Die Autoren danken Finanzierung durch die Defense Threat Reduction Agency (DTRA) unter Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC PACIFIC) Vertrag Nr N6601-13-C-2027. Die Veröffentlichung dieses Materials stellt keine Genehmigung durch die Regierung der Ergebnisse und Schlussfolgerungen hier.

1. Hydrogels Bioink Formulierungen und Vorbereitung <ol><li> Um Gewebe-spezifische biochemische Profile zur Verfügung zu stellen, werden die Lösungen gewebespezifische ECM verdauen , wie zuvor für Leber beschrieben. 20 Hinweis: In der Regel wird diese ECM-Digest 40% des endgültigen Hydrogels bioink Volumen umfassen wird, die verwendet wird. Mehrere Hundert Milliliter ECM digest Lösung kann bei -80 ° C für zukünftige Verwendung hergestellt, aliquotiert und eingefroren werden. </li><li> Stand der Formulierung Hydrogel lösen einen Photoinitiator, 2-Hydroxy-4 &#39;- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenon, in Wasser bei 0,1% w / v. Anmerkung: Volumes in 50-100 ml Bereich kann vor der Zeit hergestellt werden, und von Licht bei 4 ° C mehrere Monate gelagert abgeschirmt. </li><li> Um Hydrogel bioinks bilden, lösen sich zunächst die Basismaterialkomponenten aus der Hyaluronsäure (HA) Hydrogel-Kits im Wasser-Photoinitiator-Lösung. <ol><li> Man löst den thiolierten HA und thiolierten Gelatine separat in Wasser-photoinitiator Lösung (Schritt 1.2) auf 2% w / v-Lösungen. </li><li> Auflösen Polyethylenglykoldiacrylat (PEGDA), der Vernetzer in der Hydrogel-Kits, in Wasser-Photoinitiator-Lösung (Schritt 1.2) eine 8% w / v-Lösung zu machen. </li><li> Auflösen Polyethylenglycol (PEG) 8-Arm Alkin (10 kDa MW) in wasserPhotoInitiator-Lösung (Schritt 1.2) eine 8% w / v-Lösung zu machen. </li></ol></li><li> In der Regel bilden Hydrogele das folgende Schema verwenden, obwohl zusätzliche Anpassungen möglich ist. <ol><li> Kombinieren Sie 4 Teile 2% thiolierten HA, 4 Teile 2% thiolierten Gelatine, 1 Teil Vernetzer 1, 1 Teil Vernetzer 2 mit 8 Teilen Gewebe ECM-Lösung und 2 Teilen Hepatozyten Kulturmedien (HCM) (oder 10 Teile Wasser als allgemeine Nicht-Gewebe -spezifische Hydrogel). Hinweis: Weitere unmodifizierten HA oder Gelatine können hinzugefügt werden, die bioink extrudieren mehr reibungslos zu machen. Dies wird nachfolgend beschrieben. </li></ol></li><li> Vortex, um die resultierende Mischung auf hohe (Geschwindigkeit 10 von 10) für 10 Sekunden vor mischen. &lt;/ Li&gt; <li> Die Verwendung von Hydrogel bioink <ol><li> Für die Extrusion oder Bioprinting Tests, übertragen der Mischung in eine Spritze oder eine Druckerkassette und lassen es bei 37 ° C spontan für 30 min (Stufe 1 Vernetzung) zu vernetzen. </li><li> Für rheologische Messungen, übertragen Sie die Mischung in eine 35 mm Petrischale und lassen Sie es 30 Minuten zu vernetzen. Anmerkung: Die Mischung sofort durch Thiol-Acrylat-Bindungsbildung zu vernetzen beginnt, und beginnt in der Viskosität zu erhöhen. Die Mischung sollte auf eine Spritze, Druckkassette, oder Zielstelle innerhalb von 10 min übertragen Verstopfen einer Pipette oder einer Spritze während der Übertragung zu vermeiden. </li><li> Wenn sekundäre Vernetzung (Stufe 2) gewünscht wird, bestrahlen , um die Stufe 1-vernetzte Gele mit UV - Licht (365 nm, 18 W / cm 2) mit einem Thiol-Alkin - Polymerisationsreaktion zu initiieren. Hinweis: Dauer der Bestrahlung auf der Oberfläche des Materials abhängig ist. Im Allgemeinen wird ein Quadratzentimeter Material erfordert nur 1-2 sec UV-Exposition bei dieser UV-Leistung. </li></ol></li></ol> 2. Druckerkompatibilitätstests <ol><li> Vor der Integrationstests mit Bioprinting Geräte, Testextrusionseigenschaften auf dem Labortisch mit einfachen Extrusionstests mit Standardspritzen und kleine Gauge-Nadel Spitzen (20-30 gauge). <ol><li> Schieben Sie die bioink durch eine Standardspritze zu erreichen glatt extrudierten Filamente aus Hydrogel mit wenigen oder keinen Stößen. Extrudieren von Linien oder einfache Muster genügt Erfolg zu