Wir möchten Unterstützung von Operational Support der Infrastruktur-Programm der Regierung von Victoria zu bestätigen, das Australian Research Council Linkage Projekte Scheme (mit Agilent Technologies), der Australian National Health und Medical Research Council, das viktorianische Hirnbank, Cooperative Research Centre for Mental Health und der Neuroproteomics Einrichtung.

1. Herstellung von Puffern und Proben <ol><li> Bereiten 500 ml Puffer, 200 mM Ammoniumnitrat pH 7,6-7,8 (pH mit Ammoniumhydroxid eingestellt (NH 4 OH)) mit Cäsium (Cs) und antinomy (Sb) zu einer Endkonzentration von 10 ppb. Verwenden Cäsium und antinomy als interne Standards für jede Drift in der Reaktion von ICP-MS zu überwachen. Filter Puffer vor durch ein 0,22 um-Filter zu verwenden. </li><li> Bereiten Probe in Abhängigkeit von der Art der Probe: flüssig, Gewebe- oder Zellkultur. <ol><li> Für Proben , die Homogenisierung erfordern (zB Gewebe oder Zellen), stellen Sie sicher , dass sie nicht enthalten Reinigungsmittel. Verwenden Tris-Puffer für die Probenvorbereitung. Alternativ können Phosphatpuffer , aber sie können sich negativ auf die metalloproteome im Laufe der Zeit oder mit Gefrier - Auftau - Zyklen 12 beeinflussen. </li><li> Homogenisieren Gewebe- oder Zellkulturproben durch manuelle Dounce oder Beschallung für 5 min unter Verwendung von Tris-gepufferter Kochsalzlösung (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM Natriumchlorid(NaCl) + Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Inhibitoren freie Protease). </li><li> Klärung Homogenate durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 5 min. Sammeln Sie die resultierende Überstand. Halten Proben bei 4 ° C. Hinweis: Alle Proben müssen vor dem Laden in die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Fläschchen zentrifugiert werden Partikel zu verhindern, dass der Grßenausschlußchromatographie (SEC) Säule blockiert. </li></ol></li><li> Normalisieren der Gesamtmenge an Protein auf der Säule für die Proben geladen. Bestimmen Proteinkonzentrationen bei 280 nm ein Mikrovolumen UV - Spektralphotometer 13. Last zwischen 20 und 150 &amp; mgr; g Protein. Verwenden Sie typische Injektionsvolumina im Bereich von 2 bis 80 &amp; mgr; l in Abhängigkeit von der Probenkonzentration. <ol><li> Reinigen Sie den Probenarm des Mikrovolumen UV-Spektrophotometer mit destilliertem Wasser vor der Probenbeladung. Der Probenarm ist, wo die Proteinproben geladen werden. </li><li> Blank das Instrument gegen 2 ul the-Probenpuffer. Dann Last 2 ul jeder Probe auf den Arm und messen der Extinktion bei 280 nm. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentrationen. Rohprotein Proben, einen Extinktionskoeffizienten von 1 Abs = 1 mg / ml verwendet werden. Um die Konzentration von Protein in den Proben zu bestimmen, verwenden das Beer-Lambert Gesetz, A = ε xlxc, wobei A die Extinktion ist, ε der Extinktionskoeffizient ist, L die Weglänge in Zentimetern und c ist die Konzentration. </li></ol></li></ol> 2. Massenanalyse von Metalloprotein Standards mit induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie <ol><li> Warm-up und stimmen die Instrumentenherstellers Protokolle. </li><li> Sobald Instrument wird erwärmt und abgestimmt, führen Sie Bulk-ICP-MS. Hinweis: Auf Lösungen von gereinigtem Metalloproteine ​​im Allgemeinen vor der Messung verdünnt werden müssen. Metall Stöchiometrien und der geschätzten Protein concentra: die Metallkonzentration des Standards kann aus der bekannten Protein abschätzbartion. Diese Informationen können verwendet werden, um die Verdünnung zu bestimmen, die geeignet sein wird, erzeugt im Bereich der Standardkurve fallen. <ol><li> Verdünnte Metalloprotein Standards, Thyroglobulin, Ferritin, Ceruloplasmin, Cu / Zn - SOD und Vitamin B 12, um sicherzustellen , dass sie im Bereich von 0 fallen - 500 ug / l, mit 1% Salpetersäure. Um das zu erreichen Standards in diesem Bereich, verwenden Sie keine Verdünnungen von mehr als 1 in 20 in Wasser durchführen Reihenverdünnungen die Bestände vor, dies zu verdünnen, falls erforderlich. </li><li> Legen Sie die Reihenfolge der Injektionen auf. Zunächst analysieren die sieben Kalibrierniveaus, Konzentrationen im Bereich von 0 bis 500 ug / l, die von den Metalloprotein Standards gefolgt. Die sieben Kalibrierungswerte sind 0, 1, 5, 10, 50, 100 und 500 ug / L. </li><li> Wählen Sie Elemente von Interesse. Hier verwenden Fe, Cu, Zn, Co und I, da sie die Elemente sind, dass die Protein-Standards gebunden. Wählen Sie die Elemente in der Erwerbsmethode durch die Elementauswahl Registerkarte Öffnen und Hinzufügen der eleme<html> nts und ihre jeweiligen Isotopenmassen, die analysiert werden sollen. </li><li> Führen Sie die Probenanalyse mit dem Instrument und der Geräte-Software erstellt automatisch die Kalibrierungskurven für jedes der Elemente analysiert. Die Eichkurven werden durch die Software erstellt, indem die Zählungen / sec der gegen die Menge an Metall detektiert Metall aufgetragen, die den Standard gemeint ist enthalten, in ug / l. Mithilfe der Eichkurven die Konzentration des Metalls in den unbekannten Proben zu bestimmen. Anmerkung: Unter Verwendung der Kalibrierungskurve, bestimmt die Software, um die Konzentration des Metalls in jedem der Metalloprotein Standards. </li><li> Aus den bulk Analyseergebnisse Metalloprotein Standards, die die drei am häufigsten vorkommenden Spurenelemente in Säugetiergewebe unter Verwendung einer Mischung von Cu, Zn-Superoxid-Dismutase (SOD), verdünnt auf 200 ug / L von Kupfer und Zink und Ferritin (FTN) an einer abschließenden umfassen erzeugen Konzentration von 2000 ug / l Eisen. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. HPLC System-Setup und Grßenausschlußchromatographie Äquilibrierung der Säule Anmerkung: Dieser Abschnitt sollte parallel zum vorhergehenden durchgeführt werden, da sie beide etwa 1 erforderlich - 1,5 Stunden durchzuführen. <ol><li> Purge HPLC-Pumpen mit Puffer in Schritt 1.1 und reinigen die Pumpen für 5 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min. </li><li> Sobald das System gespült wird, stellen Sie den Durchfluss bei 0,1 ml / min und schließen Sie die Größenausschluss-Säule (4,6 x 300 mm, 3 &amp; mgr; m, 150 Å). Hinweis: Eine nasse Verbindung zwischen dem Rohr und der Säule vermeidet jegliche Luftblasen während der Verbindung der Säule eingefangen wird. </li><li> Verbinden Sie das andere Ende der Säule mit dem UV-Detektor eingestellt Absorption bei 280 nm zu messen PEEK Schläuche verwenden. </li><li> Nach und nach die Geschwindigkeit in Schritten von der Säulenfluss erhöhen von 0,05-0,1 ml / min bis zu einer endgültigen Fließgeschwindigkeit von 0,4 ml / min erreicht wird. Während dies geschieht, überprüfen Sie die Schlauchverbindungen auf die Säule auf Lecks. Überwachen Sie den Druckes überschreitet nicht die Spalte Anforderungen sicherzustellen des Systems durch das Chromatogramm in der Software der Druckverlauf zu beobachten. </li><li> Lassen Sie die Spalte mit der erforderlichen Strömungsgeschwindigkeit über 5 äquilibrieren - 10 Säulenvolumen. Nachdem sie ins Gleichgewicht gebracht wird, schließen Sie die Instrumente Probenanalyse auftreten zu lassen. </li><li> Stellen Sie die HPLC-Methode nach oben nach oben Puffer A über die Säule bei 0,4 ml / min für 15 min zu pumpen. </li></ol> 4. Einrichten und Größenausschluss Running - Induktiv gekoppeltes Plasma - Massenspektrometrie Hinweis: Betriebsverfahren kann variieren zwischen den Instrumenten und Modellen. Kontaktieren Sie das Instrument technischer Spezialist mehr darüber zu erfahren, wie die ICP-MS verwendet zu konfigurieren ist. <ol><li> Legen Sie die ICP - MS in den Standby-Modus, bevor Sie die Hardware-Einstellung zu ändern. <ol><li> Im Standby-Modus, schalten Sie die Kommunikation für die Autosampler aus und ändern Sie die Probe Einführung in die &quot;andere&quot;. Hinweis: Je nach Software und hartware Konfigurationsauswahl &quot;HPLC&quot; als Probeneinführungsquelle kann verwendet werden. Kontaktieren Sie das Instrument technischen Spezialisten zu lernen, wenn diese Option verfügbar ist. </li></ol></li><li> Verwenden Sie PEEK-Schlauch (ID 0,13 mm), um den Ausfluss aus dem UV-Detektor zum direkten Anschluss an den Zerstäuber auf dem ICP-MS. </li><li> Schalten Sie den ICP sichern - MS und lassen Sie das Gerät für 10 zum Aufwärmen - 20 min. </li><li> Nachdem das Plasma gezündet hat, schließen Sie das Remote-Kabel von der ICP - MS auf der Rückseite des HPLC-Autosampler. Tun Sie dies einmal das Plasma gezündet hat; andernfalls wird das HPLC-System automatisch, da die ICP heruntergefahren - MS nicht eingeschaltet ist. </li><li> Ändern Sie die ICP-MS-Methode zur Erfassung von Daten für die LC-ICP-MS. <ol><li> Alter der Erwerbsmethode von Spektrum zu Zeit resolve Erfassung (TRA). </li><li> Wählen Sie die Elemente analysiert werden, Fe, Cu, Zn, Co, I sowie andere Elemente von Interesse, und setzen Integrationszeiten (in der Regel zwischen 0,05 bis 0,3 sec). Nachdem die Elemente von Interesse einRe gewählt, stellen Sie die Erfassungszeit die Laufzeit für die Chromatographie zu entsprechen (zB 900 sec für eine 15 - min - Chromatographie - Lauf). </li><li> Manuelles Einstellen der ICP - MS für die Empfindlichkeit und Kollisionszelle Helium (He) Gasflussraten mit dem Puffer-Chromatographie fließt unter Verwendung von Cs und Sb in dem Puffer enthalten. Die He Strömungsraten liegen typischerweise ~ 1 ml / min weniger als die für die Massenanalyse verwendet. Sobald die Metallionenzählungen stabilisiert haben und die relative Standardabweichung (RSD) Werte unter 5%, ist das System betriebsbereit. </li></ol></li><li> Machen Probe laufen Listen sowohl in der HPLC und ICP-MS-Software-Programme. Die Probe Laufliste enthält die Reihenfolge, in der jeder der Proben ist ebenso wie der Name injiziert werden, mit dem die Daten gespeichert werden. Überprüfen Sie, dass die Gesamtzahl der Proben, die in der Liste Übereinstimmung zwischen den beiden Programmen. </li><li> Starten Sie den Probencharge für das ICP-MS vor der HPLC, wie die Injektion der Probe durch HPLC wird das ICP auslösen - MS zu starten SammelDaten. Wenn dies nicht in der richtigen Reihenfolge durchgeführt wird, wird es in fehlenden Daten führen. </li><li> Generieren Kalibrierungskurve Punkte durch Variation Volumina der SOD und FTN gemischten Standard von 200 ug / l bis 6000 ug / l Injektion injiziert auf Spalte für Cu &amp; Zn und 2000 ug / l bis zu 60.000 g / L für Fe. Injektionsvolumina im Bereich von 1 bis 30 &amp; mgr; l. Anmerkung: Diese Konzentrationsbereiche umfassen, die Konzentrationen von Fe, Cu und Zn in der Regel komplexe Homogenaten beobachtet. Bei Proben, die nur gereinigte Proteine ​​die maximale Reichweite der Kurve enthalten sollte entsprechend angepasst werden. Da die Menge an Metall, die mit dem Protein assoziiert ist, einen kleineren oder größeren Bereich erfordern, da es weniger Verunreinigung in der Probe von anderen Faktoren. </li><li> Analysieren jedes der unbekannten Proben Gewebe, Plasma oder Zellkultur. </li></ol> 5. Datenanalyse, Manipulation und Visualisierung <ol><li> Speichern Sie die Daten im Comma Separated Value (CSV) Dateiformat und laden into Verarbeitungsprogramme wie erforderlich. </li><li> Damit Instrument Drift zu steuern, teilen Sie die Zählungen pro Sekunde für jedes Element durch die Zählungen pro Sekunde für entweder Cs oder Sb. </li><li> Erzeugen Eichkurven für jedes der Elemente. <ol><li> Bestimmung der Fläche unter der Metall peak, der dem entspricht, der Metalloprotein es für jede der Einspritzungen durch Ausführen Peakintegration in der bevorzugten Datenanalyse-Software gebunden ist. </li><li> Plotten der Fläche unter dem Peak Metall gegen die Gesamtmenge des Metalls, die auf die Säule in jedem Durchlauf injiziert wurde, 200 - 6,000 ug / l für Cu und Zn und 2,000 - 60,000 &amp; mgr; g / L für Fe. Führen der linearen Regressionsanalyse nach der Software-Protokoll. </li><li> Verwenden Sie die Steigung ergibt sich aus der linearen Regressionsanalyse als Faktor zählt zu konvertieren pro Sekunde pg / sec. Teilen jede der Zählungen pro Sekunde Datenpunkte über das Chromatogramm, das durch den Gradienten des Linienwert. </li></ol></li><li> Graph, der die Daten inpg / s gegen das Chromatogramm Zeit. Die Fläche unter den Peaks von Interesse. Die Fläche unter dem Peak repräsentiert die Gesamtmenge an Metall, das das Protein gebunden ist, in pg. </li><li> Generieren eines Kalibrierungs bezogen auf das Molekulargewicht der bekannten Metalloproteine ​​und dem Zeitpunkt, zu dem sie eluieren. Hier können Sie die Größe der Proteinpeaks in komplexen Proben zu schätzen. </li></ol>

