The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;.

HINWEIS: Eine geeignete Säugetier-Expressionsvektor muss für dieses Protokoll verwendet werden. Hier wird ein einziges Konstrukt , das zwei Expressionskassetten verwendet wird (dh schweren und leichten Kette Ausdruck wird durch separate Promotoren gesteuert). Trastuzumab schweren und leichten Ketten wurden zuvor in den Vektor geklont. Dieser Vektor war ein Geschenk von Andrew Beavil, 13 durch eine nicht-for-Profit - Plasmid - Repository erhalten. 1. Wiederherstellung und Scale-up von Vektor-DNA HINWEIS: Die Vektor - DNA wurde als Weichagar Stichkultur in Escherichia coli XL-1 Blue Stamm erhalten; Vektor trägt Hygromycinresistenz. <ol><li> Legen Sie eine sterile Inokulation Stich- oder Schleife in den Weichagar der Stichkultur dann Streifen ein Luria Bertani (LB) Agar-Platte hergestellt mit 75 ug / ml für isolierte Kolonien Hygromycin. Die Platte bei 37 ° C für 18-24 Stunden. </li><li> Impfen eine einzige Kolonie in 5 ml Terrific Broth (TB) 75 &amp; mgr; g / ml Hygromycin enthält. IncuBATE die Kultur bei 37 ° C für 18 bis 24 Stunden mit 225 Umdrehungen pro Minute schütteln. </li><li> Verwenden Sie die Nacht-Kultur ein Glycerolstammlösung von Vektor-DNA herzustellen, indem man sanft in einem Kryoröhrchen und gefrier bei -80 ° C mit 200 &amp; mgr; l 80% Glycerin 800 ul Kultur mischen. <ol><li> 100 l der über Nacht - Kultur zu 100 ml TB mit 75 ug / ml Hygromycin in einem verwirrte Schüttelkolben (dh 1/1000 - Verdünnung). Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C für 18 bis 24 Stunden mit 225 Umdrehungen pro Minute schütteln. </li></ol></li><li> Nachdem über Nacht Kultur, extrahieren und die DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers von midi / maxi Vorbereitung Kit mit folgender Ausnahme zu reinigen; während der letzte Schritt, eluieren oder resuspendieren DNA mit Wasser (pH 7,0-8,5). </li><li> Überprüfen Konzentration und Reinheit der DNA wurde durch Absorptionsablesungen bei 260 und 280 nm dann DNA bei -20 ° C. HINWEIS: Optional (empfohlen): DNA-Sequenz unter Verwendung von Vektor-spezifische Primer Identität zu bestätigen. </li></ol> 2. Stabile Transfektion von HEK-293-Zellen <ol><li> HEK-293-Zellen (Suspensionszellen) nach Standardprotokollen in serumfreiem Medium, supplementiert mit 0,1% nichtionisches Tensid in Erlenmeyerkolben wachsen und zu warten. Pflegen bei 2 x 10 5 Zellen / ml und Subkultur jeden vierten Tag. Kulturzellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 120 rpm Rotation. HINWEIS: Die Zellen sollten für nicht weniger als 4 Tagen in Kultur gewesen sein und nicht mehr als 4 Wochen vor der Transfektion. HEK-293-Zellen als Monoschichten in serumhaltigen Medien gezüchtet können auch für dieses Verfahren eingesetzt werden. </li><li> Am Tag vor der Transfektion seed HEK-293 - Zellen bei 3 x 10 5 Zellen / ml in Wells einer 12-Well - Platte in 2 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum ( FBS). Am Tag der Transfektion überprüfen, dass die Zellen 80-90% Konfluenz erreicht haben </li><li> Verdünnen DNA und Polyethylenimin (PEI) separat in Transfektionsmedien dann zusammen mischen.<ol><li> Verdünnen 1,25 ug Vektor-DNA pro Vertiefung (15 &amp; mgr; g für 12 Wells) in 300 &amp; mgr; l Transfektionsmedien. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Verdünne 2,5 ul 1 mg / ml PEI - Lösung (30 &amp; mgr; l für 12 Vertiefungen, dh 1: 2 - Verhältnis von DNA zu PEI) in 300 &amp; mgr; l Transfektionsmedium. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> In verdünnter DNA zu verdünnter PEI, vorsichtig mischen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. </li></ol></li><li> Zugabe von 50 &amp; mgr; l DNA / PEI-Mischung tropfenweise zu jeder Vertiefung der Platte. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig das Transfektionsgemisch dann legen Sie die Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Stunden zu verteilen. </li><li> In 50 ug / ml B pro Vertiefung Hygromycin und Rückplatte auf 37 ° C, 5% CO 2 für 10 Tage. HINWEIS: Mit dem 10. Tag, un-transfizierten Zellen werden von der Oberfläche der Platte sind gestorben und freistehend, während stabil transfizierten Zellen an der Platte lebens- und befestigt werden. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in Brunnen mit1/4 Volumen Serum-freie Medien und 3/4 Volumen DMEM mit 10% FBS (dh 0,5 ml Serum-freien Medien + 1,5 ml DMEM = 7,5% endgültige Serumkonzentration) , ergänzt und für 4 Tage inkubiert. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen mit 1/2 Volumen Serum-freie Medien und 1/2 Volumen DMEM , das mit 10% FBS (dh 1 ml Serum-freien Medien + 1 ml DMEM = 5% endgültige Serumkonzentration) und Inkubation für 4 Tage. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen mit 3/4 Volumen Serum-freie Medien und 1/4 Volumen DMEM , das mit 10% FBS (dh 1,5 ml Serum-freien Medien + 0,5 ml DMEM = 2,5% endgültige Serumkonzentration) und Inkubation für 4 Tage. </li><li> Ersetzen Sie die Medien in den Vertiefungen mit 2 ml Serum-freien mit 0,1% nicht-ionisches Tensid (dh 0% endgültige Serumkonzentration) ergänzten Medium und Inkubation für 4 Tage. HINWEIS: Pflegen 50 ug / ml Hygromycin B selektiven Druck auf Zellen während der Serum-freie Adaption. Zellen angepasst serumfreien Medien von der Oberfläche der Vertiefungen trennen und i clustern kannn Suspension. Siehe Schritt 2.1 für Kulturbedingungen mit der zusätzlichen Aufschlag von 50 ug / ml Hygromycin B. </li><li> Mit einer Pipette vorsichtig mischen die Suspensionskulturen in der 12-Well-Platte und Pool-Zellen in einem separaten Röhrchen. <ol><li> Verwendung eines Hämocytometer, aufzuzählen gepoolt Zellen und Samen in 30 ml serumfreiem Medium in einem Erlenmeyerkolben bei 2 x 10 5 Zellen / ml. Kulturzellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 120 rpm Rotation. Subculture und jeden vierten Tag erweitern. </li></ol></li><li> Weiterhin Kulturgröße erforderlich Zelldichte zu erweitern , auf 1 x 10 7 Zellen 10 zu erhalten Vials / Fläschchen zur Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff. Einfrieren der Zellen in serumfreiem Medium, enthaltend 10% Dimethylsulfoxid (DMSO). HINWEIS: Die konditionierten Medien Antikörper enthalten, können bei jeder Subkultur geerntet werden Proteinproduktion zu bestätigen oder verwendet, um Reinigungsbedingungen zu optimieren. Zur Ernte konditionierten Medien und pflegen Zellen für Subkultur, Zentrifuge, die Kultur bei300 xg für 5 min, dann filter sterilisieren Überstand durch ein 0,22 um-Filter. Filtrierte Überstand bei 4 ° C für 1-2 Wochen und -20 ° C für die längerfristige Lagerung gehalten werden. </li></ol> 3. Große Antikörperproduktion von Batch überwuchern Kultur HINWEIS: Die Antikörperproduktion von Schritt folgt auf werden können 2,11 wo vorhandene Zellen auf die gewünschte Zelldichte auf der Charge überwuchern Kulturvolumen auf Basis erweitert werden eingerichtet werden. Andernfalls Zellen, die aus der Kryokonservierung aufgetauten wurden zu diesem Zeitpunkt beginnen, wenn auf eine geeignete Zelldichte und das Volumen expandiert. Verschiedene Kultur Ergänzungen können Antikörper zur Optimierung der Produktion verwendet werden; die Verwendung von Trypton zu erhöhen Antikörper Ausbeute in diesem Protokoll demonstriert. <ol><li> Samenzellen bei 2 x 10 5 Zellen / ml in 100 ml serumfreiem Medium in zwei Erlenmeyerkolben (Antikörper Ausbeuten aus un-supplementierten und nährstoff ergänzt Kulturen zu vergleichen). Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt; und 120 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Nach 24 Stunden Trypton bis zu einer Endkonzentration von 0,5% bis nährstoff ergänzten Kultur hinzuzufügen. Abgleichen Volumen von un-ergänzten Kultur mit Serum-freien Medien. </li><li> Von Tag 8-Zellzahl der Kulturen täglich eine Zählkammer die Lebensfähigkeit der Zellen zu überwachen, ausführen. Ernte der Kulturüberstände, sobald die Lebensfähigkeit der Zellen weniger als 80%. <ol><li> Ernteüberstand durch Zentrifugation der Kulturen bei 3.000 xg für 15 min, dann filter sterilisieren den Überstand (enthaltend Antikörper) durch ein 0,22 um-Filter. Lagern Sie die Überstände bei 4 ° C (kurzfristig) oder einfrieren bei -20 ° C (langfristig). </li></ol></li></ol> 4. Reinigung der Antikörper durch Affinitätschromatographie unter Verwendung eines automatisierten Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) -System