We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.

Ein allgemeines Diagramm der Exosom Isolierungs- und Reinigungsverfahren ist in Abbildung 1 zur Verfügung gestellt. Das Vollblut wurde von gesunden freiwilligen Spendern und von HIV-positiven Personen, die nicht die antiretrovirale theraoy Teilnahme an der Hoffnung Klinik der Emory University und der ansteckenden Krankheit-Programm von Grady Health System erhalten in Atlanta, Georgia. Diese Studie wurde von der Ethikgremien von Emory University und Morehouse School of Medicine genehmigt. Alle an der Studie beteiligten Personen gaben eine schriftliche und informierte Zustimmung. 1. Herstellung von Exosomen aus Blutplasma <ol><li> Menschliches Blut Erhebung und Verarbeitung <ol><li> Sammeln von 10 ml peripherem Blut durch Venenpunktion in EDTA-Blutsammelröhrchen (enthaltend 18 mg Kalium-EDTA) und vorsichtig umgedreht fünfmal zu mischen. </li><li> Zentrifugieren Blutentnahmeröhrchen bei 1.000 xg für 20 min bei RT pelletiert Blutkörperchen. Verwenden Sie eine sterile Pipettete, die Plasmafraktion (4-5 ml) in einen 25 ml konischen Röhrchen übertragen. Verdünnen des Plasmas mit 10 ml 1 X PBS. Entsorgen Blutzellen (rote Blutkörperchen und weiße Blutkörperchen, die auch als PBMC bekannt) in einem entsprechend gekennzeichneten Behälter für biohazard Abfälle. HINWEIS: Im Fall von nicht-infizierten Spenders Blutproben kann die PBMC für die weitere Verwendung (siehe Verfahren IV.2, unten) reserviert werden. </li><li> Speichern die Plasmaproben bei 4 ° C für kurzfristige (2-3 Tage) oder bei -80 ° C zur Langzeitspeicherung. HINWEIS: Bringen Sie keine gefrorenen Plasmaproben bis 4 ° C vor der weiteren Verarbeitung. </li></ol></li><li> Herstellung von Exosom Fraktion aus Plasma <ol><li> Zentrifuge Plasma bei 10.000 × g für 30 min bei 4 ° C, um Zelltrümmer zu entfernen. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um das bereinigte Plasmaüberstand in ein sauberes 25 ml Ultrazentrifugenröhrchen übertragen. Entsorgen Sie das Pellet in dem Behälter für biologischen. </li><li> Zentrifugieren Sie die gelöscht Plasma bei 100.000 × g für 2h bei 4 ° C, um große Vesikel zu entfernen. Entfernen Sie die 100.000 xg Überstand vorsichtig mit einer Pipette, und entsorgen in biohazard Abfälle. Resuspendieren 100.000 xg Pellet in 1 ml 1X PBS in ein sauberes Röhrchen und Inkubation bei RT für 30 Minuten, wirbeln leicht zu lösen und getrennte Teilchen. </li><li> Durch Zugabe von 25 ml PBS waschen Sie die suspendierten 100.000 xg Exosom / Viruspellet. Vorsichtig umdrehen das Rohr fünf Mal zu mischen, dann zentrifugieren wieder bei 100.000 × g für 2 Stunden bei 4 ° C. Entsorgen Sie die PBS-Waschlösung in der biohazard Abfallbehälter. </li><li> Resuspendieren 100.000 xg Pellet in 1 ml 1 X PBS und Inkubation bei RT für 30 min vorsichtiges Schwenken zu lösen und das Pellet. HINWEIS: Wenn es nicht möglich ist, direkt mit dem Iodixanol Gradientenstufe für 1-2 Tage bis zur Iodixanol Gradientenstufe fortzufahren, speichern das Pellet, das Exosomen und Viruspartikel, bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Reinigung von Exosomen <ol><li> Generieren Sie 6% -18% velockeit Steigungen Iodixanol mit einem Zweikammer-Gradientenformer Gerät. <ol><li> Vorzubereiten 6% und 18% Lösungen der Iodixanol-Reagenz in Form einer 60% igen Lösung in Wasser, durch Verdünnung in PBS zugeführt. Pipette 5,5 ml der 18% igen Lösung in die gerührte Kammer und Pipette 5,5 ml einer 6% Lösung in die Reservoirkammer. Schalten Sie den Rührer, öffnen Sie den Wasserhahn und ermöglichen jedem Gradienten in eine 14 ml Ultrazentrifugenröhrchen fließen. HINWEIS: Verwenden Sie entweder sofort