We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.

Exosome izolasyon ve saflaştırma prosedürü genel bir diyagram Şekil 1&#39;de verilmiştir. Tüm kan sağlıklı gönüllü donörlerden ve Emory Üniversitesi&#39;nden Umut Kliniği ve Grady Sağlık Sistemi Bulaşıcı Hastalık Programı katılıyor antiretroviral theraoy almayan HIV pozitif bireylerin elde edilmiştir Atlanta, Georgia. Bu çalışma Emory Üniversitesi Tıp Morehouse Okulu kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanmıştır. Çalışmaya katılan tüm kişilerin yazılı ve bilgilendirilmiş onam formu. Kan Plazma eksozomlann hazırlanması 1. <ol><li> İnsan Kan Toplama ve İşleme <ol><li> (18 mg potasyum EDTA ihtiva eden) EDTA kan toplama tüpleri içinde damar delme ile periferal kanın 10 ml toplamak ve hafifçe karıştırın beş kez ters çevirin. </li><li> Kan hücreleri topaklamak üzere oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de, kan toplama tüpleri santrifüjleyin. Steril pipeti kullanınte 25 ml&#39;lik konik tüp plazma kısmını (4-5 ml) aktarmak için. 1 x 10 ml PBS ile plazma seyreltin. Biohazard atıklar için uygun işaretli kapta (aynı zamanda PBMC&#39;de olarak bilinen kırmızı kan hücreleri, beyaz hücreler) kan hücrelerini atın. Not: enfekte edilmemiş verici kan örnekleri durumunda, PBMC, daha fazla kullanım (aşağıdaki prosedür IV.2 bakınız) için ayrılmış olabilir. </li><li> Kısa vadede (2-3 gün) veya daha uzun süreli saklama için -80 o C&#39;de 4 o C&#39;de plazma örnekleri saklayın. NOT: Daha fazla işlemeden önce 4 o C herhangi donmuş plazma örnekleri getirin. </li></ol></li><li> Plazma Exosome Kesir hazırlanması <ol><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin plazma hücre tortularım çıkartmak için. Temiz bir 25 ml&#39;lik ultrasantrifüjdeki tüp temizlenir plazma süpernatant aktarmak için steril bir serolojik pipet kullanın. Biohazard konteyner pelet atın. </li><li> 2 100,000 xg&#39;de temizlenir plazma santrifüj4 ° C&#39;de saat büyük kesecikler kaldırın. Pipetle dikkatli 100.000 xg Süpernatantı ve biyolojik tehlike atıklar atın. Temiz bir tüp içinde 1X PBS 1 ml 100,000 x g pelet yeniden süspanse edin ve yavaşça çıkarmak ve ayrı partiküller dönen, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> PBS 25 ml ilave etmek suretiyle süspansiyon haline 100,000 x g eksozom / virüs pelet yıkayın. Yavaşça, sonra karışımı 4 ° C &#39;de 2 saat boyunca 100,000 x g hızında tekrar santrifüj tüpü, beş kez ters çevirin. Biyolojik tehlikeli atık kabı PBS yıkama solüsyonu atın. </li><li> 1 x PBS, 1 ml 100,000 x g pelet yeniden süspanse edin ve yerinden ve pelet çözmek için hafifçe dönen 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. NOT: iyodiksanol gradyan aşamasına kadar 1-2 gün süreyle 4 ° C &#39;de, eksozomlar ve virüs parçacıkları içeren, iyodiksanol gradyan doğrudan ilgili adıma pelet saklamak mümkün değilse. </li></ol></li></ol> Eksozom 2. saflaştırılması <ol><li> % 6 -18% veloc üretBir iki odacıklı degrade eski cihazı kullanılarak iyodiksanol bir Sığ gradiyentleri. <ol><li> PBS içinde seyreltilerek, su içinde% 60 çözelti olarak temin iyodiksanol reaktifi% 6 ve% 18 çözümleri hazırlayın. Pipet 5,5 karıştırıldı odasına 18% çözelti ml ve pipet depolama haznesine% 6 çözeltisi 5.5 mi. , Karıştırıcı açın musluğunu açık ve her gradyan, 14 ml ultra santrifüj tüpüne akmasına izin verir. NOT: hemen kullanın veya kullanmadan önce 4 ° C&#39;de hazırlanan degradeler O / N saklamak ya. </li><li> Dikkatle her 11 ml degrade üst kısmına eksozom / virüs çözümü 1 ml katman. Bir SW40Ti sallanan bir kova rotor kullanılarak 4 ° C &#39;de 2 saat için 250,000 x g&#39;de santrifüjleyin gradyanlar. </li><li> On iki (12), 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin. Degrade üstünden 1.0 ml çıkarın ve tüp 1. transfer. Sırayla tüpleri 2-12 kalan 1ml kesirler aktarın. NOT: En üstteki kısım böylece 1. alt kısmı, 12. olacaktır. St4 ° C &#39;de gradyan fraksiyonları yardımcı olmaktadır. 