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N., Br&#228;tter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+analysis+of+trace+elements+in+the+brains+of+individuals+with+Alzheimer's+disease+with+special+emphasis+on+metallothioneins.">Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins.</a> Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).</li><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+iron,+copper+and+zinc+content+in+primary+neuron+and+astrocyte+cultures+by+rapid+online+quantitative+size+exclusion+chromatography-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry.">Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry.</a> Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).</li><li>Balkhi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Plasma+Copper+Proteins+Speciation+by+Size+Exclusion+Chromatography+Coupled+to+Inductively+Coupled+Plasma+Mass+Spectrometry.+Solutions+for+Columns+Calibration+by+Sulfur+Detection.">Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection.</a> Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J Vis Exp. , e1610 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Gewährleistung der nativen Zustand des Proteins bedeutet, besondere Aufmerksamkeit auf die Puffer verwendet und Lagerung der Probe erforderlich sind. Nicht alle chromatographischen Techniken oder Probenpräparationstechniken können eingesetzt werden. Es ist wichtig, dass die Puffer im gesamten Probenvorbereitung und Chromatographie verwendet frei sind von Metallchelatoren und Puffer, die Verwendung physiologischen pH-Wert und Salzkonzentrationen nachahmen. Andere Bedingungen zu vermeiden , umfassen Erwärmen der Probe oder die Zugabe von Proteindenaturierungsmitteln (zB Harnstoff). Es ist wichtig, die Anzahl der Gefrier-Auftau-Zyklen zu minimieren. Die Fähigkeit des gewählten Puffers zweiwertiger Metalle zu binden, ist ebenfalls wichtig und ist ein Grund dafür, daß Tris oder Ammoniumnitrat Puffer über Phosphatbasis Puffern ausgewählt werden. Die niedrige Auflösung und Peakkapazität der Grßenausschlußchromatographie relativ zu anderen Formen der Chromatographie ist eine wichtige Einschränkung dieser Technik. Doch die sanfte Art der Größenausschluss chromatography ist wichtig, den nativen Zustand des Proteins aufrecht zu erhalten und damit die relativ schwache Metall-Protein-Bindungen zu erhalten. Die Anforderung , den nativen Zustand der Proteine ​​erfordert besondere Aufmerksamkeit auf die Behandlung der Proben zu erhalten , einschließlich der Anzahl der Gefrier - Auftau - Zyklen zu begrenzen, die Vermeidung Metallchelatbildner (zB EDTA) oder chaotropen Salzen und Detergenzien. Diese geringe Auflösung dieser Technik wirkt sich auf die Fähigkeit, die Menge an Metall mit einem bestimmten Protein zu quantifizieren, wenn sie in einer komplexen Probe wie die Peaks wird mehr als ein Protein angesehen enthalten. Daher bestimmt die Menge an Metall, um die Peak-Integration unter Verwendung wäre ein Hinweis auf die Gesamtmenge an Metall zu diesem Zeitpunkt und nicht nur ein spezifisches Protein mit allen der Proteine ​​eluierenden Verbindung gebracht werden. Um diese Einschränkung zu überwinden würde das Protein von Interesse müssen weiter unter nativen Bedingungen gereinigt werden. Dies würde für die Quantifizierung vondas Metall mit diesem Protein in Verbindung mit einem höheren