bestimmen. </li></ol></li><li> Für bioprinter Integration, laden bioink Vorbereitungen, indem sie in Druckerpatronen Pipettieren und lassen 30 min für die bioink spontane Stufe 1 Vernetzung innerhalb der Kassette zu unterziehen. Hinweis: Volumen der bioink von der speziellen Anwendung abhängig und sollte durch den Benutzer bestimmt werden. Druckerpatronen ähneln oder sein Spritzen können, die mit dem bioprinter Gerät kompatibel sind. </li><li> Bewerten Extrusion Kompatibilitätfür Bioprinting durch ein einfaches Muster Drucken des bioink verwenden. Zum Beispiel, drucken Sie ein 7 x 7 mm Muster aus parallelen Linien besteht. Anwendungsdruck (beispielsweise 20 kPa pneumatischer Druck) während der Druckkopf bewegt sich in der XY - Ebene mit einer Geschwindigkeit von etwa 300 mm / min. Hinweis: Die Druckkopfdüsendurchmessern von verschiedenen Größen verwendet werden können, aber konische Düsen mit 400-500 um Durchmesser Öffnungen sind optimal für den Druck Sphäroide in der 250-350 um-Bereich. <ol><li> Wenn die extrudierten Materialien klumpig oder unregelmäßig sind, siehe 2.4 Schritt, oder die Menge an PEGDA reduzieren, um die Stufe 1 vernetzte Material zu erweichen. Richtig vorbereitet bioink Formulierungen extrudieren glatt, in gewünschten Mustern oder Architekturen präzise Abscheidung ermöglicht. Hinweis: Die Bioprinting beschriebenen Verfahren Verwendung eines benutzerdefinierten 3-D Bioprinting Gerät im Haus speziell für Gewebe konstruieren Druck 32 Als solche spezifischen Druckparameter dramatisch variieren je nach Gerätetyp und erfordern testin.g durch den Benutzer. </li></ol></li><li> Zur Verbesserung der Extrusionseigenschaften ergänzen unmodifizierte HA und Gelatine zu den bioinks (1,5 mg / ml und 30 mg / ml, jeweils). </li></ol> 3. Validierung von Bioprinting mit primärem Leber Konstrukten <ol><li> Bereiten Sie 3-D Primärzelle Leber Sphäroiden Tropfen hängen Methoden wie der Zellkomponente 33 Hinweis: Bioprinting kann ohne Sphäroiden durchgeführt werden, sondern mit einzelnen als auch in den Hydrogel bioinks suspendierten Zellen. Sphäroide werden hier verwendeten Zell-Zell-Wechselwirkungen zu beschleunigen und Funktionalität zu konstruieren. Die Anzahl von Sphäroiden oder Zellen eingesetzt wird, hängt von der spezifischen Anwendung und sollte durch den Benutzer bestimmt werden. Diese Schritte sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, unter Verwendung von Sterilgut. <ol><li> Bereiten Sie HCM durch die aufgetauten Inhalte der HCM Ergänzung Komponenten-Kit auf den Hepatozyten-Basalmedium Zugabe (HBM) und Sterilfiltration. <ol><li> Auftauen Ergänzung Komponenten until Flüssigkeit. </li><li> Fügen Sie die Ergänzung Komponenten (Ascorbinsäure, 0,5 ml; Rinderserumalbumin [fettsäurefrei], 10 ml, Gentamicin-Sulfat / Amphotericin B, 0,5 ml; Hydrocortison 21-Hemisuccinat, 0,5 ml; Insulin, 0,5 ml; menschliche Faktor rekombinante epidermale Wachstums 0,5 ml; Transferieren, 0,5 ml) in den 500 ml HBM. </li><li> Sterilfilter durch einen 0,45 &amp; mgr; m oder 0,22 &amp; mgr; m Filter eine Flaschenaufsatz-Filter-Einheit oder ein Spritzenspitze Filter. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Zelldichte von primären humanen Hepatozyten, Kupffer-Zellen und Sternzellen, indem Sie auf einem Hämocytometer gezählt, nachdem jeder Zelltyp &quot;Anweisungen nach Herstelleraufgetaut wurde. </li><li> Kombinieren primären humanen Hepatozyten, Kupffer-Zellen und Sternzellen in einem 80:10:10 Verhältnis von Zellzahl in HCM Medien, die auf 37 ° C in einem konischen Rohr erwärmt worden ist. Hinweis: Das Volumen der Medien verwendet werden, hängt von der Gesamtzellzahl der spezifisch auf die Anwendung und sollte von th bestimmt werdene Benutzer. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 Minuten bei 520 · g bei 20 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren, hinter dem Zellpellet zu verlassen. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in HCM Medium eine Zellsuspension mit 1.000 Zellen pro 40 ul Medium zu ergeben. Gesamtvolumen ist abhängig von der Anzahl von Sphäroiden hergestellt wird. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf 96-Well-Format hängenden Tropfen Platten. In insgesamt rund 1000 Zellen in jede Vertiefung in HCM und halten bei 37 ° C, in 5% CO 2 für 3 Tage , während der mehrzelligen Sphäroiden bilden. </li><li> Sammeln Leber Sphäroiden aus dem hängenden Tropfen Platte mit einer Pipette verwenden. Transfer zu einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen. </li></ol></li><li> Bioprint Leber Sphäroiden in leberspezifischen Hydrogel bioink <ol><li> Bereiten Sie eine Formulierung von Leber ECM-haltigen Hydrogel bioink wie in Schritt 1 beschrieben, unter Verwendung von 8% PEGDA und 8% 8-Arm PEG Alkin als Vernetzer. Verwenden Sie diese Kombination für seine Fähigkeit, in resulting in einem Hydrogel Nähe in Scherelastizitätsmodul zu nativen Lebergewebe. </li><li> Lassen Sie die Sphäroiden auf den Boden des konischen Rohrs absetzen, in dem sie in Schritt 3.1.7 gelegt wurden. Dies variiert je nach Sphäroid Größe und Dichte, sondern erfolgt in der Regel innerhalb von 1-2 min. Entfernen Sie alle Medien durch vorsichtiges Absaugen oder mit einer Pipette. </li><li> Übertragen, um das gewünschte Volumen an frisch hergestellten Hydrogels bioink Lösung des konischen Röhrchen, enthaltend die Sphäroide. Im allgemeinen wird ein geeignetes Volumen von 10% bis 25% größer als das Volumen des 3-D-Konstrukt gedruckt werden. Pipette vorsichtig nach oben und unten die Sphäroiden in dem Hydrogel bioink Lösung zu suspendieren. Transfer zu einem bioprinter Patrone eine Pipette oder serologische Pipette. </li><li> Im Inneren der Patrone bioprinter ermöglichen die Lösung der ersten Vernetzungsstufe (thiol-Acrylat-Reaktion) für 30 min zu unterziehen. Hinweis: Je nach Größe Sphäroid kann die Patrone müssen langsam gedreht werden oder die Inhalte müssen mit gemischt werdenein sterilen Spatel die Sphäroiden im gesamten bioink während der Phase 1 Vernetzung verteilt zu halten. Dies ist weniger eine Notwendigkeit für bioinks mit suspendierten Zellen hergestellt anstelle von Sphäroiden. Hinweis: Nach der Stufe 1 Vernetzung haben die Benutzer ein Betriebsfenster von mehreren Stunden. Es wird jedoch empfohlen, schnell den Bioprinting Prozess auszuführen Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. </li><li> Nach der Stufe 1 Vernetzung verwenden, um eine Bioprinting Vorrichtung gewünschten Hydrogel Strukturen zu schaffen, die primären Leber Sphäroiden (oder andere Zellen) enthält. Anmerkung: Diese Technologie stellt ein System für eine breite Vielfalt von Strukturen biofabricating. Parameter wie Gesamtmenge, die Anzahl von Zellen oder Sphäroide, die gedruckte Strukturgeometrie und Substrat, auf dem gedruckt werden Konstrukte sind von den Zielen des Benutzers abhängig. </li><li> Nach der Abscheidung in die gewünschte Konfiguration, UV-Licht für 2-4 sec verabreichen, um die sekundären Vernetzungsmechanismus, der Stabilisierung des co einzuleitennstructs und zunehmende Steifigkeit auf das gewünschte Niveau. Anmerkung: Die Konzentration von PEG-Alkin, und damit die Gesamt endgültige Vernetzungsdichte steuert in erster Linie die endgültige Konstrukt Steifigkeit. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4 und 3.2.5, um vielschichtige Konstrukte zu erstellen. </li></ol></li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt mehrere Komponenten , die kritisch sind, die bei der 3-D - Gewebekonstrukte zu biofabricate versucht, für eine eventuelle Verwendung beim Menschen oder für in - vitro - Screening - Anwendungen. Unter Verwendung der geeigneten zellulären Komponenten bestimmt das Ende Potential Funktionalität, während die biofabrication Gerät selbst zum Erreichen des Endes Konstrukt die allgemeine Methode bestimmt. Die dritte Komponente, die Biomaterial, ist ebenso wichtig, da es eine Doppelrolle dient. Ins...