4 ° C&#39;de depolanan gradyan üstündeki fraksiyonları 1-3 olmalıdır saflaştırılmış eksozomlar, 3-4 hafta boyunca stabildir. </li></ol></li></ol> 3. Exosome Karakterizasyonu <ol><li> Asetilkolinesteraz (AChE) Aktivite Deneyi <ol><li> 1X PBS, 1 ml asetiltiyoklolin iyodür 28,9 mg karıştırılarak 100 mM substrat stok hazırlayın. 1 ay -20 ° C de saklayınız substrat stoku. </li><li> 1X PBS, 10 ml benzoik asit 39.6mg ve sodyum bikarbonat 15 mg karıştırılarak 10 mM renk göstergesi stok hazırlayın. Iki hafta 4 ° C&#39;de saklayın renk göstergesi hisse senedi. </li><li> (Örneğin, 10 mi 1X PBS + 200 ul substrat + 500 ul renk indikatörü) 5: 2: 100 bir oranda karıştırma 1X PBS, alt-tabaka ve renk göstergesi ile analiz reaktifi hazırlayın. </li><li> Bir 96-yuvalı microtite kuyularına Transferi (III.3 prosedürü ile ilgili, 1-12 etiketli), her 1.5 ml gradyan fraksiyon tüpten 50 ulr plakası. Her degrade numune için yinelenen kuyu hazırlayın. </li><li> İlk PBS içinde 2000 μU / ml AChE stok yaparak bir dizi standardı hazırlayın. Yap on (11) 2-kat, bu stoklar seri dilüsyonları ve bir mikrotiter plakasının bir tek oyuğuna her seyreltme 50 ul, böylece standart # 1 = 2000 μU / ml, # 2 = 1.000 μU / ml, # 3 = 500 μU / ml, vb # 12 = 0.98 μU / ml kadar. On iki AChE standartları, böylece, 96 oyuklu bir deney plakasının bir tek sıra kaplayacaktır. </li><li> Her bir deney reaktif karışımı 200 ul de ekleyin ve renkli reaksiyon ürününün gelişimi sağlamak için oda sıcaklığında (karanlıkta) 20 dakika inkübe edilir. Bir flüoresan mikro levha okuyucusu kullanarak 450 nm&#39;lik bir dalga boyunda AChE aktivitesi ölçülür. Not: eksozom saflaştırmadan sonra, başlangıç ​​materyali kaldığını yüzdesi bölünmemiş plazma AChE testi ile değerlendirilir. </li></ol></li><li> İmmünoblot Analizi <ol><li> Proced gradyan fraksiyonları 1-12 Ayrı proteinler (100V x 1 saat sonra% 4-20 Tris-HCI prefabrik jel üzerinde SDS-PAGE ile ure 2.1.3). Üreticinin talimatlarına göre bir elektro-lekeleme aktarım hücresi kullanılarak bir nitroselüloz zara jelde proteinleri aktarın. Transferler 350V de 12-16 saat (O / N) için leke izin verin. </li><li> Lekeleme aparatı membranı çıkarın ve 5 dakika boyunca Tris tamponlu tuz (TBS) içinde yıkayın. Oda sıcaklığında çalkalanarak 1 saat boyunca (% 0,1 Tween 20 ile TBS) TTBS içinde% 5 yağsız süt ile bloke edin. </li><li> 12-16 saat (O / N), 4 ° C de çalkalanarak% 5 yağsız süt içinde eksozomlann (CD9, CD45, CD63) veya HIV-1 kapsid proteini (p24) için spesifik primer antikorlar ile membran inkübe edin. Imüno için birincil antikor seyreltileri olarak 1: 2000 -1: 5000. </li><li> 1 ile enkübasyonu takiben, 20 dakika boyunca TTBS içinde blot yıkayın: yaban turpu peroksidazı (HRP) ve 2000 seyreltme, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 yağsız süt içinde, anti-IgG (sekonder antikor) ile konjüge edilmiş. Leke TTBS ile 3 kez, yıkama başına 10 dk yıkayınız. </li><li&gt; HRP etiketli proteinler CCD kamera ile bir elektronik görüntüleme sistemi kullanılarak kemilüminesan sinyal Algılama bir kimyasal olarak ışık veren bir sinyal üretmek için, üreticinin talimatlarına uygun olarak luminol alt-tabaka bir reaktif ile leke inkübe edin. </li><li> Adobe Photoshop izlenebilir TIFF dosyaları olarak görüntüleri kaydedin. ImageJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) kullanarak bantların dansitometri analizi yapın. </li></ol></li><li> Sitokin Deneyi <ol><li> Sitokin deneyi öncesinde, asit ayrışma tarafından, insan plazmasının içinde mevcuttur, deterjan muamelesi ile eksozomlar lize immün kompleksleri bozabilir. Tahlil hem başlangıç ​​plazma örnekleri ve arıtılmış eksozom hazırlıkları. <ol><li> Insan plazması, 100 ul için 100 ul 0,33 N HCL ilave edin ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Asit ile muamele edilmiş plazma nötralize etmek için 100 ul 0,33 N NaOH ekleyin. Bir fi, Triton X-100 nötralize plazma ve saflaştırılmış eksozom her iki numunenin ekleme% 1 nal konsantrasyonu eksozomlann lizizine neden olmak için. </li></ol></li><li> Bu deneyde (floresan bir boncuk esaslı prosedür) için, manyetik boncuk üretici tarafından antikorlar ile önceden kaplanmış kullanır. Anti-insan sitokin antikor kaplı boncuk özel tasarlanmış panelini kullanın; Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. 