We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.

Uno schema generale della procedura di isolamento exosome e la purificazione è fornito nella figura 1. Sangue intero è stato ottenuto da donatori volontari sani e da persone sieropositive che non ricevono theraoy antiretrovirale che frequentano la speranza Clinica della Emory University e il Programma di Malattie Infettive di Grady Health System ad Atlanta, Georgia. Questo studio è stato approvato dai comitati etici di Emory University e Morehouse School of Medicine. Tutte le persone che hanno partecipato allo studio hanno firmato un consenso informato e. 1. Preparazione di Esosomi dal plasma del sangue <ol><li> Raccolta di sangue umano e alla trasformazione <ol><li> Raccogliere 10 ml di sangue periferico mediante prelievo venoso in provette di raccolta del sangue EDTA (contenenti 18 mg di potassio EDTA), e capovolgere delicatamente per cinque volte per mescolare. </li><li> Centrifugare le provette per il prelievo di sangue a 1000 xg per 20 minuti a temperatura ambiente per far sedimentare le cellule del sangue. Utilizzare una pipetta sterile,te per trasferire la frazione di plasma (4-5 ml) in una provetta conica da 25 ml. Diluire il plasma con 10 ml di 1 x PBS. Eliminare cellule del sangue (globuli rossi e globuli bianchi, noto anche come PBMC) in un contenitore opportunamente marcata per i rifiuti a rischio biologico. NOTA: Nel caso di non infetti campioni di sangue del donatore, il PBMC può essere riservato per un ulteriore uso (vedi procedura IV.2, di seguito). </li><li> Conservare i campioni di plasma a 4 ° C per breve termine (2-3 giorni) o a -80 ° C per la conservazione a lungo termine. NOTA: Portare tutti i campioni di plasma congelati a 4 ° C prima di ulteriori trasformazioni. </li></ol></li><li> Preparazione di Exosome frazione di plasma <ol><li> Plasma Centrifugare a 10.000 xg per 30 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire il surnatante del plasma cancellata per un 25 ml tubo ultracentrifuga pulito. Eliminare il pellet nel contenitore rischio biologico. </li><li> Centrifugare il plasma eliminato a 100.000 xg per 2hr a 4 ° C per rimuovere grandi vescicole. Rimuovere il surnatante 100.000 xg accuratamente pipettando, e gettare nei rifiuti a rischio biologico. Risospendere il pellet 100.000 xg in 1 ml di 1X PBS in una provetta pulita ed incubare a temperatura ambiente per 30 min, agitando delicatamente per rimuovere particelle e separati. </li><li> Lavare lo squalificato 100.000 xg pellet exosome / virus con l&#39;aggiunta di 25 ml di PBS. Capovolgere delicatamente la provetta per cinque volte per miscelare, quindi centrifugare di nuovo a 100.000 xg per 2 ore a 4 ° C. Eliminare la soluzione di lavaggio PBS nel contenitore per rifiuti biologici. </li><li> Risospendere il pellet 100.000 xg in 1 ml di 1 x PBS e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti agitando delicatamente per rimuovere e sciogliere il precipitato. NOTA: Se non è possibile procedere direttamente al gradiente passo iodixanolo, memorizzare il pellet, contenente exosomes e particelle virali, a 4 ° C per 1-2 giorni, fino alla fase iodixanolo gradiente. </li></ol></li></ol> 2. Purificazione di Esosomi <ol><li> Generare 6% -18% velocgradienti lità di iodixanolo utilizzando una doppia camera di pendenza ex apparato. <ol><li> Preparare le soluzioni 6% e il 18% del reagente iodixanolo, forniti come una soluzione al 60% in acqua, per diluizione in PBS. Pipettare 5,5 ml della soluzione di 18% nella camera agitata e pipettare 5,5 ml della soluzione al 6% nella camera serbatoio. Accendere l&#39;agitatore, aprire il rubinetto, e consentire ogni sfumatura di fluire in una provetta da 14 ml ultracentrifuga. NOTA: o utilizzare immediatamente o conservare pendenze preparate O / N a 4 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Strato con cautela 1 ml di soluzione exosome / virus sulla parte superiore di ogni 11 ml di gradiente. Gradienti centrifugare a 250.000 xg per 2 ore a 4 ° C, utilizzando un secchio SW40Ti rotore oscillante. </li><li> Etichettare dodici (12) 1,5 ml microprovette. Rimuovere 1,0 ml dalla sommità del gradiente e trasferimento a tubo # 1. Trasferire i restanti frazioni 1ml a tubi 2-12 in ordine sequenziale. NOTA: la frazione più in alto sarà dunque # 1, la frazione di fondo, # 12. StORE frazioni gradiente a 4 ° C. Gli esosomi purificati, che dovrebbero essere nelle frazioni 1-3 nella parte superiore del gradiente, sono stabili per 3-4 settimane se conservato a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione Exosome <ol><li> (AChE) Attività Assay <ol><li> Preparare 100 mM substrato magazzino mescolando acetiltiocolina ioduro 28,9 mg in 1 ml di PBS 1X. Conservare substrato magazzino a -20 ° C fino a 1 mese. </li><li> Preparare indicatore di colore 10 mM magazzino mescolando benzoico 39.6mg acido e bicarbonato