to resolve the overall 3D structure of the tumor spheroid due to limited light penetration, diffusion of fluorescent dyes and depth-resolvability. Recently, our lab demonstrated the use of optical coherence tomography (OCT), a label-free and non-destructive 3D imaging modality, to perform longitudinal characterization of multicellular tumor spheroids in a 96-well plate. OCT was capable of obtaining 3D morphological and physiological information of tumor spheroids growing up to about 600 &#181;m in height. In this article, we demonstrate a high-throughput OCT (HT-OCT) imaging system that scans the whole multi-well plate and obtains 3D OCT data of tumor spheroids automatically. We describe the details of the HT-OCT system and construction guidelines in the protocol. From the 3D OCT data, one can visualize the overall structure of the spheroid with 3D rendered and orthogonal slices, characterize the longitudinal growth curve of the tumor spheroid based on the morphological information of size and volume, and monitor the growth of the dead-cell regions in the tumor spheroid based on optical intrinsic attenuation contrast. We show that HT-OCT can be used as a high-throughput imaging modality for drug screening as well as characterizing biofabricated samples.

Optical coherence tomography (OCT), a three-dimensional imaging technology, was used to monitor and characterize the growth kinetics of multicellular tumor spheroids. Precise volumetric quantification of tumor spheroids using a voxel counting approach, and label-free dead tissue detection in the spheroids based on intrinsic optical attenuation contrast, were demonstrated.

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the spheroid at the cellular level is important for analysis, yet existing techniques are often expensive, laborious, use non-standard equipment, cause significant size distortion, or are limited to relatively small spheroids. This protocol presents a new method of mounting and clearing spheroids that address these issues while allowing for confocal analysis of the inner structure of spheroids. In contrast to existing approaches, this protocol provides for rapid mounting and clearing of a large number of spheroids using standard equipment and laboratory supplies. Mounting spheroids in a pH-neutral agarose-PBS gel solution before introducing a refractive-index-matched clearing solution minimizes size distortion common to other similar techniques. This allows for detailed quantitative and statistical analysis where the accuracy of size measurements is paramount. Furthermore, compared to liquid clearing solutions, the agarose gel technique keeps spheroids fixed in place, allowing for the collection of three-dimensional (3D) confocal images. The present article elaborates how the method yields high-quality two- and 3D images that provide information about inter-cell variability and inner spheroid structure.

Tumor spheroids are becoming increasingly utilized to assess tumor cell-microenvironment interactions and therapy response. The present protocol describes a robust but simple method for semi-high-throughput imaging of 3D tumor spheroids using rapid optical clearing.

Limpeza óptica rápida para análise semi-de alto rendimento de esferoides tumorais

Tumor spheroids are fast becoming commonplace in basic cancer research and drug development. Obtaining data regarding protein expression within the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Medicina

<meta charset="utf8"></head><body>Examinando as interações esferoides macrófagos-tumor em uma configuração de matriz de colágeno 3D

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids

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