oder bereit Gradienten O / N lagern bei 4 ° C vor der Verwendung. </li><li> Sorgfältig Schicht 1 ml der Exosom / Viruslösung auf die Oberseite jeder 11 ml Gradienten. Zentrifuge Gradienten bei 250.000 × g für 2 Stunden bei 4 ° C unter Verwendung eines SW40Ti Schwenkbecherrotor. </li><li> Beschriften Sie zwölf (12) 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie 1,0 ml von der Spitze des Gradienten und Transfer zum Rohr # 1. Übertragen Sie die verbleibenden 1 ml-Fraktionen in Röhrchen 2-12 der Reihe nach. HINWEIS: Die oberste Fraktion wird daher sein, # 1, die Sumpffraktion, # 12. StErz die Gradientenfraktionen bei 4 ° C. Die gereinigten Exosomen, die in den Fraktionen 1-3 an der Oberseite des Gradienten sein sollten, sind für 3-4 Wochen bei Lagerung bei 4 ° C gelagert. </li></ol></li></ol> 3. Exosom Charakterisierung <ol><li> Acetylcholinesterase (AChE) Aktivitätstest <ol><li> Bereiten 100 mM Substrat Lager durch Mischen Acetylthiocholiniodid 28,9 mg in 1 ml 1X PBS. Shop Substrat Lager bei -20 ° C bis zu 1 Monat. </li><li> Bereiten Sie 10 mM Farbindikator Lager durch Mischen von Benzoesäure 39.6mg und Natriumbicarbonat 15 mg in 10 ml 1X PBS. Shop Farbindikator Lager bei 4 ° C bis zu zwei Wochen. </li><li> Vorbereitung Assayreagenz durch Mischen von 1X PBS, das Substrat und Farbindikator in einem Verhältnis von 100: 2: 5 (zum Beispiel 10 ml 1X PBS + 200 &amp; mgr; l Substrat + 500 ul Farbindikator). </li><li> Dann werden 50 &amp; mgr; l von jedem 1,5 ml Gradientenfraktion Rohr (markiert 1-12 von Verfahren III.3) in die Vertiefungen einer 96-well microtiter Platte. Bereiten Sie zwei Vertiefungen für jeden Gradienten Probe. </li><li> Bereiten Sie eine Reihe von Standards, indem zuerst eine 2000 &amp; mgr; U / ml Schmerz Stock in PBS. Machen elf (11) 2-fach serielle Verdünnungen von diesem Lager, und fügen Sie 50 ul jeder Verdünnung auf eine einzelne Vertiefung einer Mikrotiterplatte, so dass Standard # 1 = 2,000 &amp; mgr; U / ml, # 2 = 1000 &amp; mgr; U / ml, # 3 = 500 &amp; mgr; U / ml, usw. bis # 12 = 0,98 &amp; mgr; U / ml. Die zwölf AchE Standards wird somit zu besetzen eine einzige Reihe von einem 96-Loch-Testplatte. </li><li> Mit 200 ul Assay-Reagenz-Gemisch in jede Vertiefung und inkubiere 20 min (im Dunkeln) bei RT für die Entwicklung des gefärbten Reaktionsproduktes zu ermöglichen. Messen AChE-Aktivität bei einer Wellenlänge von 450 nm unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroplattenlesegerät. HINWEIS: Der Prozentsatz an beginnend nach exosome Reinigung verbleibende Material wird durch AchE Assay der fraktionierten Plasma bewertet. </li></ol></li><li> Immunblot-Analyse <ol><li> Separate Proteine ​​in Gradientenfraktionen 1-12 (von Procedure 2.1.3) durch SDS-PAGE auf 4-20% Tris-HCl Fertiggelen bei 100 V x 1 Std. Transferproteine ​​in dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung eines elektro Blotting Übertragungszelle nach den Anweisungen des Herstellers. Lassen Sie die Überweisungen für 12-16 h (O / N) bei 350V auslöschen. </li><li> Entfernen Sie die Membran von der Blotapparatur und waschen in Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) für 5 min. Block mit 5% fettfreier Milch in TTBS (TBS mit 0,1% Tween 20) für 1 h bei RT durch Schütteln. </li><li> Inkubieren der Membran mit für Exosomen (CD9, CD45, CD63) oder HIV-1-Capsid-Protein (p24) Primärantikörper in 5% fettfreier Milch unter Schütteln bei 4 ° C für 12-16 h (O / N). Verdünnungen Primärantikörper für Immunoblots von 1: 2,000 -1: 5000. </li><li> Waschen des Blots in TTBS für 20 Minuten, gefolgt von Inkubation mit einer 1: 2000-Verdünnung von Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem Anti-IgG (sekundärer Antikörper), in 5% fettfreier Milch für 1 h bei RT. 3 mal mit TTBS, 10 min pro Waschgang waschen Sie den Fleck. </li><li&gt; Inkubieren des Blots mit Luminolsubstratlösung Reagens nach den Anweisungen des Herstellers, um ein chemilumineszentes Signal zu erzeugen, aus der HRP-markierte Proteine ​​erkennt den chemilumineszierenden Signals unter Verwendung eines elektronischen Abbildungssystems mit CCD-Kamera. </li><li> Speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien, die in Adobe Photoshop angezeigt werden kann. Führen Densitometrie-Analyse von Bands mit ImageJ Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD). </li></ol></li><li> Zytokin-Assay <ol><li> Vor der Zytokin-Assay stören Immunkomplexe, die normalerweise im menschlichen Plasma vorhanden durch Säuredissoziation sind und lysieren die Exosomen von Detergens-Behandlung. Assay beide Ausgangsplasmaproben und gereinigt Exosom Zubereitungen. <ol><li> Zu 100 ul humanem Plasma mit 100 &amp; mgr; l 0,33 N HCl und bei 37 ° C für 1 Stunde. 100 l 0,33 N NaOH auf Säure behandelte Plasma neutralisieren. Hinzufügen Triton X-100, um sowohl das neutralisierte und gereinigte Plasma exosome Proben auf eine fiEndkonzentration von 1%, um die Lyse der Exosomen verursachen. </li></ol></li><li> Für diesen Assay (eine fluoreszierende Kügelchen-basierte Verfahren), Nutzung magnetische Kügelchen mit Antikörpern vom Hersteller vorbeschichtet. Verwenden Sie eine maßgeschneiderte Gruppe von Anti-Human-Zytokin-Antikörper-beschichteten Kügelchen; in Tabelle 1 aufgelistet. vortexen Antikörper-beschichteten magnetischen Perlen aus der Zytokin-Assay-Kit für 30 sec und 50 &amp; mgr; l Kügelchen zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte in dem Assay verwendet werden. </li><li> Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von Standards in der Plasma-Standardpuffer (beide in der Zytokin-Assay-Kit enthalten ist), wie in der Gebrauchsanleitung für die Zytokin-Assay-Kit beschrieben, um eine 8-Punkt-Standardkurve zu erzeugen. </li><li> Fügen Sie 150 ul 1X Waschpuffer (aus Kit) in jede Vertiefung und Waschen der Kügelchen mit einem magnetischen Kügelchen Scheibe, wie in der Anleitung beschrieben. In 25 ul Plasma-Assay-Puffer (aus Kit) in jede Vertiefung. Hinzufügen von 25 ul Standards und Proben für alle in dem Test verwendet Vertiefungen. Werden 25 ul PlasmaProbenpuffer, um Negativkontrollen. Siegel und schütteln Sie die Platte bei 700 Upm für 60 min bei RT inkubieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Fügen Sie 150 ul 1X Waschpuffer in jede Vertiefung und waschen Sie die Platte (wie in Schritt 3.3.4, oben). In 25 ul Nachweis-Antikörper in jede Vertiefung, Dichtung und schütteln Platte bei 700 Upm für 30 min bei RT. Wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> In 50 ul Streptavidin-Lösung (SAPE von kit) in jede Vertiefung, Dichtung und schütteln Platte bei 700 Upm für 30 min bei RT. Wiederholen Sie die Platte wäscht wie in 3.3.4. </li><li> Fügen Sie 120 ul der Lesepuffer (aus Kit) in jede Vertiefung und schütteln auf einem Labortischschüttler bei 700 Upm für 5 min bei RT, damit das Fluoreszenzsignal zu entwickeln. Lesen Platte auf dem Plattenlesegerät gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Um für den Betrag von Exosomen während des Isolierungsverfahrens verloren Konto, verwenden Sie die folgende Gleichung: [(Originallese / Plasmavolumen) x 66,6 = eingestellt Zytokin Lesung]. </li></ol></li></ol> 4. Assay zur Immunmodulatorische Potential <ol><li> Vorbereitung des Kulturmediums mit Exosom verarmten fötales Rinderserum <ol><li> Zentrifuge 500 ml fötales