di sodio 15 mg in 10 ml di PBS 1X. Indicatore di colore Conservare azione a 4 ° C fino a due settimane. </li><li> Preparare reagente assay miscelando 1X PBS, substrato, e indicatore di colore in un rapporto di 100: 2: 5 (ad esempio, 10 ml 1X PBS + 200 + indicatore di colore 500 microlitri substrato microlitri). </li><li> Trasferimento da 50 ml ciascuno 1,5 ml gradiente tubo frazione (etichettata 1-12, da procedura III.3) ai pozzetti di una microtite 96 pozzettipiatto r. Preparare i pozzetti in duplicato per ciascun campione di sfumatura. </li><li> Preparare una serie di standard facendo prima un μU / ml AChE Stock 2000 in PBS. Fai undici (11) 2-diluizioni seriali di questo stock e aggiungere 50 ml di ogni diluizione di un singolo pozzo di una micropiastra, in modo che di serie # 1 = 2.000 μU / ml, # 2 = 1.000 μU / ml, # 3 = 500 μU / ml, ecc fino # 12 = 0.98 μU / ml. Le norme dodici AchE saranno quindi occupare una singola riga di una piastra di dosaggio 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 200 pl di miscela reagente dosaggio in ciascun pozzetto ed incubare 20 min (al buio) a temperatura ambiente per consentire lo sviluppo del prodotto di reazione di colore. Misurare attività AChE alla lunghezza d&#39;onda di 450 nm usando un lettore di micropiastre a fluorescenza. NOTA: La percentuale di materiale di partenza che rimane dopo la purificazione exosome è valutata dal AchE dosaggio del plasma non frazionata. </li></ol></li><li> Analisi Immunoblot <ol><li> Proteine ​​separate in frazioni gradiente 1-12 (da procedUre 2.1.3) mediante SDS-PAGE su 4-20% Tris-HCl gel prefabbricati a 100V x 1 ora. Trasferire proteine ​​nel gel ad una membrana di nitrocellulosa utilizzando una cella di trasferimento elettro-blotting secondo le istruzioni del produttore. Lasciare i trasferimenti di cancellare per 12-16 ore (O / N) a 350V. </li><li> Rimuovere la membrana dall&#39;apparecchio blotting e lavare in Tris-Buffered Saline (TBS) per 5 min. Bloccare con il 5% senza grassi del latte a TTBS (TBS con 0,1% di Tween 20) per 1 ora a temperatura ambiente agitando. </li><li> Incubare la membrana con anticorpi primari specifici per esosomi (CD9, CD45, CD63) o HIV-1 proteina del capside (p24) a 5% senza grassi del latte in agitazione a 4 ° C per 12-16 ore (O / N). Le diluizioni di anticorpi primari per immunoblots vanno da 1: 2.000 -1: 5.000. </li><li> Lavare la macchia in TTBS per 20 minuti, seguita da incubazione con una diluizione 1: 2000 di perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-IgG (anticorpo secondario), in 5% di latte scremato per 1 ora a RT. Lavare la macchia 3 volte con TTBS, 10 minuti a lavaggio. </li><li&gt; incubare la macchia con il reagente substrato luminol secondo le istruzioni del produttore, per generare un segnale chemiluminescente dalle proteine ​​HRP-etichettati rilevare il segnale chemiluminescente utilizzando un sistema di imaging elettronico con telecamera CCD. </li><li> Salvare le immagini come file TIFF che possono essere visualizzati in Adobe Photoshop. Eseguire l&#39;analisi densitometrica delle bande utilizzando il software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). </li></ol></li><li> Cytokine Assay <ol><li> Prima del test di citochine, interrompono complessi immuni che di solito sono presenti nel plasma umano mediante dissociazione acida e la lisi dei esosomi di trattamento detergente. Dosaggio entrambi i campioni di plasma di partenza e preparati exosome purificati. <ol><li> Per 100 ml di plasma umano aggiungere 100 microlitri 0,33 N HCL e incubare a 37 ° C per 1 ora. Aggiungere 100 ml 0,33 N NaOH per neutralizzare plasma acidato. Aggiungere esempi di Triton X-100 sia al plasma neutralizzato e exosome purificato, per un fila concentrazione finale di 1%, a causa lisi di esosomi. </li></ol></li><li> Per questo test (una procedura basata tallone-fluorescente), usano sfere magnetiche pre-rivestite con anticorpi da parte del produttore. Utilizzare un pannello custom-designed di perline anticorpi rivestite citochine anti-umani; elencati nella Tabella 1. Agitare le biglie magnetiche rivestite di anticorpo dal kit assay citochina per 30 secondi e aggiungere 50 microlitri perline a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti da utilizzare nel dosaggio. </li><li> Preparare una serie di diluizioni di norme in tampone standard plasma (sia contenuta nel kit di analisi di citochine) come descritto nel manuale di istruzioni del kit di analisi delle citochine, per generare una curva standard a 8 punti. </li><li> Aggiungere 150 ml di tampone di lavaggio 1X (da kit) ad ogni pozzetto e lavare le perline con una rondella tallone magnetico, come descritto nel manuale. Aggiungere 25 microlitri tampone plasma (da kit) in ogni pozzetto. Aggiungere 25 ml di standard e dei campioni a tutti i pozzetti utilizzati nel test. Aggiungere 25 ml di plasmatampone campione di pozzetti di controllo negativo. Sigillare e agitare la piastra a 700 rpm per 60 minuti a temperatura ambiente e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 150 ml di tampone di lavaggio 1X in ciascun pozzetto e lavare la piastra (come al punto 3.3.4, di cui sopra). Aggiungere 25 ml di anticorpi di rilevamento in ogni pozzetto, guarnizione e agitare piastra a 700 rpm per 30 minuti a RT. Ripetere la fase di lavaggio. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di streptavidina (SAPE, dal kit) in ogni pozzetto, guarnizione e agitare piastra a 700 rpm per 30 minuti a RT. Lavaggi piastra Ripetere come in 3.3.4. </li><li> Aggiungere 120 ml di tampone di lettura (da kit) in ogni pozzetto e agitare su un tavolo di laboratorio agitatore a 700 rpm per 5 min a temperatura ambiente per permettere al segnale fluorescente di sviluppare. Leggere piastra sul lettore di piastre secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Al fine di tenere conto della quantità di esosomi perse durante la procedura di isolamento, utilizzare la seguente equazione: [(lettura volume originale / plasma) x 66,6 = lettura citochine regolata]. </li></ol></li></ol> 4. Assay per potenziale immunomodulante <ol><li> Preparazione del terreno di coltura con Exosome impoverito siero fetale bovino <ol><li> Centrifuga 500 ml di siero fetale bovino (FBS) a 100.000 xg per 20 ore a 4 ° C a pellet contaminare esosomi e microvescicole. Rimuovere con cautela e salvare il exosome impoverito FBS surnatante. Eliminare il pellet in rifiuti a rischio biologico. </li><li> Combina il 20% del exosome impoverito FBS surnatante con 500 ml di Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) di media. Filtrare il mezzo attraverso un filtro a membrana da 0,45 micron. </li><li> Aggiungere streptomicina (100 U / ml), penicillina (100 U / ml), L-glutammina (2 mM), soluzione salina HEPES-buffered (10 mM), e IL-2 (20 U / ml) al mezzo filtrato. </li></ol></li><li> Colture Cellulari e Exosome Esposizione <ol><li> Esporre esosomi a donatori periferico cellule mononucleate del sangue (PBMC) ottenute da volontari sani clinica. Sospendere PBMC inpreparato terreno di coltura e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule / particelle (secondo il metodo convenzionale del produttore). NOTA: Il PBMC sono ottenuti durante la preparazione plasma sopra descritto (punto 1.2). </li><li> Usando il mezzo preparato dal procedimento 4.1.3, co-coltura 3.0 x 10 6 (PBMC) con 1 mg / ml di exosomes raccolti da tre (3) HIV-1 sieropositivi o da tre (3) HIV-1 sieronegativi individui in un totale volume di 1 ml in pozzetti di una piastra di coltura 12 pozzetti (con coperchio). Incubare culture per 48 ore a 37 ° C. </li><li> Preparare colture non trattate PBMC e colture trattate con Concanavalina A (Con A, 5 mg / ml) per servire come controlli negativi e positivi, rispettivamente, come descritto sopra (4.2.2). Incubare tutte le culture PBMC per 48 ore a 37 ° C. </li><li> Immediatamente prima raccolta delle cellule, preparare diluizioni dei seguenti anticorpi monoclonali coniugati a fluorocromi: Alexa Fluor 700-marcato anti-CD3 (1: 400 diluizione), allophycocyanin (APC) / cianinico 7 (Cy7) -labeled anti-CD4 (1: 400), peridinina proteina clorofilla complesso marcato anti-CD4 (1: 400), V450 marcato anti-CD8 (1: 400), biotin- etichettato anti-CD45RA (1: 1.000), ficoeritrina (PE) / Cy7-marcato anti-CD62L (1: 1.000), PE / cianina 5 (Cy5) -labeled anti-CD38 (1: 200), PE-Texas Red- marcato anti-streptavidina (1: 2.000) e PE / Cy5 marcato controllo isotipico topo IgG1K (1: 200). </li><li> Dopo il periodo di incubazione 48 ore, raccogliere il PBMC. Lavare PBMC in PBS per rimuovere esosomi e macchia le cellule mediante incubazione per 1 ora a 4 ° C con anticorpi individuali fluorocromi-tag. Analizzare il PBMC macchiata di citometria a flusso per quantificare l&#39;espressione di chemochine (come descritto 21). </li></ol></li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+Profiling+of+Exosomes+Derived+from+Blood+and+Culture+Media.">Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media.</a> J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).</li><li>Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+Precipitation+Method+to+Isolate+Urinary+Exosomes.">A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Attivazione cronica del sistema immunitario (CIA) e l&#39;esaurimento delle cellule T CD4 + sono due importanti caratteristiche di HIV-1. Essi sono stati istituiti come predittori di patogenesi, con CIA essere il miglior predittore. Tuttavia, i meccanismi alla base di guida attivazione immunitaria cronica sistemica e il declino delle cellule CD4 + T ancora non sono stati completamente chiariti. Noi e altri laboratori hanno sviluppato prove certe che esosomi secreti da HIV-1 le cellule infettate giocano un ruolo in entra...