Grad an certainity gemeldet werden. Eine weitere potentielle Einschränkung dieser Technik würde der Verlust an Protein aufgrund nicht reversible Bindung an die Säule. Um festzustellen, ob dies ein Rückgewinnungsexperiment geschieht sollte durchgeführt werden, wobei die Menge an Protein aus der Säule eluiert wird analysiert, um zu bestimmen, ob dies die Menge übereinstimmt injiziert. Das gleiche kann durch Messung des Metallgehalts des Eluierung Materials und des Ausgangsmaterials durch bulk ICP-MS durchgeführt werden. Spaltenrückgewinnung kann in Abhängigkeit von den verwendeten Bedingungen unterscheiden, aber es hat sich gezeigt , daß eine vollständige Rückgewinnung von Proteinen aus einer Größenausschlusssäule ist möglich 9. Daher ist es wichtig, ob oder nicht zu überprüfen ist der Verlust unter den Betriebsbedingungen verwendet werden. Modifikationen des Protokolls können auf die Metalloprotein Standards in Beziehung gesetzt werden, die ebenso wie die untersuchten Elemente verwendet werden. Die Art der Metalloprotein Standard unsed wird in Abhängigkeit von den Elementen unterscheiden, die von Interesse sind. Für Elemente, wie Cu, Fe und Zn-Proteine, SOD und Ferritin verwendet. Jede andere Metalloprotein, die bekannt stoichometries haben, können auch verwendet werden und einige Beispiele wurden hier gezeigt. Eine Hauptkomplikation, die diese Technik verwenden, ist der Aufbau der Salzkristalle in dem Brenner der ICP-MS entstehen können. 1,000 ml Puffer, der durch das System geleitet wurde, oder wenn es durch visuelle Inspektion festgestellt wird, daß das Brenner gewaschen werden soll - zum Aufbau der Salzkristalle zu verhindern, wird der Brenner mit destilliertem Wasser nach 500 gewaschen. Ein weiteres Problem, das ist ein schneller Rückgang der Sauberkeit der Proben- und Extraktionskegel entstehen können. Diese müssen gereinigt werden regelmäßig folgende Herstellerprotokolle. Die anfängliche Probenvorbereitung ist der wichtigste Schritt im Protokoll. Wenn es irgendwelche Änderungen an der Protein - Metallkomplex der informationen erzeugt wird, nicht gültig ist. Dies ist eine der wichtigsten Beschränkungen der Technik; Zusätzlich ergibt die Verwendung der niedrigen Auflösung, Grßenausschlusssäule eine begrenzte detaillierte Ansicht der wahren Komplexität der Metalloproteine ​​in der Biologie. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die Erweiterung des Wissens des metalloproteome eines Organismus. Massenanalyse liefert nur eine grobe Angabe der Änderungen der Menge an Metall in einer Probe. Neben den allgemeinen Überlegungen, die ergriffen werden müssen, bietet diese Technik ein Werkzeug, das verwendet werden kann, die Menge an Metall mit Proteinen sowie die Identifizierung Metalloproteine ​​assoziiert zu quantifizieren, die durch einen Vergleich der Spuren berechnet wurde, abweichen. Die Verwendung dieser Technik kann verwendet werden, Unterschiede zwischen Krankheitszuständen zu identifizieren. Die identifizierten Metalloproteine ​​können dann die Rolle bestimmen zu helfen, untersucht werden sie in Krankheitsprozessen spielen. Die Anwendung von Bindestrichen ICP-MS hat eine wachsendeZukunft die Rolle von Drogen zu bestimmen, die ein Heteroatom wie beispielsweise Platin, Iod oder Kupfer als ICP-MS haben, können verwendet werden, um die Proteine ​​zu identifizieren, die das Medikament bindet.