30 sn için sitokin deney kiti, antikor kaplı manyetik boncuklar Vortex ve deneyde kullanılmak üzere 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 ul boncuk ekleyin. </li><li> 8 noktalı bir standart eğri oluşturmak için, sitokin deneyi kiti için kullanım kılavuzunda tarif edildiği gibi plazma, standart tampon (sitokin deneyi kitin içerdiği her ikisi) standartların bir seyreltme serisi hazırlanır. </li><li> El kitabında açıklandığı gibi, her bir kuyucuğa (kit) 1X yıkama tamponu 150 ul eklenir ve manyetik boncuk yıkayıcı kullanılarak boncuk yıkayın. Her bir kuyunun (kit) 25 ul plazma tahlil tamponu ekleyin. Deneyde kullanılan tüm oyuklara standartlar ve numuneler 25 ul ekle. Plazma 25 ul eklenegatif kontrol oyuklarına örnek tamponu kaplandı. Kapatın ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 700 rpm&#39;de sallamak plaka ve 4 ° C &#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Her bir oyuğa 1X yıkama tamponu 150 ul ilave edin ve (yukarıdaki aşama 3.3.4 gibi) plakayı yıkayın. Her bir oyuğa, conta içine tespit antikorlarının 25 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 700 rpm&#39;de plaka sallayın. Yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> Her bir oyuğa, conta içine (kit SAPE) streptavidin çözeltisi 50 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 700 rpm&#39;de plaka sallayın. 3.3.4 gibi tekrarlayın plaka yıkar. </li><li> Flüoresan sinyal geliştirmesine imkan vermek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 700 rpm&#39;de bir masa laboratuar karıştırıcısı üzerinde her birine (kit) okuma tamponu 120 ul de ekleyin ve sallayın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir levha okuyucu üzerinde plaka okuyun. </li><li> Izolasyon prosedürü sırasında kaybedilen eksozom miktarı için hesap şu denklemi kullanmak için: [(orijinal okuma / plazma hacmi) 66.6 = düzeltilmiş sitokin okuma x]. </li></ol></li></ol> İmmünomodülatuar Potansiyeli 4. Testi <ol><li> Eksozom-tükenmiş Fetal Sığır Serumu, kültür ortamının hazırlanması <ol><li> Santrifüj 4 ° C &#39;de 20 saat süre ile 100,000 x g&#39;de fetal sığır serumu (FBS), 500 mi eksozomlar ve microvesicles kirletici: pelet. Dikkatle çıkarın ve eksozom tükenmiş FBS süpernatant kaydedin. Biohazard atık pelet atın. </li><li> Roswell Park Memorial Institute 1640 500 ml (1640 RPMI) ortam ile eksozom tükenmiş FBS süpernatant% 20 birleştirin. 0.45 um&#39;lik bir membran filtresinden orta filtre. </li><li> Süzüldü ortama streptomisin (100 U / ml), penisilin (100 U / ml), L-glutamin (2 mM), HEPES-tamponlu tuzlu su çözeltisi (10 uM) ve IL-2 (20 U / ml) eklenir. </li></ol></li><li> Hücre Kültürü ve Exosome Pozlama <ol><li> Sağlıklı gönüllülerden elde klinik donor periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için eksozomlar Açığa. PBMC&#39;nin Askıyakültür ortamı hazırlanır ve (imalatçının standart bir yönteme göre) hücre / partikül sayacı kullanarak hücreleri sayın. Not: PBMC (1.2 adım a), yukarıda tarif edilen plazma hazırlanması sırasında elde edilir. </li><li> Prosedür 4.1.3 den hazırlanan ortam maddesi kullanılarak, ko-kültür 3,0 x 10 6 toplanan eksozom 1 ug / ml (hücre) üç (3), HIV-1 seropozitif ya da üç (3), HIV-1 seronegatif kişilerin bir toplam (kapak ile) 12-yuvalı kültür plakasının yuvaları içinde 1 ml hacmi. 37 ° C &#39;de 48 saat süre ile kültür inkübe edin. </li><li> Konkanavalin A ile muamele edilmiş tedavi edilmemiş PBMC kültürleri ve kültürleri hazırlanması (Con A; 5 ug / ml) (4.2.2), yukarıda tarif edildiği gibi, sırasıyla, negatif ve pozitif kontrol hizmet vermektedir. 