Rinderserum (FBS) bei 100.000 · g für 20 h bei 4 ° C pelletiert kontaminierenden Exosomen und Mikrovesikel. Entfernen Sie vorsichtig und speichern Sie die Exosom verarmten FBS Stand. Entsorgen Sie das Pellet in der biohazard Abfälle. </li><li> Mähdrescher 20% der Exosom abgereicherte FBS Überstand mit 500 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) Medium. Filtern das Medium durch einen 0,45 um-Membranfilter. </li><li> Hinzufügen Streptomycin (100 U / ml), Penicillin (100 U / ml), L-Glutamin (2 mM), HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (10 &amp; mgr; M) und IL-2 (20 U / ml) zu dem filtrierten Medium. </li></ol></li><li> Zellkultur und Exosom Exposure <ol><li> Aussetzen Exosomen Spender periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) von gesunden Freiwilligen erhalten Klinik. Suspend PBMC invorbereitet Kulturmedium und zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Zell / Partikelzähler (nach Standardverfahren des Herstellers). HINWEIS: Die PBMC werden in der oben beschriebenen Plasmapräparat erhalten (Schritt 1.2). </li><li> Verwendung von vorbereiteten Mediums aus Verfahren 4.1.3, Co-Kultur 3,0 x 10 6 (PBMC) mit 1 ug / ml des gepoolten Exosomen aus drei (3) HIV-1-seropositiven oder von drei (3) HIV-1-seronegativen Individuen in einer Gesamt Volumen von 1 ml in die Vertiefungen einer 12-Well-Kulturplatte (mit Deckel). Kulturen Inkubieren für 48 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Vorbereitung unbehandelten PBMC Kulturen und Kulturen, die mit Concanavalin A behandelt (Con A; 5 ug / ml), um als Negativ- und Positivkontrollen zu dienen, jeweils wie vorstehend beschrieben (4.2.2) beschrieben. Alle PBMC-Kulturen für 48 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Unmittelbar vor dem Ernten der Zellen Verdünnungen der folgenden Fluorochrom konjugierten monoklonalen Antikörpern: Alexa Fluor 700-markiertem anti-CD3 (1: 400 Verdünnung), allophycocyanin (APC) / Cyanin 7 (Cy7) -markiertem anti-CD4 (1: 400), Peridinin-Chlorophyll-Protein-Komplex-markierten anti-CD4 (1: 400), V450-markiertem anti-CD8 (1: 400), Biotin- markierten anti-CD45RA (1: 1.000), Phycoerythrin (PE) / Cy7-markierten Anti-CD62L (1: 1000), PE / Cyanin 5 (Cy5) -markierten anti-CD38 (1: 200), PE-Texas Red- markierte Anti-Streptavidin (1: 2.000) und PE / Cy5-markierten Maus IgG1k Isotypkontrolle (1: 200). </li><li> Nach 48 Stunden Inkubationszeit ernten die PBMC. Wasch PBMC in PBS auf Exosomen für 1 h mit einzelnen Fluorochrom-markierten Antikörper zu entfernen und färben die Zellen durch Inkubation bei 4 ° C. Analysieren die gefärbten PBMC mittels Durchflusszytometrie auf die Expression von Chemokinen zu quantifizieren (wie beschrieben 21). </li></ol></li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+Profiling+of+Exosomes+Derived+from+Blood+and+Culture+Media.">Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media.</a> J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).</li><li>Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+Precipitation+Method+to+Isolate+Urinary+Exosomes.">A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Chronische Immunaktivierung (CIA) und CD4 + T-Zell-Depletion sind zwei wichtige Merkmale von HIV-1-Infektion. Sie wurden als Prädiktoren für die Pathogenese etabliert, mit der CIA, der beste Prädiktor. Doch die zugrunde liegenden Mechanismen der Fahrt chronische systemische Immunaktivierung und CD4 + T-Zell-Rückgang immer noch nicht vollständig geklärt. Wir und andere Labors haben schlüssige Beweise entwickelt, dass Exosomen von HIV-1 infizierten Zellen sezerniert spielen eine Rolle in beiden Markenzeichen. <...