Wesentliche Metalle spielen eine entscheidende Rolle bei der normalen biologischen Funktionen, einschließlich der sekundären Botenwege, Stoffwechselwege und Organell Funktionen. 30% aller Proteine ​​sind gedacht , Metalloproteine ​​1 und 50% aller Enzyme 2 sein. Metalloenzyme nutzen diese Spurenmetalle als Cofaktoren chemische Reaktionen zu katalysieren, Proteinstruktur und für regulatorische Funktionen wie sekundäre Botenstoffe stabilisieren. Einige der untersuchten Spurenelemente in Bezug auf die Neurodegeneration sind Kupfer, Eisen und Zink - 3. Sie sind gedacht, in vielen Krankheitswegen beteiligt werden, in denen durch dyshomeostasis haben negative Auswirkungen. Beispielsweise die Metallstatus von Superoxid - Dismutase (SOD) wirkt sich direkt auf die Lebensdauer und Phänotyp der transgenen Mausmodellen von familiärer Art von amyotropher Lateralsklerose (ALS) 4. Bei der Alzheimer-Krankheit, wurden metalloproteomics Techniken verwendet, um eine Abnahme in der Metallstand von Transferrin in p zu entdecken5 LASMA. Diese Studien unterstreichen die wichtige Rolle Metalloproteine ​​in Krankheit spielen kann. Die Studie von Metalloproteinen direkt aus biologischen Geweben ist ein Entwicklungsfeld. Obwohl einige Metalloenzyme charakterisiert worden sind, bleiben die meisten immer noch nicht charakterisierten oder unbekannt 6. Eine der großen Herausforderungen bei der Messung Metalloproteine ​​ist die Forderung , den nativen Zustand des Proteins 7 zu halten. Klassische Bottom-up-Proteom-Techniken stützen sich auf die Verdauung der Proteine ​​in Peptide. Dieser Vorgang unterbricht die nichtkovalente Interaktion von Metallen und deren Proteine. Somit wird keine Information über das Metall Status eines Proteins gewonnen. Eine Möglichkeit , dieses Problem zu überwinden , ist die Verwendung von Grßenausschlußchromatographie mit induktiv gekoppeltem Plasma gepaart - Massenspektrometrie 8,9 (SEC-ICP-MS). Dies erzeugt Informationen über die ungefähre Größe des Proteins sowie alle Metalle, die Assoc sindverbundes mit ihm 10. Ferner ist Größenausschluss eine sanfte chromatographische Technik, die den nativen Zustand eines Enzyms oder Protein-Protein-Komplex erhalten kann. Ein Vorteil induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie (ICP-MS) ist die quantitative Natur der Technologie. Mit einer Reihe von Metalloproteinen Standards ist es möglich , absolute Quantifizierung von Metalloproteine ​​aus biologischen Proben 9,11 bereitzustellen. Dies wird durch Erzeugen einer Standardkurve durch Injizieren bekannter Metalloproteine ​​über einen Bereich von Metallkonzentrationen erreicht. Dieses Protokoll zeigt ein Beispiel, wie dies für eine Vielzahl von Metalloprotein Standards erreicht werden. In diesem Papier wollen wir Standardkurven für Metalle zu schaffen, die in biologischen Gebieten, einschließlich Eisen weitgehend untersucht (Fe), Kupfer (Cu), Zink (Zn), Jod (I) und Cobalt (Co).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Binary Pump</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Autosampler</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G4226A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1316C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1314E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 7700 ICP-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G3282A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium hydroxide trace metal basis&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>338818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ammonium nitrate&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>256064</td>
			<td>Make fresh 200mM solution on day of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Antinomy&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>10002-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ceruloplasmin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cesium&#160;</td>
			<td>Choice analytical&#160;</td>
			<td>100011-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Complete, EDTA free protease inhibitors&#160;&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Conalbumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cu, Zn Superoxide dismutase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Ferritin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ICP-MS multielemental calibration standards&#160;</td>
			<td>AccuStandard</td>
			<td></td>
			<td>Made up to required concentrations in 1% nitric acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microvolume UV spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;65% Nitric acid&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100441</td>
			<td>Diluted to 1% for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Peek tubing&#160;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5042-6461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3&#956;m, 150&#197;&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-2508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Chem Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris Hydrochloride&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals inc.&#160;</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Thyroglobulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Vitamin B12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V2876</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standards for quantitative metalloproteomic analysis using size exclusion icp-ms