37 ° C &#39;de 48 saat boyunca, tüm PBMC kültürleri inkübe edin. </li><li> Alexa Fluor 700-etiketli anti-CD3 (1: 400 seyreltme), allophycocy hemen önce hücrelerin hasat için aşağıdakileri florokrom-eşlenik monoklonal antikorlar dilüsyonları hazırlamak(1: 400), V450-etiketli anti-CD8, Biotin: klorofil protein kompleksi,-etiketli anti-CD4 (400 1) peridinin: anin (APC) / siyanin 7 (Cy7), anti-CD4 (400 1) -etiketli anti-CD45RA (1: 1000) etiketli, fikoeritrin (PE) / anti-CD62L (1: 1000), Cy7-etiketli, PE-Texas Kırmızı-, PE / siyanin 5 (Cy5), anti-CD38 (200 1) -etiketli etiketli anti-streptavidin (1: 2000) ve PE / Cy5 etiketli fare IgG1K izotip kontrol (1: 200). </li><li> 48 saatlik bir bekletme süresinden sonra, PBMC hasat edilir. PBS yıkama PBMC bağımsız florokrom etiketli antikorlar ile 4 ° C&#39;de 1 saat süreyle inkübe edilerek hücreler eksozomlar çıkarın ve leke. (21 tarif edildiği gibi) kemokin ifadesinin miktarını belirlemek için akış sitometrisi ile boyanmış PBMC analiz edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10, 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24, 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++T+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J Virol. 79, 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J Immunol. 180, 350-360 (2008).</li><li>O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+HIV+infection.">Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection.</a> Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).</li><li>Chihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+preferentially+activate+anti-inflammatory+M2-type+macrophages.">HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages.</a> J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.">Vesicle formation during reticulocyte maturation.</a> J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).</li><li>Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Nef+protein+is+secreted+into+vesicles+that+can+fuse+with+target+cells+and+virions.">HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions.</a> Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).</li><li>Muratori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+Secretion+by+T+Cells+Is+Caused+by+HIV+Nef+in+Infected+Cells+and+by+Nef+Transfer+to+Bystander+Cells.">Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells.</a> Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).</li><li>Lenassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Nef+is+Secreted+in+Exosomes+and+Triggers+Apoptosis+in+Bystander+CD4+T+Cells.">HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells.</a> Traffic. 11, 110-122 (2009).</li><li>Raymond, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).</li><li>Konadu, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+cytokines+with+exosomes+in+the+plasma+of+HIV-1-seropositive+individuals.">Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals.</a> Journal of Infectious Diseases. , (2014).</li><li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1:+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants.">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes.">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).</li><li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+Profiling+of+Exosomes+Derived+from+Blood+and+Culture+Media.">Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media.</a> J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).</li><li>Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+Precipitation+Method+to+Isolate+Urinary+Exosomes.">A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Kronik immün aktivasyon (CIA) ve CD4 + T hücresi kaybı, HIV-1 enfeksiyonunun iki önemli özellikleridir. Onlar CIA iyi belirleyicisi olmak, patogenezi için belirleyicileri olarak kurulmuştur. Ancak, kronik sistemik immün aktivasyon ve CD4 + T hücre düşüş sürüş altında yatan mekanizmaları hala tam olarak ortaya konamamıştır. Bu ve diğer laboratuar HIV-1 ile enfekte hücrelerden salgılanan eksozomlar iki özelliklerinden önemli bir rol oynadığını sağlam kanıtlar geliştirdik. <p class="jov...