HINWEIS: Das folgende Verfahren kann in der Regel auf den meisten automatisierten Systemen angewendet werden. Die Reinigung kann bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C durchgeführt werden (wenn FPLC-System wird in einem kühlen Raum aufbewahrt).Eine Reihe von Scouting-Tests durchgeführt werden, um die optimale Reinigungsbedingungen einschließlich geeigneter Säulenmatrix, Bindungspuffer, Elutionspuffer und pH-Wert zu identifizieren maximale Rückgewinnung von gereinigtem Antikörper aus konditionierten Medien zu gewährleisten (zur Übersicht siehe Abschnitt). Die optimalen Bedingungen sind abhängig von der Antikörper oder das Protein gereinigt wird. Aufreinigungen wurden auf einem automatisierten FPLC-System durchgeführt. Aufreinigungen wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung einer 5 ml Protein A-Säule durchgeführt. <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Puffer Reinstwasser mit und stellen Sie dann mit dem empfohlenen pH-Wert ein 0,22 um Filter filtriert durch. <ol><li> Vorbereitung 1 l Phosphat - gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,4 (Bindungspuffer) durch Vermischen der folgenden: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na 2 HPO 4 und 0,001 M KH 2 PO 4. Der pH-Wert, falls erforderlich, bevor die Puffer Filterung. </li><li> Bereiten 500 ml 0,1 M Glycin-HCl pH 2,7 (Elutionspuffer). Der pH-Wert vor den Buff Filterunger. </li><li> Vorbereitung 50 ml 1 M Tris pH 9,0 (Neutralisationspuffer). </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, alle Systemleistung und Kommunikationsverbindungen mit dem Computer hergestellt werden. Die Geräte müssen in der Software unter &quot;Systemsteuerung&quot; Modul sichtbar sein. Stellen Sie sicher, UV-Zelle bei 280 nm Wellenlänge eingestellt. Optional: Kalibrieren pH-Meter falls angeschlossen und verwendet werden. </li><li> Tauchen Einlassrohre von A, B und Probenpumpe in Reinstwasser, um das System zu waschen. Spülen Sie die Pumpen mit einer Spritze, wenn Luft in den Schlauch oder ein Verdacht auf Luft im System ist. Waschen Sie das System mit Wasser durch eine manuelle Bedienung über die Systemsteuerung oder über ein automatisiertes Verfahren. Beachten Sie, dass der Druck, Leitfähigkeit, UV280 Verfolgung und pH-Wert konsistent bleiben und dass die Druckgrenze für die Spalte nicht überschritten wird laut Herstellerangaben. HINWEIS: Abnormalitäten kann Luft oder Verstopfung im System anzuzeigen, dass, bevor Sie fortfahren angegangen werden sollte. </li><li> Bei dem System-Controller-Modul, starten Sie den Durchfluss, bei 1ml / min manuell über Pumpe A in jeder Last (unter Umgehung Probenschleife) oder (durch die Probenschleife) Position, um die Säule zu beginnen injizieren verbindet. Disconnect System Schlauch an der Spaltenposition Einlass und entfernen Sie den Stopfen mit dem Säuleneingang verbunden. <ol><li> Lassen Sie Wasser fließt aus dem System Schlauch tropfenweise auf der Oberseite der Kolonne dann schließen Sie den Systemschlauch an die Säule. Säuleneingang und Einlass Armatur mit Wassertropfen überfüllt sorgt für eine Verbindung frei von Luftblasen. </li></ol></li><li> Bringen Sie den Säulenausgang am stromabwärtigen Auslass und überprüfen alle Befestigungen fest angezogen sind. Mit der Säule jetzt an das System angeschlossen, nicht überschreiten Grenzwerte für maximale Druckgrenze und Fließgeschwindigkeit wie in Spalte Spezifikationen beschrieben. </li><li> Waschen Säule mit 5 Säulenvolumina (CV) Wasser. Falls erforderlich, weiterhin Spalte Wäsche bis UV280 Tracing stabilisiert hat. </li><li> Tauchen Einlassrohre von A in Bindungspuffer, B in Elutionspuffer und Probenpumpe in Bindungspuffer to das System in der richtigen Puffer ins Gleichgewicht. Füllen Sie die Einlassrohre mit Puffer PumpWash durch manuelle Bedienung verwendet wird. </li><li> In dem Modul der Software &quot;Method Editor&quot;, verwenden Sie die Methode Assistenten zur Einrichtung einer Affinitätschromatographie Methode für die Spalte, die verwendet werden soll. HINWEIS: Automatisierte FPLC Systeme kommen mit Methoden vorausgefüllt mit den empfohlenen Einstellungen (dh Fließgeschwindigkeit