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Die Verwendung von Metalloprotein Standards ermöglicht die Kalibrierung der Grßenausschlußsäule. 1A zeigt das Elutionsprofil für die Standards Thyroglobulin, Ferritin, Ceruloplasmin, Cu / Zn - SOD und Vitamin B 12 , bezogen auf das Metall , das sie gebunden sind (Fe, Co, Cu, Zn und I). 1B zeigt die Eichkurve für die Spalte Grßenausschluß basierend auf dem Molekulargewicht der Proteinstandards und deren Elutionszeit, in dem Format von Elutionsvolumen dargestellt (Ve) , geteilt durch das Leervolumen der Säule (Vo). Die Proteine ​​verwendet, um dieses Standardkurve zu erzeugen, sind Concanavalin A, Conalbumin, Ceruloplasmin, Ferritin, SOD und Thyreoglobulin. 2A zeigt die Elution von Ferritin über einen Bereich von 2.000 - 60.000 pg Fe injiziert auf Spalten- und 2D ist die Regressionsanalyse durchgeführt unter Verwendung von peak Bereich. 2B und 2C sind die Elutionsprofile für Cu / Zn SOD für Cu und Zn und 2E und 2F sind die Regressionsanalyse unter Verwendung von Peakflächen erzeugt. Die Ergebnisse der Regressionsanalyse verwendet, um die Rohdaten in Counts / sec zu pg / sec zu konvertieren, so dass die Menge an Metall, die mit dem Protein assoziiert ist, quantitativ bestimmt werden. Die Umwandlung wird durch Division des Counts / sec durch die Steigung der linearen Regression durchgeführt (zB 334,6 (Counts / s) x (s / pg) Kupfer). Wie bereits erwähnt, kann diese Technik verwendet werden, Metalloproteine ​​in komplexen biologischen Proben zu identifizieren. Menschliche Gehirn und Plasma wurden zu dieser Technik unterzogen und Figuren 3 bzw. 4 erhaltenen Ergebnisse zeigen. Menschliche Gehirn getrennt durch SEC-ICP-MS ist in den 3A bis 3C gezeigt, von denen jede repräsentieren eine andere Metall der<html> Interesse (Cu, Zn oder Fe). 4A-4C die Spuren erhalten zeigen , wenn Humanplasma dieser Technik unterzogen wird. Die Komplexität und die Fülle der Probe wird die Anzahl der Spitzen auswirken, die zu sehen sind. Wie erwartet Plasma wird durch ein paar Metalloproteine ​​einschließlich Ceruloplasmin und Transferrin bestimmt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Abbildung 1. Kalibrierung der Größe Chromatographie Ausschluss - Massenspektrometrie unter Verwendung bekannter Metalloproteins (A) Elutionsprofil für die Metalloprotein Standards auf der Grundlage ihrer jeweiligen Metalle - Induktiv Plasma gekoppelt ist .. (B) Molekulargewichtskalibrierungskurve für Proteinstandards Thyroglobulin (i), Ferritin (ii), Ceruloplasmin (iii), Conalbumin (iv), Cu / Zn - SOD (v) und Concanavalin A (vi).&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Abbildung 2. Verwendung von Ferritin und Cu / Zn - SOD als Metalloprotein Standards zur Bestimmung der Menge an Cu, Fe oder Zn Verbunden mit Metalloproteins in einer komplexen biologischen Probe (A) Elutionsprofil für Ferritin über den Injektionsbereich 2000 -. 60.000 ug / l Eisen. (B) und (C) Elutionsprofil für Cu / Zn SOD auf die Injektionsbereich von 200 - 6000 g / L von Kupfer und Zink, respectively. (D), (E) und (F) zeigen die Regressionsanalyseergebnissen für die Metalle Eisen, Kupfer und Zink sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 3. Cu, Fe und Zn Metalloproteome des menschlichen Gehirns. (A) Kupferspur (B) Eisen Spur (C) Zink Spur. Die Elution der Proteinstandards für jedes Metall durch die schwarze Kurve mit ihrem Molekulargewicht unter dem Diagramm angezeigt dargestellt ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> Abbildung 4. Cu, Fe und Zn Metalloproteome für Humanplasma. (A) Kupferspur (B) Eisen Spur (C) Zink Spur. Die Elution der Proteinstandards für jedes Metall wird durch die schwarze Kurve mit ihrem Molekulargewicht gezeigt indicated unter dem Graphen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Standards für die quantitative Metalloproteomic Analyse mit Größenausschluss-ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