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung stehen, die die Notwendigkeit für alternative Quellen von funktionellen Organe und Gewebe durch den Versuch, die Herstellung oder biofabricate Adressen, ihnen. Bioprinting als eines der vielversprechendsten dieser Technologien entstanden. Bioprinting kann als eine Form der Herstellung von biologischen Teilen robotic additive gedacht werden, die verwendet werden zur Erstellung oder Muster tragfähige organartige oder gewebeähnlichen Strukturen in drei Dimensionen. 1 In den meisten Fällen verwendet Bioprinting eine 3-dimensionale (3 -D) Druckgerät , das von einem Computer gerichtet ist , Zellen und Biomaterialien in genaue Positionen zu deponieren, damit rekapituliert anatomisch imitiert physiologischen Architekturen. 2 Diese Geräte besitzen einen &quot;bioink&quot; drucken, die die Form von Zellaggregaten erfolgen kann, in Hydrogele eingekapselten Zellen oder viskose Flüssigkeiten oder Zell ausgesät Microcarriern sowie zellfreie Polymere, die mechanische Struktur oder als zellfreie pla liefernceholders. 3,4 Nach dem Bioprinting Verfahren kann die resultierende Struktur in funktionelle Gewebe oder Organstrukturen gereift werden, und für die beabsichtigte Endanwendung verwendet. 5,6 Bis heute eine vollständige voll funktionsfähige menschliche Größe Orgel wurde nicht gedruckt, aber es bleibt die primäre langfristige Ziel von Bioprinting Forschung und Entwicklung. 2 jedoch kleine &quot;organoide&quot; Gewebekonstrukte sind derzeit in einer Reihe von Anwendungen implementiert werden, einschließlich der Pathologie Modellierung, Entwicklung von Arzneimitteln und Toxikologie - Screening. Eine der wichtigsten Hürden, die Forscher bei der Anwendung Bioprinting Technologie begegnet ist, dass nur sehr wenige Materialien für den ausdrücklichen Zweck der Bioprinting entwickelt. Um effektiv in Bioprinting erfolgreich zu sein, muss ein Biomaterial 4 grundlegende Anforderungen erfüllen. Das Biomaterial muss 1) die entsprechenden mechanischen Eigenschaften zu haben Abscheidung zu ermöglichen (es durch eine Düse als Gel Extrusion oder ein inkjet als Tröpfchen), 2) die Fähigkeit, seine Form als Bestandteil eines 3-D-Struktur nach der Abscheidung zu halten, 3) die Fähigkeit zur Benutzersteuerung der 2 vor Eigenschaften, und 4) eine Zelle freundlich und unterstützenden Umgebung überhaupt Phasen des Bioprinting Verfahren. 7 Historisch Bioprinting Arbeit versucht hat , oft bestehenden traditionellen Biomaterialien in Bioprinting Geräte ohne Rücksicht auf ihre Kompatibilität zu verwenden, anstatt ein Biomaterial von der Gestaltung der notwendigen Eigenschaften für Bioprinting und anschließende Post-Druckanwendungen zu haben. Eine Vielzahl von bioinks wurden vor kurzem eine bessere Schnittstelle mit der Abscheidung und Fertigung Hardware entwickelt. Standard-Hydrogel-Systeme stellen erhebliche Probleme, da sie in der Regel entweder als Vorläufer Fluidlösungen mit unzureichenden mechanischen Eigenschaften bestehen, oder polymerisiert Hydrogele, die auf den Extrusionsprozess Düsen oder werden verstopfen aufgebrochen, wenn gedruckt werden. Unser Team, sowie others wurden verschiedene Hydrogel - Formulierungen untersucht , diese Bioprinting Probleme, einschließlich Zell - Sphäroiden Druck in Hydrogel - Substrate, 5,8 - Zelle und Hydrogel Filamentextrusion von Mikrokapillarröhrchen, 9-11 extrudierbaren Hyaluronsäure (HA) -gold Nanopartikel Hydrogele mit dynamischen Vernetzungseigenschaften zu adressieren 12 zeitliche Steuerung des Hydrogels Steifigkeits photopolymerisierbaren Verwendung methacrylierte HA und Gelatine, 13 Fibrinogen-Thrombin-basierten Vernetzung 14,15 Ionenaustausch Alginat-Kollagengele, 16 und kürzlich schnelle polymerisierenden ultraviolettem Licht (UV) initiierten Vernetzung 17 Diese Beispiele demonstrieren die Durchführbarkeit der Erzeugung von Materialien, die effektiv bioprinted durch kann. Doch neben der Integration mit Hardware, um erfolgreich zu generieren tragfähige und funktionelle 3-D-Gewebekonstrukte müssen Biomaterialien enthalten biochemische und mechanische Signale, dass die Hilfe bei der Aufrechterhaltung der zellulärenLebensfähigkeit und Funktion. Diese zusätzlichen Faktoren, biochemische und mechanische Profile können einen wesentlichen Einfluss auf die erfolgreiche Funktion von bioprinted Gewebekonstrukte. Beide Zellen und die native extrazelluläre Matrix (ECM) sind verantwortlich für eine Vielzahl von Signalmolekülen, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren und anderen Cytokinen auf andere Zellen zu präsentieren. Die Kombination dieser Signale variiert von Gewebe zu Gewebe, kann aber bei der Regulierung der Zell - und Gewebeverhalten extrem potent und einflussreich. 