L&#39;HIV-1 epidemia continua ad avere un impatto significativo in tutto il mondo. A partire dal 2013, circa 35 milioni di persone in tutto il mondo vivevano con l&#39;HIV, e 2,1 milioni di questi erano individui contagiati 1. Le strategie di prevenzione e un maggiore accesso alla terapia antiretrovirale sono stati utili nel ridurre l&#39;acquisizione complessiva di HIV. Tuttavia, singole popolazioni stanno ancora sperimentando aumenti per l&#39;acquisizione di HIV-1. Quindi, vi è la necessità di proseguire gli sforzi per affrontare questa epidemia. Uno dei più forti predittori di progressione della malattia da HIV è attivazione immunitaria cronica (CIA) 2-10. Definito da persistentemente elevati livelli di citochine rilevabili e marcatori di espressione elevati sulla superficie dei linfociti T, CIA è stato attribuito a: i) continua la produzione di cellule dendritiche di tipo I IFN 11; (ii) l&#39;attivazione immunitaria diretta guidata da proteine ​​dell&#39;HIV Tat, Nef e gp120 12; (iii) Traslocazione di proteine ​​batteriche intestinali associate a cellule immunitarie 6. Tuttavia, il meccanismo esatto (s) cronica sottostante, l&#39;attivazione immunitaria sistemica nell&#39;infezione da HIV devono ancora essere completamente chiariti. Il nostro gruppo di ricerca e altri hanno dimostrato un ruolo di esosomi HIV patogenesi 15-18. Il nostro gruppo ha stabilito che la proteina Nef è escreto dalle cellule infette in esosomi 15, e exosomal Nef (exNef) è presente nel plasma di individui affetti da HIV a livelli nanogrammi 18. Abbiamo dimostrato che astante CD4 + T-cellule esposte a exNef provocato attivazione indotta morte cellulare dipendente dal percorso CXCR4 19, 20. In alternativa, monociti / macrofagi erano refrattari all&#39;apoptosi exNef indotta, ma esposto funzioni cellulari alterati e di espressione di citochine. Esosomi Più di recente, il nostro gruppo ha dimostrato isolate dal plasma di individui affetti da HIV contengono una varietà di citochine pro-infiammatorie. Further, ingenui cellule mononucleate del sangue periferico esposti a exosomes plasmaderivati ​​da pazienti con infezione da HIV indotta espressione di CD38 sulle cellule memoria ingenuo e centrale CD4 + e CD8 + T. Ciò probabilmente contribuisce ad infiammazione sistemica e la propagazione virale tramite l&#39;attivazione delle cellule astante 21, e suggerisce che esosomi giocano un ruolo importante nella patogenesi dell&#39;HIV. Nel indagare il ruolo di esosomi nella patogenesi dell&#39;HIV, una sfida sta sviluppando tecniche per esosomi efficacemente separati da particelle di HIV, pur mantenendo il contenuto exosomal così come la loro capacità funzionale modulazione immunitaria. Diversi metodi sono stati descritti per isolare esosomi da coltura cellulare e fluidi biologici 22,23. A causa delle loro piccole dimensioni e bassa densità (esosomi galleggiare con una densità di 1,15 - 1,19 g / ml), ultracentrifugazione differenziale e / o ultrafiltrazione sono le tecniche più comunemente utilizzati per l&#39;isolamento exosome 23.Tuttavia, con infezione da HIV supernatanti di coltura cellulare e nel plasma dei pazienti contengono sia esosomi e HIV-1 particelle virali. Esosomi e HIV-1 particelle sono molto simili per dimensioni e densità. In alternativa, sfruttando l&#39;espressione di marcatori exosomal unici come CD63, CD45, CD81 e, esosomi sono stati isolati con metodi di cattura immunoaffinità 23. Questa procedura può separare il virus da esosomi. Tuttavia, l&#39;inconveniente di questa tecnica è la stretta attaccamento di anticorpi purificati esosomi, che potrebbero interferire con la valutazione del potenziale immunomodulante di esosomi in coltura. Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo sviluppato una procedura per la purificazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano modificati rispetto Cantin e collaboratori 22 utilizzando iodixanolo gradienti di velocità. Esosomi sono stati trovati a segregare in bassa densità / frazioni superiori di gradienti iodixanolo, mentre le particelle virali separati nel altadensità / frazioni inferiori. Particelle virali sono stati identificati da p24 ELISA e esosomi sono stati identificati utilizzando marcatori exosome AChE, CD9, CD63, CD45 e. Le frazioni a bassa densità superiori raccolti contenevano esosomi che erano negativi per la contaminazione da HIV-1 p24. La purificazione efficiente e la separazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano permette di accurato esame del contenuto di esosomi derivati ​​dal plasma umano e l&#39;indagine del loro potenziale modulatore immunitario e il valore diagnostico e prognostico di esosomi in HIV-1 patogenesi.