HIV-1 salgını dünya çapında önemli bir etkiye sahip devam ediyor. 2013 yılı itibariyle, dünya genelinde yaklaşık 35 milyon kişi HIV ile yaşadığı ve bunlardan 2,1 milyon yeni enfekte bireyler 1 idi. Önleme stratejileri ve antiretroviral tedaviye artan erişim HIV genel edinimini azaltmada yararlı olmuştur. Ancak, bireysel popülasyonları halen HIV 1 edinimi yükselir yaşıyoruz. Bu nedenle, bu salgının ele almaya devam çabaları için bir ihtiyaç vardır. HIV hastalığın ilerlemesi güçlü belirleyicileri biri kronik immün aktivasyon (CIA) 2-10 olduğunu. Saptanabilir sitokinler ve T lenfositlerinin yüzeyinde yükseltilmiş ifade belirteçleri sürekli olarak yüksek seviyelerde tarafından tanımlanan, CIA sanılıyor: Ben 11 IFN Tip i) sürekli dendritik hücre üretimi; HIV proteinleri Tat, Nef ve gp120 12 tarafından tahrik edilen, (ii) direkt immün aktivasyon; (iiiGut ilişkili bağışıklık hücreleri 6 bakteriyel proteinlerin) translokasyonu. Ancak, tam mekanizması (ler) altında yatan kronik HIV enfeksiyonu sistemik bağışıklık aktivasyon tam olarak aydınlatılamamıştır beklemektedir. Araştırma grubumuz ve diğerleri HIV patogenezinde 15-18 yılında eksozomlann rol göstermiştir. Bizim grup Nef proteini eksozom 15, enfekte hücrelerden salgılanan olduğunu belirlemiştir ve exosomal Nef (exNef) nanogram seviyeleri 18 HIV bulaşmış kişilerin plazmasında mevcut bulunmaktadır. Bu alternatif olarak, monosit / makrofajlar exNef kaynaklı apoptosise karşı kolay işlenemezdir. ExNef maruz CD4 + T-hücreleri, CXCR4 yolunun 19, 20 bağlıdır aktivasyonu ile indüklenen hücre ölümü sonuçlandı oradan geçmekte göstermiştir, fakat değiştirilmiş hücresel fonksiyonları ve sitokin ekspresyonunu sergilemişlerdir. HIV ile infekte olmuş bireylerin plazmasındaki izole Son zamanlarda, bir grup göstermiştir eksozomlar pro-enflamatuar sitokinlerin çeşitli içerir. Further, saf ve merkezi bellek CD4 + ve CD8 + T hücreleri üzerinde CD38 ekspresyonunu indüklediği HIV bulaşmış hastalarda plazma türevi eksozom maruz saf periferal kan tek-çekirdekli hücreleri. Bu büyük olasılıkla sistemik inflamasyon ve seyirci hücre aktivasyonu 21 üzerinden viral yayılma katkıda bulunur ve eksozomlar HIV patogenezinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir. HIV patogenezinde eksozomlann rolünü araştıran, bir meydan HIV parçacıklar verimli ayrı eksozomlar exosomal içeriği korurken yanı sıra işlevsel immün modülatör yeteneği teknikleri geliştiriyor. Çeşitli yöntemler, hücre kültürü ve biyolojik sıvılarda 22,23 den eksozomlar izole etmek için tarif edilmiştir. Çünkü küçük boyutları ve düşük yoğunluklu (eksozomlar 1.15 yoğunluğunda yüzer - 1.19 g / ml), ayırıcı ultrasantrifüjleme ve / veya ultrafiltrasyon eksozom izolasyonu 23 için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir.Bununla birlikte, HIV ile infekte olmuş hücre kültürü süpernatanları, hastaların plazma eksozomlar ve HİV-1 virüs partiküllerini içerir. Eksozomlar ve HİV-1 parçacıkların boyutu ve yoğunluğu açısından oldukça benzerdir. Seçenek olarak ise, örneğin CD63, CD45 ve CD81 gibi benzersiz exosomal markerlerin ekspresyonu yararlanarak, eksozomlar immünoafinite yakalama yöntemleri 23 kullanılarak izole edilmiştir. Bu prosedür eksozom virüsü ayırabilirsiniz. Bununla birlikte, bu tekniğin dezavantajı, kültür eksozomlann bağışıklık potansiyelinin değerlendirilmesi ile etkileşime girebilir saflaştırılmış eksozom, antikorların sıkı ektir. Bu sınırlamaları için, iyodiksanol gradyanları kullanılarak hızı HIV Cantin modifiye insan plazması içinde parçacıklar ve arkadaşları 22 eksozomlann saflaştırılması için bir yöntem geliştirdi. Virüs parçacıkları yüksek- içinde ayrılmış oysa eksozomlar, düşük yoğunluk iyodiksanol geçişlerini / üst fraksiyonları ayırmak bulunduyoğunluk / düşük kesirler. Virüs partikülleri p24 ELISA ile belirlenmiştir ve eksozomlar eksozom işaretleri AChE, CD9, CD63, ve CD45 ile tespit edilmiştir. Toplanan üst düşük yoğunluklu parçacıkları HİV-1 p24 kirlenme için negatifti eksozomlar ihtiva etmiştir. Insan plazması HIV parçacıklardan eksozom etkin bir biçimde saflaştırılabilir ve ayırma insan plazması gibi bağışıklık modülatör potansiyelinin incelenmesi ve HIV-1 patojenezinde eksozom tanısal ve prognostik değerinden türetilen bir eksozom içeriği doğru inceleme sağlar.