Die HIV-1-Epidemie weiterhin einen erheblichen Einfluss in der ganzen Welt haben. Ab 2013 wurden etwa 35 Millionen Menschen weltweit mit HIV leben und 2,1 Millionen von ihnen waren neu infizierten Personen 1. Präventionsstrategien und den Zugang zu antiretroviralen Therapie waren hilfreich bei der Verringerung der Gesamtübernahme von HIV. Allerdings sind einzelne Bevölkerungsgruppen weiterhin auftritt steigt in den Erwerb von HIV 1. Somit gibt es eine fortlaufende Bemühungen, diese Epidemie. Einer der stärksten Prädiktoren HIV Fortschreiten der Krankheit ist eine chronische Immunaktivierung (CIA) 2-10. Durch anhaltend hohe nachweisbare Zytokine und erhöhte Expression Marker auf der Oberfläche von T-Lymphozyten definiert, CIA, um zurückzuführen: i) kontinuierliche dendritischen Zell Produktion von Typ-I-IFN 11; (ii) direkte Immunaktivierung durch HIV-Proteine ​​Tat, Nef und gp120 12 angetrieben wird; (iii) Translokation von bakteriellen Proteinen in darmassoziierten Immunzellen 6. Der genaue Mechanismus (en) zugrunde liegende chronische, systemische Immunaktivierung bei HIV-Infektion bleibt jedoch vollständig aufgeklärt werden. Unsere Arbeitsgruppe und andere haben eine Rolle von Exosomen in HIV Pathogenese 15-18 demonstriert. Unsere Arbeitsgruppe hat festgestellt, dass das Nef-Protein wird aus infizierten Zellen in Exosomen 15 ausgeschieden und exosomalen Nef (exNef) im Plasma von HIV-infizierten Personen in Nanogramm Stufen 18 vorhanden ist. Wir haben gezeigt, dass Bystander-CD4 + T-Zellen, um exNef ausgesetzt Folge aktivierungsinduzierten Zelltod abhängig von dem CXCR4-Weg 19, 20 gezeigt ist. Alternativ wurden die Monozyten / Makrophagen refraktär exNef induzierte Apoptose, aber zeigte veränderte zelluläre Funktionen und die Zytokinexpression. Aus dem Plasma von HIV-infizierten Personen isoliert jüngster Zeit hat unsere Gruppe gezeigt Exosomen enthalten eine Vielzahl von pro-inflammatorischen Zytokinen. Fuitere naive periphere mononukleäre Blutzellen von Plasma abgeleiteten Exosomen aus HIV-infizierten Patienten induzierte Expression von CD38 auf naiven und Zentralspeicher CD4 + und CD8 + T-Zellen ausgesetzt werden. Dies trägt wahrscheinlich systemische Entzündungen und Virusvermehrung durch Bystander-Zellaktivierung 21, und schlägt vor, Exosomen spielen eine bedeutende Rolle bei der HIV-Pathogenese. Bei der Untersuchung der Rolle von Exosomen bei HIV-Pathogenese, ist eine Herausforderung, der Entwicklung von Techniken zur effizienten separaten Exosomen von HIV-Partikel unter Beibehaltung der exosomalen Inhalten sowie deren funktionale immunmodulatorische Fähigkeit. Es wurden mehrere Verfahren zum Isolieren von Exosomen aus Zellkultur und biologischen Flüssigkeiten 22,23 beschrieben. Aufgrund ihrer geringen Größe und Dichte (Exosomen schweben in einer Dichte von 1,15 bis 1,19 g / ml), Differenz Ultrazentrifugation und / oder Ultrafiltration sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum exosome Isolation 23.HIV-infizierten Zellkulturüberständen und Patientenplasma enthalten jedoch beide Exosomen und HIV-1-Viruspartikel. Exosomen und HIV-1-Partikel sind in Größe und Dichte sehr ähnlich. Alternativ, unter Ausnutzung der Expression der eindeutige exosomalen Marker wie CD63, CD45 und CD81, Exosomen isoliert wurden mit Immunaffinitäts-Abscheideverfahren 23. Dieses Verfahren kann Virus von Exosomen trennen. Ist der Nachteil dieser Technik jedoch die dichte Befestigung von Antikörpern gegen die gereinigte Exosomen, die mit der Beurteilung der immunmodulatorischen Potenzial der Exosomen in Kultur stören könnten. Um diese Einschränkungen zu begegnen, ein Verfahren zur Reinigung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma von Cantin modifiziert und Mitarbeiter 22 unter Verwendung Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten entwickelten wir. Exosomen wurden gefunden, um in der von geringer Dichte zu trennen / oberen Fraktionen von Iodixanol Gradienten, während Viruspartikel im Hoch- getrenntDichte / Unterfraktionen. Viruspartikel wurden durch p24 ELISA identifiziert und wurden unter Verwendung von Exosomen exosome Marker AChE, CD9, CD63 und CD45 identifiziert. Die oberen niedriger Dichte Fraktionen gesammelt enthaltenen Exosomen, die negativ für HIV-1 p24-Kontaminierung waren. Die effiziente Reinigung und Trennung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma ermöglicht eine genaue Prüfung des Inhalts der Exosomen aus Humanplasma, sowie die Untersuchung ihrer immunmodulatorischen Potential und der diagnostischen und prognostischen Wert der Exosomen in HIV-1 Pathogenese abgeleitet.