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>368589</td><td>pink top tubes</td></tr><tr><td>Lymphoprep Ficoll reagent</td><td>Cosmo Bio</td><td>AXS-1114545</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep iodixanol reagent</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>14ml ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td>ultraclear tubes</td></tr><tr><td>Gradient Former Model 485</td><td>BIO-RAD</td><td>165-4120</td><td></td></tr><tr><td>Acetylthiocholine iodide</td><td>Sigma</td><td>1480</td><td></td></tr><tr><td>Benzoic Acid</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl Cholinesterase</td><td>Sigma</td><td>C3389</td><td></td></tr><tr><td>96-well clear microtiter plate</td><td>Medical Supply Partners</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190 microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td>190</td><td>Fluorescent plate reader</td></tr><tr><td>Criterion Gel Electrophoresis Cell</td><td>BIO-RAD</td><td>165-6001</td><td></td></tr><tr><td>Transblot Gel&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3910</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Cell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Criterion precast gels</td><td>BIO-RAD</td><td>567-1093</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>Ab10558</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Antibody (H-193)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-15363</td><td></td></tr><tr><td>CD9 Antibody (H-110)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-9148</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAb p24 HIV-1&amp;nbsp;</td><td>ImmunoDX, LLC</td><td>1303</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>G1472430</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline</td><td>BIO-RAD</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>Goat-Anti-Rabbit</td></tr><tr><td>HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>31430</td><td>Goat-Anti-Mouse</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagent</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>GE LAS-4010 Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>LAS-4010</td><td></td></tr><tr><td>Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit</td><td>Affymetrix&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Custom immunoassay panel</td></tr><tr><td>Bio-Plex 200 Immunobead Reader</td><td>BIO-RAD</td><td>171-000201</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Z2 Particle Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>383552</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3</td><td>BD Bioscience (UCHT1)</td><td>300424</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled anti-CD4</td><td>Biolegend (OKT4)</td><td>317418</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-labeled anti-CD4</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>550631</td><td></td></tr><tr><td>V450-labeled anti-CD8</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>560347</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-labeled anti-CD45RA</td><td>BD Bioscience (HI100)</td><td>555487</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-labeled anti-CD62L</td><td>Biolegend (DREG-56)</td><td>304822</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5-labeled anti-CD38</td><td>Biolegend (HIT2)</td><td>303508</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled anti-HLADR</td><td>Biolegend (L243)</td><td>307618</td><td></td></tr><tr><td>PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin</td><td>BD Bioscience</td><td>551487</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5-labeled mouse IgG1K</td><td>Biolegend (MOPC-21)</td><td>400116</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK</td><td>Biolegend (MOPC-173)</td><td>400229</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of exosomes from the plasma of hiv-1 positive individuals