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>368589</td><td>pink top tubes</td></tr><tr><td>Lymphoprep Ficoll reagent</td><td>Cosmo Bio</td><td>AXS-1114545</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep iodixanol reagent</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>14ml ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td>ultraclear tubes</td></tr><tr><td>Gradient Former Model 485</td><td>BIO-RAD</td><td>165-4120</td><td></td></tr><tr><td>Acetylthiocholine iodide</td><td>Sigma</td><td>1480</td><td></td></tr><tr><td>Benzoic Acid</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl Cholinesterase</td><td>Sigma</td><td>C3389</td><td></td></tr><tr><td>96-well clear microtiter plate</td><td>Medical Supply Partners</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190 microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td>190</td><td>Fluorescent plate reader</td></tr><tr><td>Criterion Gel Electrophoresis Cell</td><td>BIO-RAD</td><td>165-6001</td><td></td></tr><tr><td>Transblot Gel&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3910</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Cell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Criterion precast gels</td><td>BIO-RAD</td><td>567-1093</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>Ab10558</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Antibody (H-193)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-15363</td><td></td></tr><tr><td>CD9 Antibody (H-110)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-9148</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAb p24 HIV-1&amp;nbsp;</td><td>ImmunoDX, LLC</td><td>1303</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>G1472430</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline</td><td>BIO-RAD</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>Goat-Anti-Rabbit</td></tr><tr><td>HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>31430</td><td>Goat-Anti-Mouse</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagent</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>GE LAS-4010 Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>LAS-4010</td><td></td></tr><tr><td>Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit</td><td>Affymetrix&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Custom immunoassay panel</td></tr><tr><td>Bio-Plex 200 Immunobead Reader</td><td>BIO-RAD</td><td>171-000201</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Z2 Particle Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>383552</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3</td><td>BD Bioscience (UCHT1)</td><td>300424</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled anti-CD4</td><td>Biolegend (OKT4)</td><td>317418</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-labeled anti-CD4</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>550631</td><td></td></tr><tr><td>V450-labeled anti-CD8</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>560347</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-labeled anti-CD45RA</td><td>BD Bioscience (HI100)</td><td>555487</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-labeled anti-CD62L</td><td>Biolegend (DREG-56)</td><td>304822</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5-labeled anti-CD38</td><td>Biolegend (HIT2)</td><td>303508</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled anti-HLADR</td><td>Biolegend (L243)</td><td>307618</td><td></td></tr><tr><td>PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin</td><td>BD Bioscience</td><td>551487</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5-labeled mouse IgG1K</td><td>Biolegend (MOPC-21)</td><td>400116</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK</td><td>Biolegend (MOPC-173)</td><td>400229</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of exosomes from the plasma of hiv-1 positive individuals