und Druckgrenze) und Stufen führen auf der Basis der Säule (Hersteller, Matrix und Größe) für die Reinigung ausgewählt. <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Laufschritte für die Protein-A-Affinitätschromatographie: <ol><li> Äquilibrieren System mit 5 CV Bindungspuffer und sammeln Durchfluss in Abfallbehälter. </li><li> Last Probe auf die Säule (Volumen geladen werden angegeben wird manuell in dem Verfahren) und zu sammeln Durchflußleistung in einen separaten Behälter. </li><li> Wash-System mit 5 CV Bindungspuffer und Durchfluss in einen separaten Behälter zu sammeln. </li><li> Eluieren Säule mit 5 CV isocratic-Fraktionierung unter Verwendung von Elutionspuffer und gereinigte Antikörper Probe als Fraktionen von Fraktionssammler sammeln. </li><li> Äquilibrieren System mit 5 CV Bindungspuffer und sammeln Durchfluss in Abfallbehälter. </li></ol></li></ol></li><li> Sobald das Verfahren aufgebaut ist, geben das Volumen der konditionierten Medien auf die Säule aufgebracht werden, und das Verfahren zu speichern. HINWEIS: Die angegebene Volumen in dem Verfahren sollte 5-10 ml kleiner als das tatsächliche Volumen Einführung von Luft während des Probelaufs zu vermeiden. Das angegebene Volumen in diesem Protokoll verwendet 90-120 ml. </li><li> Tauchen Sie die Probenpumpenschlauch in das Gefäß die konditionierten Medien enthalten. </li><li> Bereiten Sie einen separaten Behälter Probe Durchfluss über den angegebenen Ablaufschlauch zu sammeln. Hinweis: Es ist wichtig, den Durchfluss in dem Fall ein Fehler auftritt, während des Laufs oder die Bindungskapazität der Säule zu sammeln, um den Durchfluss überschritten erfordert an der Säule oder der Reinigung r erneut angewendet werdenepeated. </li><li> Bereiten Sammelröhrchen in dem Fraktionssammler. 100 l Neutralisationspuffer pro 1 ml Fraktionsvolumen. Die FPLC-System automatisch die Fraktionen in den Sammelröhrchen eluieren. </li><li> Im Modul &quot;Systemsteuerung&quot; der Software, öffnen Sie das Verfahren ausgeführt werden. HINWEIS: Die Methode Lauf wird in einer Reihe von Seiten initiiert, die die Variablen des Verfahrens, Fraktionssammler-Setup und die Definition Ergebnis Dateinamen und den Speicherort einschliessen. </li><li> Klicken Sie auf Start, um den Lauf zu initiieren. Der Lauf kann in der &quot;Systemsteuerung&quot; Modul überwacht werden. </li><li> Bei der Beendigung der Reinigung beginnen, prüfen Sie das resultierende Chromatogramm in der &quot;Bewertung&quot; Modul in der Systemsoftware. </li><li> Kombinieren Sie alle Protein enthaltenden Fraktionen in einem separaten Röhrchen, Pufferaustausch und konzentrieren sich in PBS eine zentrifugale Filtervorrichtung mit 30 kDa Molekulargewicht unter Verwendung abgeschnitten. Führen Zentrifugationsschritte nach HerstellerAnleitung. </li><li> Messung der Antikörperkonzentration unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wenn eine andere Reinigungslauf durchgeführt werden soll, Prime die Probenpumpenschlauch in Bindungspuffer und wiederholen Sie die Schritte 4,9-4,14. </li><li> Bei der Beendigung der Reinigung läuft, tauchen Einlassrohre von A, B und Probenpumpe in Reinstwasser und waschen Sie das System und die Säule, wie in Schritt 3 durchgeführt. </li><li> Versenken A, B und Probenpumpenschlauch in 20% Ethanol und wiederholen Waschverfahren für die Lagerung des Systems und Spalte. </li><li> Ziehen Sie die Spalte aus der nachgeschalteten Auslass und Spalten Stopper ersetzen, trennen Sie dann Spalte am Eingang und dem Stopfen verschließen, schließen Schlauch an das System. Lagern Sie die Säule bei 4 ° C. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Dieses Protokoll beschreibt die Transfektion eine stabile Expression und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers in HEK-293-Zellen. Eine stabile Expression von Antikörpergenen ist der erste Schritt eine Antikörper-produzierende Zelllinie für die Entwicklung und Herstellung eines therapeutischen Antikörpers bei der Erzeugung. Während Eizellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) die Expressionsplattform der Wahl für therapeutische Proteine ​​verbleiben, wird die HEK-293-Zelllinie Prominenz mit der Erkenn...