Esosomi sono piccole vescicole di dimensioni variabili da 30 nm a 100 nm che vengono rilasciati sia costitutivamente e dopo stimolazione da una varietà di tipi di cellule. Si trovano in una serie di fluidi biologici e sono noti per portare una varietà di proteine, lipidi e molecole di acido nucleico. Originariamente pensato per essere poco più di serbatoi di detriti cellulari, i ruoli di esosomi che regolano processi biologici e nelle malattie sono sempre più apprezzati. Diversi metodi sono stati descritti per isolare exosomes di terreni di coltura cellulare e fluidi biologici. A causa delle loro piccole dimensioni e bassa densità, ultracentrifugazione differenziale e / o ultrafiltrazione sono le tecniche più comunemente utilizzati per l&#39;isolamento exosome. Tuttavia, il plasma di HIV-1 individui infetti contiene sia esosomi e particelle virali HIV, che sono simili per dimensioni e densità. Così, la separazione efficiente di esosomi da particelle virali HIV nel plasma umano è statouna sfida. Per far fronte a questa limitazione, abbiamo sviluppato una procedura modificata da Cantin et. al., 2008 per la purificazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano. Iodixanolo gradienti di velocità sono stati usati per separare esosomi da HIV-1 particelle nel plasma di HIV-1 individui positivi. Particelle virali sono stati identificati mediante p24 ELISA. Esosomi sono stati individuati sulla base dei marcatori exosome acetilcolinesterasi (AChE), e gli antigeni CD9, CD63, CD45 e. La nostra procedura gradiente prodotto preparativi exosome gratuitamente particelle virali. La purificazione efficiente di esosomi da plasma umano ci ha permesso di esaminare il contenuto di exosomes derivati ​​dal plasma e di indagare il loro potenziale di modulazione immunitaria e altre funzioni biologiche.