18 gewebsspezifische ECM Komponenten aus verschiedenen Organen und Umsetzung als Hydrogel oder als Teil eines Hydrogels erforscht worden Einsatz mit Erfolg. 19-21 Dieser Ansatz, der von Dezellularisieren einer gegebenen Gewebe besteht, Pulverisieren, und es löst, können gewebespezifische biochemische Signale von jedem Gewebe zu erzeugen , und kann in 3-D - Hydrogel - Konstrukte eingebaut werden. 22 verwendet werden , Zusätzlich,es wird allgemein dokumentiert , dass Gewebe in dem Körper eine Vielzahl von Steifigkeiten besetzen. 23 als solche, die Fähigkeit , die mechanischen Eigenschaften von Biomaterialien, wie beispielsweise Elastizitätsmodul E &#39;oder Scherelastizitätsmodul G&#39;, abzustimmen ist ein nützliches Werkzeug in Tissue Engineering . Wie oben beschrieben, ermöglicht die Kontrolle über bioink mechanischen Eigenschaften für die Extrusion basierte biofabrication ein weiches Gel, das durch sekundäre Vernetzung zu einem späteren Zeitpunkt dann weiter manipuliert werden kann, an dem Elastizitätsmodul Niveaus erreicht werden kann, dass die von dem Zielorgan Typ entsprechen. Zum Beispiel könnte Biomaterialien angepasst werden wie eine native Leber eine Steifigkeit von 5-10 kPa entsprechen, 23 oder eine Steifigkeit von 10 bis 15 kPa wie native Herzgewebe entsprechen, 24,25 in der Theorie Erhöhung der Fähigkeit dieser Organoiden funktionieren in eine ähnliche Art und Weise in ihre Heimat Gewebe Pendants. Der Einfluss von Umwelt Steifigkeit auf Zell-Phänotyp wurde explored in den letzten Jahren, insbesondere im Hinblick auf Stammzellen. Engler et al. Zeigten , dass die Substrat - Elastizitätsantriebs mesenchymalen Stammzellen Aided (MSC) in Richtung Abstammungslinien mit Gewebeelastizität der des Substrats übereinstimmt. 25 dieses Konzept weiter zur Differenzierung in Muskel untersucht worden ist, die Herzfunktion, Leber Phänotyp, hämatopoetische Stammzellproliferation und Wartung der Stammzell therapeutisches Potential. 24,26-29 ein Hydrogel zu unterschiedlichen Elastizitätsmoduln abzustimmen In der Lage ist ein wichtiges Merkmal eines Biomaterials , das Gewebekonstrukte werden verwendet wird biofabricate. 30 Hier beschreiben wir ein Protokoll, das einen vielseitigen Ansatz in unserem Labor für eine Hydrogel-System zu formulieren, die Extrusions bioprinted werden kann und angepasst auf 1) enthalten, die biochemische Profil eines bestimmten Typs Gewebe und 2) ahmen den Elastizitätsmodul dieser Gewebeart . Durch diese Anforderungen adressieren, wollen wir provide ein Material, das die physikalisch - chemischen und biologischen Eigenschaften von in vivo Gewebe rekapitulieren kann. 31. Das modulare Hydrogel beschrieben Verbundsystem nimmt hier den Vorteil eines Mehrvernetzungs Ansatz extrudierbaren bioinks zu ergeben, und ermöglicht eine Nachvernetzung zu stabilisieren und erhöht die Steifigkeit der Endprodukte eine Reihe von Gewebetypen zu entsprechen. Biochemische Anpassung wird durch die Verwendung gewebespezifischer ECM-Komponenten erfüllt. Als Demonstration, beschäftigen wir eine leberspezifische Vielfalt dieses Hydrogelsystem funktionelle Leber organoiden Konstrukte Bioprint. Das Protokoll beschrieben verwendet eine benutzerdefinierte 3-D Bioprinting Gerät. Im Allgemeinen kann dieses Protokoll zu den meisten Extrusionsbasierte Drucker, bestimmte Druckparameter variiert durch den Benutzer für jeden Gerätetyp und erfordern Tests drastisch angepasst werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Wenn die oben beschriebenen Verfahren korrekt befolgt werden, Hydrogele ein biochemisches Profil spezifisch auf die Zielgewebetyp enthalten sollte, damit 20 für einen hohen Grad an Kontrolle über Bioprinting und letzten Elastizitätsmodul, 34 und lebensfähigen funktionellen Zellen in Gewebekonstrukten unterstützen. Hydrogele Customization Um am besten imitieren nativen Leber, d...