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>368589</td><td>pink top tubes</td></tr><tr><td>Lymphoprep Ficoll reagent</td><td>Cosmo Bio</td><td>AXS-1114545</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep iodixanol reagent</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>14ml ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td>ultraclear tubes</td></tr><tr><td>Gradient Former Model 485</td><td>BIO-RAD</td><td>165-4120</td><td></td></tr><tr><td>Acetylthiocholine iodide</td><td>Sigma</td><td>1480</td><td></td></tr><tr><td>Benzoic Acid</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl Cholinesterase</td><td>Sigma</td><td>C3389</td><td></td></tr><tr><td>96-well clear microtiter plate</td><td>Medical Supply Partners</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190 microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td>190</td><td>Fluorescent plate reader</td></tr><tr><td>Criterion Gel Electrophoresis Cell</td><td>BIO-RAD</td><td>165-6001</td><td></td></tr><tr><td>Transblot Gel&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3910</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Cell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Criterion precast gels</td><td>BIO-RAD</td><td>567-1093</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>Ab10558</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Antibody (H-193)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-15363</td><td></td></tr><tr><td>CD9 Antibody (H-110)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-9148</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAb p24 HIV-1&amp;nbsp;</td><td>ImmunoDX, LLC</td><td>1303</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>G1472430</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline</td><td>BIO-RAD</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>Goat-Anti-Rabbit</td></tr><tr><td>HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>31430</td><td>Goat-Anti-Mouse</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagent</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>GE LAS-4010 Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>LAS-4010</td><td></td></tr><tr><td>Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit</td><td>Affymetrix&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Custom immunoassay panel</td></tr><tr><td>Bio-Plex 200 Immunobead Reader</td><td>BIO-RAD</td><td>171-000201</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Z2 Particle Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>383552</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3</td><td>BD Bioscience (UCHT1)</td><td>300424</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled anti-CD4</td><td>Biolegend (OKT4)</td><td>317418</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-labeled anti-CD4</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>550631</td><td></td></tr><tr><td>V450-labeled anti-CD8</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>560347</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-labeled anti-CD45RA</td><td>BD Bioscience (HI100)</td><td>555487</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-labeled anti-CD62L</td><td>Biolegend (DREG-56)</td><td>304822</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5-labeled anti-CD38</td><td>Biolegend (HIT2)</td><td>303508</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled anti-HLADR</td><td>Biolegend (L243)</td><td>307618</td><td></td></tr><tr><td>PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin</td><td>BD Bioscience</td><td>551487</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5-labeled mouse IgG1K</td><td>Biolegend (MOPC-21)</td><td>400116</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK</td><td>Biolegend (MOPC-173)</td><td>400229</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of exosomes from the plasma of hiv-1 positive individuals