Eksozomlar hücre tipleri çok çeşitli hem yapısal olarak ve uyarım üzerine salınan olan 30 nm ile 100 nm arasında değişen büyüklükte küçük veziküllerdir. Bunlar, biyolojik sıvılarla bir dizi bulunmuştur ve bu proteinler, lipidler ve nükleik asit molekülleri, çeşitli taşıdığı bilinmektedir. Başlangıçta hücresel enkaz için rezervuarların daha az biyolojik süreçleri düzenleyen eksozom ve hastalıkları rolleri giderek takdir edilmektedir olduğu düşünülen. Çeşitli yöntemler, hücresel kültür ortamı ve biyolojik sıvılardan izole etmek için eksozomlar tarif edilmiştir. Nedeniyle, küçük boyut ve düşük yoğunluk, ayırıcı ultra-santrifüj ve / veya ultra filtre eksozom izolasyonu için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, HIV-1 bulaşmış kişilerin plazma büyüklüğüne ve yoğunluğuna içindeki hem eksozomlar ve HIV viral partikülleri içerir. Bu nedenle, insan plazmasında HIV viral parçacıklardan eksozom etkin ayrılması olmuşturmeydan okuma. Bu sınırlama gidermek için, Cantin et tadil edilen bir prosedür geliştirilmiştir. al., insan plazmasında HIV parçacıklardan eksozom saflaştırılması için 2008. Iyodiksanol gradyanları hızı, HIV-1 pozitif bireylerin plazmasındaki HIV-1 parçacıklardan eksozomlar ayırmak için kullanıldı. Virüs partikülleri p24 ELISA ile tespit edilmiştir. Eksozomlar eksozom belirteçleri asetilkolinesteraz temelinde (AChE) ve CD9, CD63, ve CD45 antijenleri üzerinde belirlenmiştir. Bizim degrade prosedürü virüs parçacıklarının serbest eksozom hazırlıklarını vermiştir. Insan plazmasından eksozomlann verimli arıtma plazma türevi eksozom içeriğini incelemek ve bağışıklık düzenleyici potansiyeli ve diğer biyolojik fonksiyonlarını araştırmak sağladı.