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Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Wir beschreiben eine Reihe von Protokollen , die zusammen stellen eine gewebe nachahmt Hydrogel bioink mit dem funktionelle und tragfähige 3-D Gewebekonstrukte zur Verwendung in in vitro - Screening - Anwendungen bioprinted werden kann.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.6K Aufrufe.  Wake Forest Univeristy Health Sciences.  Wir beschreiben eine Reihe von Protokollen , die zusammen stellen eine gewebe nachahmt Hydrogel bioink mit dem funktionelle und tragfähige 3-D Gewebekonstrukte zur Verwendung in in vitro - Screening - Anwendungen bioprinted werden kann. 

Serie: Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Synthese einer Intein-vermittelten Protein-Hydrogel Künstliche

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Forschung

Biotechnik

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

Design eines 3D-Druckers für Open-Source- und Low-Cost-Bioink und Lebensmittelschmelzextrusion

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by shear stress and improve the survival of the encapsulated cells. However, rapid gravity-driven cell sedimentation in the reservoir could lead to an inhomogeneous cell distribution in bioprinted structures and therefore hinder the application of liquid-like bioinks. Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (e.g., gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells. Multiple liquid interfaces were manipulated in the multilayered bioink to provide interfacial retention. Consequently, the cell sedimentation action going across adjacent layers in the multilayered system was retarded in the bioink reservoir. It was found that the interfacial retention was much higher than the sedimental pull of cells, demonstrating a critical role of the interfacial retention in preventing cell sedimentation and promoting a more homogeneous dispersion of cells in the multilayered bioink.

Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells.

Verwendung von mehrschichtigem Hydrogel Bioink im dreidimensionalen Bioprinting für homogene Zellverteilung

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...