Exosomen sind kleine Vesikel mit einer Größe von 30 nm bis 100 nm, das sowohl konstitutiv und nach Stimulation aus einer Vielzahl von Zelltypen freigesetzt werden. Sie sind in einer Reihe von biologischen Flüssigkeiten gefunden und sind dafür bekannt, eine Vielzahl von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuremoleküle tragen. Anfangs angenommen, dass etwas mehr als Reservoire für Zelltrümmer werden die Rollen der Exosomen Regel biologischen Prozessen und bei Erkrankungen mehr geschätzt. Es wurden mehrere Verfahren zum Isolieren von Exosomen aus Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten beschrieben. Aufgrund ihrer geringen Größe und Dichte, Differenz Ultrazentrifugation und / oder Ultrafiltration sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum exosome Isolation. Ein Plasma aus HIV-1-infizierten Individuen enthalten jedoch beide Exosomen und HIV-Viruspartikel, die eine ähnliche Größe und Dichte. Somit effiziente Trennung der Exosomen aus HIV-Viruspartikeln in menschlichem Plasma wurdeeine Herausforderung. Um diese Einschränkung zu beheben, eine Prozedur aus Cantin et modifizierten entwickelten wir. al., 2008, für die Reinigung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma. Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten wurden verwendet, um Exosomen aus HIV-1-Partikeln in dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen zu trennen. Viruspartikel wurden durch p24 ELISA identifiziert. Exosomen wurden auf der Basis von Exosom Marker Acetylcholinesterase (AChE) und das CD9, CD63 und CD45-Antigene identifiziert. Unsere Gradienten Verfahren ergab Exosom Präparate frei von Viruspartikeln. Die effiziente Reinigung von Exosomen aus menschlichem Plasma ermöglichte es uns, den Gehalt an Plasma abgeleiteten Exosomen untersucht und ihre immunmodulatorische Potential und andere biologische Funktionen zu untersuchen.