Eksozomlar verimli, HIV-1 pozitif insan plazmasından saflaştırılır. Asetilkolinesteraz (AChE) aktivitesi tarafından tanımlanan izole edilmiş eksozomlar, HIV-1 antijen, p24 tarafından tanımlanan virüs partiküllerinin, oysa iyodiksanol gradyanları üstündeki daha düşük yoğunluklu fraksiyonları 1-3 ayrılmış (alt kısmına yakın, 10-12), daha yüksek yoğunluklu fraksiyonlarda ayrılmış. Eksozom varlığı daha eksozom belirteçlerinin AChE, CD9, CD4...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals at JoVE.com

HIV-1 Pozitif Bireylerin Plazmasından Eksozomların İzolasyonu | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

isolation-of-exosomes-from-the-plasma-of-hiv-1-positive-individuals

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Cell Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

17.2K Görüntüleme.  Morehouse School of Medicine. Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Video: Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Biyokimya

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

HIV-1 enfekte olmuş hücrelerden eksozom SILAC Bazlı proteomik Karakterizasyon

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Tıp

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Biyoloji

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Yüksek Verim Ekstrasellüler Vezikül Preparatlarının Virüsten Uzaklaştırılması

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

MicroRNAs play an important regulatory role and are emerging as novel therapeutic targets for various human diseases. It has been shown that miRNAs are carried in high density lipoproteins. We have developed a simplified method to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from human plasma.

Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

Isolation and Characterization of Human Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles using Filtration and Ultracentrifugation

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can modulate the cellular status of other cells locally in tissue microenvironments or through liberation into peripheral blood. Adipocyte-derived EVs are elevated in the peripheral blood and show alterations in their cargo (RNA and protein) during metabolic disturbances, including obesity and diabetes. Adipocyte-derived EVs can regulate the cellular status of neighboring vascular cells, such as endothelial cells and adipose tissue resident macrophages to promote adipose tissue inflammation. Investigating alterations in adipocyte-derived EVs in vivo is complex because EVs derived from peripheral blood are highly heterogenous and contain EVs from other sources, namely platelets, endothelial cells, erythrocytes and muscle. Therefore, the culture of human adipocytes provides a model system for the study of adipocyte derived EVs. Here, we provide a detailed protocol for the extraction of total small EVs from cell culture media of human gluteal and abdominal adipocytes using filtration and ultracentrifugation. We further demonstrate the use of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) for quantification of EV size and concentration and show the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101) in the gluteal and abdominal adipocyte derived-EVs. Isolated EVs from this protocol can be used for downstream analysis, including transmission electron microscopy, proteomics, metabolomics, small RNA-sequencing,&#160;microarrays and can be&#160;utilized in functional in vitro/in vivo studies.

We describe the isolation of human adipocyte-derived extracellular vesicles (EVs) from gluteal and abdominal adipose tissue using filtration and ultracentrifugation. We characterize the isolated adipocyte-derived EVs by determining their size and concentration by Nanoparticle Tracking Analysis and by western blotting for the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101).

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can ...

<meta charset="utf8"></head><body>Plazma Hücre Dışı Vezikül Proteomu Kullanılarak Yapılan Kardiyovasküler Biyobelirteç Çalışmaları

Isolation, Characterization, and Proteomic Analysis of Plasma-Derived Extracellular Vesicles for Cardiovascular Biomarker Discovery

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research due to their role in regulating intercellular communication, potentially serving as valuable biomarkers for cardiovascular disease. However, the EV proteome and its potential as a biomarker in cardiovascular diagnostics remain poorly understood. This protocol presents a standardized method for the isolation and quantification of plasma-derived EV and the analysis of their protein cargo using plasma samples from patients presenting to the Chest Pain Unit of a large university hospital. Following routine phlebotomy, EV are isolated from plasma by differential ultracentrifugation. The enrichment of specific EV marker proteins in EV isolates is visualized by immunoblotting, and average size distribution and plasma EV concentrations are quantified by nanoparticle tracking analysis. Finally, ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry is employed for label-free analysis of the EV proteome. This protocol thus provides a comprehensive approach to study and use plasma-derived EV as potential carriers of critical biological information as well as to explore their potential as novel biomarkers.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Kardiyovasküler Biyobelirteç Çalışmaları için Plazma Hücre Dışı Vezikül Proteomunun Analizinin Geliştirilmesi

This article describes a methodology for the isolation, characterization, and quantification of human plasma-derived extracellular vesicles (EV) and presents a workflow for label-free analysis of the EV proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

Kardiyovasküler Biyobelirteç Keşfi için Plazma Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Proteomik Analizi

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research ...