Der Erfolg von therapeutischen Antikörpern weiterhin erhebliche Investitionen in die Antikörperentwicklung zu fahren, als eine Welle der nächsten Generation Therapeutika beginnt. Der Antikörper - Markt wird erwartet , dass durch Antikörperfragmente 1, Antikörper-Wirkstoff - Konjugate 2, bispezifische Antikörper 3 und manipulierte Antikörper mit günstigen Eigenschaften 4 neu gestaltet werden. Eine andere Klasse pharmazeutischem Interesse zu gewinnen sind Biosimilars. Biosimilar-Antikörper sind &quot;sehr ähnlich&quot; replizieren Produkte eines therapeutischen Antikörper, der bereits die Zulassung erhalten hat. Eine vorgeschlagene Biosimilar muss mit dem Absender Antikörper in Bezug auf seine Struktur, Funktion, Tier Toxizität, klinische Sicherheit und Wirksamkeit, Pharmakokinetik beim Menschen (PK), Pharmakodynamik (PD) und Immunogenität 5, 6 vergleichbar sein. Die Zulassung rAtes von Biosimilar-Antikörper auf die endgültige Qualität des Produkts aufgrund der strengen Einschränkungen langsam. Die genauen Herstellungsverfahren, wie spezifische Zelllinien und Kulturbedingungen bis hin zu den letzten Verarbeitungsschritte können proprietäre bleiben. Was mehr ist, beinhaltet die Herstellung von Antikörpern inhärent einen Grad an Variabilität, die einen sehr ähnlichen Produkt zur Herstellung der Herausforderung hinzufügen. Eine umfassende physikalisch - chemischen und biophysikalischen Charakterisierung und Vergleich ist ziemlich schwierig, noch eine Reihe von Studien die Merkmale biosimilar Antikörper entstehen in der Literatur 7, 8, 9 demonstriert. einen therapeutischen Antikörper zu erzeugen beginnt mit Transfektion von Säugerwirtszellen mit einem Vektor, der die Gene für die jeweiligen Antikörper trägt. Vector Design, Zelllinie und Kulturbedingungen sind wichtige Überlegungen für die Ex-Einrichtungpression System. Die DNA-Sequenzen von Antikörpern aus Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) oder Research-Publikationen einschließlich Patente bezogen werden. Beispielsweise ist die Sequenz von Trastuzumab erhältlich durch Drug Bank (DB ID: DB00072). Die Aminosäuresequenz der variablen Regionen können Gen-Design und die Optimierung für die Synthese in die gewünschten Wirtsspezies unterziehen. Es ist wichtig, für eine biosimilar Antikörper, der keine Modifikation der Aminosäuresequenz vorgenommen wird. Einmal synthetisiert, können Antikörpergene subkloniert in den entsprechenden Vektor der Wahl werden. Humane IgG-Antikörper bestehen aus zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten. Eng regulierte Expression beider Ketten 10 für eine optimale Produktion von heterologen IgG - Protein in Säugerzellen wesentlich. Intra- als auch Inter-Ketten-Disulfidbindungen, so ausgebildet und eine Reihe von post-translationalen Modifikationen werden müssen, werden inwährend der Proteinbiosynthese eingeführt. Eine Reihe von Vektoren zur Verfügung, die speziell zum Ausdruck Antikörpergene (siehe Tabelle der Materialien) entwickelt wurden. Diese Antikörper-spezifischen Vektoren Express in der Regel die konstanten Regionen für die schweren und leichten Ketten, so dass nur die variablen Regionen jeder Kette Klonen erfordern. Die Transfektion von Zellen mit zwei unabhängigen Konstrukte (Co-Transfektion) ist die am häufigsten verwendete Ansatz für die Bereitstellung von schweren und leichten Kette kodierenden Gene. Das heißt, jedes Gen mit seinem eigenen Promotor transkribiert und als getrennte Antikörperketten angetrieben, bevor sie in das endoplasmatische Retikulum montiert. Auf der anderen Seite haben Mehr cistronische Vektoren IRES (IRES) -Elemente eingebaut , das mit Übersetzung aus dem inneren Regionen der mRNA 11 erlaubt die Expression von mehreren Genen als eine einzelne mRNA - Transkripts zu ermöglichen. In diesem Fall werden die schwere und leichte Kette kodierenden Gene in einer arrang gekoppeltenement Coexpression beider Antikörperketten zu erreichen , 10, 12. Während transient transfizierten Zellen ausreichend Protein ergeben eine begrenzte Anzahl von Versuchen durchzuführen, stabil transfizierten Zelllinien, die höhere Ausbeuten liefern Selektion für Genom-Integration unterzogen wurden. Höhere Proteinmengen ermöglichen Entwicklung Assay in - vitro - Charakterisierung im Zusammenhang und kann einen Hinweis auf Antikörper Qualität als Gegenleistung für Downstream - Anwendungen wie klonalen Zelllinie und Blei Kandidatenauswahl bieten. Das Ziel dieses Artikels ist die stabile Expression und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers in einem Säugerexpressionssystem zu beschreiben. Tatsächlich kann dieses Verfahren auf die Expression eines Antikörpers biosimilar angewendet werden. Das Verfahren kann für die anfängliche Charakterisierung von Antikörpern vor dem Fortfahren auf den kritischen, wenn auch zeitraubend Ste verwendet werdenps eines gewünschten Klon für größere Fertigungs identifizieren. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet werden, um andere Proteine ​​zu exprimieren und nicht nur Antikörper. Die folgende detaillierte Protokoll beschreibt die Expression therapeutischer Antikörper Trastuzumab. Diese besteht aus Zubereitung DNA des Vektors durch stabile Transfektion in HEK-293-Zelllinie und Reinigung von Antikörperprotein durch ein automatisiertes chromatographische Verfahren gefolgt.