Esosomi vengono efficacemente purificati da HIV-1 plasma umano positivo. Isolato esosomi, identificate da acetilcolinesterasi (AChE), segregati in frazioni bassa densità 1-3 in cima gradienti iodixanolo, mentre le particelle virali, identificate da HIV-1 dell&#39;antigene p24 , segregata nelle frazioni ad alta densità (10-12, nella parte inferiore). La presenza di esosomi è stata ulteriormente confermata dalla individuazione di marcatori immunoblot exosome AChE, CD9, ...

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Isolamento di esosomi dal plasma di individui positivi all'HIV-1 | Inmmunologia e Infezione | Video

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

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17.2K Views.  Morehouse School of Medicine. Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

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Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

Isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Ricerca

Biochimica

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

SILAC Based proteomica Caratterizzazione di Esosomi da HIV-1 le cellule infette

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Immunologia e infezioni

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Medicina

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Biologia

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

MicroRNAs play an important regulatory role and are emerging as novel therapeutic targets for various human diseases. It has been shown that miRNAs are carried in high density lipoproteins. We have developed a simplified method to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from human plasma.

Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ​​ad alta densità

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

Isolation and Characterization of Human Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles using Filtration and Ultracentrifugation

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can modulate the cellular status of other cells locally in tissue microenvironments or through liberation into peripheral blood. Adipocyte-derived EVs are elevated in the peripheral blood and show alterations in their cargo (RNA and protein) during metabolic disturbances, including obesity and diabetes. Adipocyte-derived EVs can regulate the cellular status of neighboring vascular cells, such as endothelial cells and adipose tissue resident macrophages to promote adipose tissue inflammation. Investigating alterations in adipocyte-derived EVs in vivo is complex because EVs derived from peripheral blood are highly heterogenous and contain EVs from other sources, namely platelets, endothelial cells, erythrocytes and muscle. Therefore, the culture of human adipocytes provides a model system for the study of adipocyte derived EVs. Here, we provide a detailed protocol for the extraction of total small EVs from cell culture media of human gluteal and abdominal adipocytes using filtration and ultracentrifugation. We further demonstrate the use of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) for quantification of EV size and concentration and show the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101) in the gluteal and abdominal adipocyte derived-EVs. Isolated EVs from this protocol can be used for downstream analysis, including transmission electron microscopy, proteomics, metabolomics, small RNA-sequencing,&#160;microarrays and can be&#160;utilized in functional in vitro/in vivo studies.

We describe the isolation of human adipocyte-derived extracellular vesicles (EVs) from gluteal and abdominal adipose tissue using filtration and ultracentrifugation. We characterize the isolated adipocyte-derived EVs by determining their size and concentration by Nanoparticle Tracking Analysis and by western blotting for the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101).

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can ...

<meta charset="utf8"></head><body>Studi sui biomarcatori cardiovascolari utilizzando il proteoma delle vescicole extracellulari plasmatiche

Isolation, Characterization, and Proteomic Analysis of Plasma-Derived Extracellular Vesicles for Cardiovascular Biomarker Discovery

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research due to their role in regulating intercellular communication, potentially serving as valuable biomarkers for cardiovascular disease. However, the EV proteome and its potential as a biomarker in cardiovascular diagnostics remain poorly understood. This protocol presents a standardized method for the isolation and quantification of plasma-derived EV and the analysis of their protein cargo using plasma samples from patients presenting to the Chest Pain Unit of a large university hospital. Following routine phlebotomy, EV are isolated from plasma by differential ultracentrifugation. The enrichment of specific EV marker proteins in EV isolates is visualized by immunoblotting, and average size distribution and plasma EV concentrations are quantified by nanoparticle tracking analysis. Finally, ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry is employed for label-free analysis of the EV proteome. This protocol thus provides a comprehensive approach to study and use plasma-derived EV as potential carriers of critical biological information as well as to explore their potential as novel biomarkers.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento dell'analisi del proteoma delle vescicole extracellulari plasmatiche per gli studi sui biomarcatori cardiovascolari

This article describes a methodology for the isolation, characterization, and quantification of human plasma-derived extracellular vesicles (EV) and presents a workflow for label-free analysis of the EV proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

Isolamento, caratterizzazione e analisi proteomica di vescicole extracellulari derivate dal plasma per la scoperta di biomarcatori cardiovascolari

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research ...

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Riepilogo

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Isolamento di lipoproteine ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione

Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano

SILAC Based proteomica Caratterizzazione di Esosomi da HIV-1 le cellule infette

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi

Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus

Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ad alta densità

Isolation and Characterization of Human Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles using Filtration and Ultracentrifugation

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