Exosomen sind effizient von HIV-1-positive Humanplasma gereinigt. Isolated Exosomen von Acetylcholinesterase (AChE) Aktivität identifiziert, getrennt in geringerer Dichte Fraktionen 1-3 an der Spitze der Iodixanol Gradienten, während Viruspartikel, die von HIV-1-Antigen p24 identifiziert , getrennt in den höheren Dichte Fraktionen (10-12, in der Nähe der Unterseite). Die Anwesenheit von Exosomen wurde durch Immunoblot Identifizierung exosome Marker AChE, CD9, CD45 un...

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Isolierung von Exosomen aus dem Plasma HIV-1-positiver Personen | Immunologie und Infektion | Video

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

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17.2K Aufrufe.  Morehouse School of Medicine. Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Serie: Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Forschung

Biochemie

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

SILAC Based Proteomic Charakterisierung von Exosomen aus HIV-1-infizierten Zellen

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Immunologie und Infektion

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Medizin

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Biologie

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

MicroRNAs play an important regulatory role and are emerging as novel therapeutic targets for various human diseases. It has been shown that miRNAs are carried in high density lipoproteins. We have developed a simplified method to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from human plasma.

Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

Isolation and Characterization of Human Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles using Filtration and Ultracentrifugation

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can modulate the cellular status of other cells locally in tissue microenvironments or through liberation into peripheral blood. Adipocyte-derived EVs are elevated in the peripheral blood and show alterations in their cargo (RNA and protein) during metabolic disturbances, including obesity and diabetes. Adipocyte-derived EVs can regulate the cellular status of neighboring vascular cells, such as endothelial cells and adipose tissue resident macrophages to promote adipose tissue inflammation. Investigating alterations in adipocyte-derived EVs in vivo is complex because EVs derived from peripheral blood are highly heterogenous and contain EVs from other sources, namely platelets, endothelial cells, erythrocytes and muscle. Therefore, the culture of human adipocytes provides a model system for the study of adipocyte derived EVs. Here, we provide a detailed protocol for the extraction of total small EVs from cell culture media of human gluteal and abdominal adipocytes using filtration and ultracentrifugation. We further demonstrate the use of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) for quantification of EV size and concentration and show the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101) in the gluteal and abdominal adipocyte derived-EVs. Isolated EVs from this protocol can be used for downstream analysis, including transmission electron microscopy, proteomics, metabolomics, small RNA-sequencing,&#160;microarrays and can be&#160;utilized in functional in vitro/in vivo studies.

We describe the isolation of human adipocyte-derived extracellular vesicles (EVs) from gluteal and abdominal adipose tissue using filtration and ultracentrifugation. We characterize the isolated adipocyte-derived EVs by determining their size and concentration by Nanoparticle Tracking Analysis and by western blotting for the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101).

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can ...

<meta charset="utf8"></head><body>Kardiovaskuläre Biomarker-Studien mit extrazellulären Plasma-Vesikel-Proteomen

Isolation, Characterization, and Proteomic Analysis of Plasma-Derived Extracellular Vesicles for Cardiovascular Biomarker Discovery

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research due to their role in regulating intercellular communication, potentially serving as valuable biomarkers for cardiovascular disease. However, the EV proteome and its potential as a biomarker in cardiovascular diagnostics remain poorly understood. This protocol presents a standardized method for the isolation and quantification of plasma-derived EV and the analysis of their protein cargo using plasma samples from patients presenting to the Chest Pain Unit of a large university hospital. Following routine phlebotomy, EV are isolated from plasma by differential ultracentrifugation. The enrichment of specific EV marker proteins in EV isolates is visualized by immunoblotting, and average size distribution and plasma EV concentrations are quantified by nanoparticle tracking analysis. Finally, ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry is employed for label-free analysis of the EV proteome. This protocol thus provides a comprehensive approach to study and use plasma-derived EV as potential carriers of critical biological information as well as to explore their potential as novel biomarkers.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Analyse des extrazellulären Vesikelproteoms im Plasma für kardiovaskuläre Biomarker-Studien

This article describes a methodology for the isolation, characterization, and quantification of human plasma-derived extracellular vesicles (EV) and presents a workflow for label-free analysis of the EV proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

Isolierung, Charakterisierung und proteomische Analyse von aus Plasma gewonnenen extrazellulären Vesikeln zur Entdeckung kardiovaskulärer Biomarker

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research ...