<table><tbody><tr><td>pFUSE vector series</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.</td></tr><tr><td>mAbXpress vector series</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>pVITRO1 vector</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.&amp;nbsp; Refer to: Dodev, T. S. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>GS vector series</td><td>Lonza</td><td></td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa; was a gift from Andrew Beavil.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro Agar</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>Used to prepare low salt LB agar containing 75 &amp;micro;g/ml hygromycin.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>Used to prepare low salt TB broth containing 75 &amp;micro;g/ml hygromycin.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol, BioXtra, &amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td>Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at -80 &amp;deg;C until use.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>Transfection formulated serum-free media</td></tr><tr><td>Hygromycin B Solution</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone (casein peptone)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at 4 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.</td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid, monohydrate</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl solution pH 9.0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Used to buffer exchange and concentrate purified protein.</td></tr><tr><td>Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>45-5000</td><td>Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.</td></tr><tr><td>Protein A biosensors</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution</td><td>Astral Scientific</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate (APS)</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Dual-Color Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr></tbody></table>

laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Stabile Produktion von Trastuzumab durch transfizierte HEK-293 - Zellen wurde unter Verwendung von bio-Schicht Interferometrie bestätigt (BLI) , wie in Abbildung 1 dargestellt. Eine IgG - Standardkurve wurde durch Messung der Bindungsrate zwischen einer IgG - Antikörper und Protein A - Standard Biosensor (1A) erzeugt wird . Der rohe Überstand - Probe wurde in ähnlicher Weise gemessen, dann seine Konzentration aus der Standardkurve (1B)</stron...

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Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines therapeutischen Antikörpers in einem Säugetier-Expressionssystem. Die beschriebenen Verfahren umfassen Herstellung von Vektor-DNA, stabile Transfektion und Serum-freie Adaption eines menschlichen Linie embryonalen Nieren-293-Zelle, von großen Kulturen und Reinigung unter Verwendung von Affinitätschromatographie eingerichtet.

Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.3K Aufrufe.  University of Sydney.  Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines therapeutischen Antikörpers in einem Säugetier-Expressionssystem. Die beschriebenen Verfahren umfassen Herstellung von Vektor-DNA, stabile Transfektion und Serum-freie Adaption eines menschlichen Linie embryonalen Nieren-293-Zelle, von großen Kulturen und Reinigung unter Verwendung von Affinitätschromatographie eingerichtet. 

Serie: Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Forschung

Medizin

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Experimentelles Protokoll zum Nachweis<em&gt; Cyanobakterien</em&gt; In flüssigen und festen Proben mit einem Antikörper Microarray-Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Umwelt

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Krebsforschung

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Biotechnik

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Antikörper-Generierung: Herstellung monoklonaler Antikörper mit Hybridomen

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Lehre

JoVE Science Education

Fortgeschrittene Biologie

Grundlagen der Immunologie

Production and Purification of Recombinant Antibodies from Mammalian Cells

Source: Shivange, Gururaj, et al. <a href="https://app.jove.com/v/60727">Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen-Specific Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp.(2020).
The video explains the process of producing antibodies in mammalian host cells, from gene expression to secretion. It involves transcription, translation, signal recognition, correct folding, and eventual release into the extracellular medium via secretory vesicles.

Herstellung und Aufreinigung von rekombinanten Antikörpern aus Säugetierzellen

1. Expression and purification of antibodies

	Maintenance of CHO cells
	
		Grow CHO cells in FreeStyle CHO Media supplemented with commercially available ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Production and Purification

A Technique to Purify Monoclonal Antibodies Produced by Chinese Hamster Ovary Cells

Source: Velugula-Yellela, S. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58947">Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay for purifying monoclonal antibodies from cell culture fluid harvested from Chinese Hamster Ovarian cells. It employs a porous glass resin with immobilized protein A, which binds to the Fc region of the antibodies in the sample, effectively separating them from contaminants. The use of a low-pH elution buffer weakens the interaction, facilitating the retrieval of purified antibodies.

Eine Technik zur Aufreinigung monoklonaler Antikörper, die von Ovarialzellen des chinesischen Hamsters produziert werden

1. Purification of antibody
NOTE: The equilibration buffer for the in-house antibody is 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. The elution buffer used is 0.1 M ...

Antibody Production from a Batch Overgrowth Culture of Transfected Mammalian Cells

Source: Elgundi, Z. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
The video demonstrates a method for producing therapeutic antibodies using stably transfected mammalian cells. Tryptone supplementation stimulates cell division, resulting in overgrowth and supporting a higher antibody yield. The antibody-containing medium is harvested, filtered, and stored for further use.

Antikörperproduktion aus einer Batch-Überwucherungskultur von transfizierten Säugetierzellen

NOTE: A suitable mammalian expression vector must be used for this protocol. Here, a single construct containing two expression cassettes is used ...

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

Source: Elgundi, Z., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of antibody-containing fractions.

Eine Affinitätschromatographie-Technik zur Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern

1. Antibody Purification by Affinity Chromatography Using an Automated Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System
NOTE: The following procedure can ...