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15.0K Aufrufe.  The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health. Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins. 

Serie: Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between samples using mass spectrometry. ReDi labeling is performed using either regular (light) or deuterated (heavy) forms of formaldehyde and sodium cyanoborohydride to add two methyl groups to each free amine. Here we demonstrate a robust protocol for ReDi labeling and quantitative comparison of complex protein mixtures. Protein samples for comparison are digested into peptides, labeled to carry either light or heavy methyl tags, mixed, and co-analyzed by LC-MS/MS. Relative protein abundances are quantified by comparing the ion chromatogram peak areas of heavy and light labeled versions of the constituent peptide extracted from the full MS spectra. The method described here includes sample preparation by reversed-phase solid phase extraction, on-column ReDi labeling of peptides, peptide fractionation by basic pH reversed-phase (BPRP) chromatography, and StageTip peptide purification. We discuss advantages and limitations of ReDi labeling with respect to other methods for stable isotope incorporation. We highlight novel applications using ReDi labeling as a fast, inexpensive, and accurate method to compare protein abundances in nearly any type of sample.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a rapid, inexpensive strategy for accurate mass spectrometry-based quantitative proteomics. Here we demonstrate a robust method for preparation and analysis of protein mixtures using the ReDi approach that can be applied to nearly any sample type.

Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Forschung

Chemie

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Quantitative und qualitative Untersuchung der Partikel-Partikel Wechselwirkungen mit Kolloidales Probe Nanoskopie

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These biomolecules arrange in paracrystalline two-dimensional arrays on surfaces, bind metals, and are thus interesting for several biotechnical applications, such as biosorptive materials for the removal or recovery of different elements from the environment and industrial processes. The deposition of Au(0) nanoparticles on S-layers, either by S-layer directed synthesis 1 or adsorption of nanoparticles, opens new possibilities for diverse sensory applications. Although numerous studies have described the biosorptive properties of S-layers 2-5, a deeper understanding of protein-protein and protein-metal interaction still remains challenging. In the following study, inductively coupled mass spectrometry (ICP-MS) was used for the detection of metal sorption by suspended S-layers. This was correlated to measurements of quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which allows the online detection of proteinaceous monolayer formation and metal deposition, and thus, a more detailed understanding on metal binding.
The ICP-MS results indicated that the binding of Au(III) to the suspended S-layer polymers is pH dependent. The maximum binding of Au(III) was obtained at pH 4.0. The QCM-D investigations enabled the detection of Au(III) sorption as well as the deposition of Au(0)-NPs in real-time during the in situ experiments. Further, this method allowed studying the influence of metal binding on the protein lattice stability of Slp1. Structural properties and protein layer stability could be visualized directly after QCM-D experiment using atomic force microscopy (AFM). In conclusion, the combination of these different methods provides a deeper understanding of metal binding by bacterial S-layer proteins in suspension or as monolayers on either bacterial cells or recrystallized surfaces.

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

To obtain basic information on the sorption and recycling of gold from aqueous systems the interaction of Au(III) and Au(0) nanoparticles on S-layer proteins were investigated. The sorption of protein polymers was investigated by ICP-MS and that of proteinaceous monolayers by QCM-D. Subsequent AFM enables the imaging of the nanostructures.

Au-Wechselwirkung von SLP1 Polymere und Monolayer aus<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS und AFM als Werkzeuge für Biomolekül-Metallforschung

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Mit Hilfe der Kapillarelektrophorese organischen Säuren aus Pflanzengewebe zu beziffern: ein Test Untersuchen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Saatgut

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

A protocol for the direct measurement of particle size distribution in concentrated solutions using dynamic light scattering microscopy is presented.

Die Messung der Partikelgrößenverteilung in trüber Lösungen durch Dynamic Light Scattering Mikroskopie

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

Herstellung und Prüfung von photonischen Thermometer

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Nanosponge Tunability in Size and Crosslinking Density

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with controlled dimensions. This approach begins with synthesis of a functionalized lactone which is key to the pendant functionalization of the resulting polymer. Valerolactone (VL) and allyl-valerolactone (AVL) are then copolymerized using ring-opening polymerization. Post-polymerization modification is then used to install an epoxide moiety on some or all of the pendant allyl groups. Epoxy-amine chemistry is employed to form nanoparticles in a dilute solution of both polymer and small molecule diamine crosslinker based on the desired nanosponge size and crosslinking density. Nanosponge sizes can be characterized by transmission electron microscopy (TEM) imaging to determine the dimension and distribution. This method provides a pathway by which highly tunable polyesters can create tunable nanoparticles, which can be used for small molecule drug encapsulation. Due to the nature of the backbone, these particles are hydrolytically and enzymatically degradable for a controlled release of a wide range of hydrophobic small molecules.

This article describes a process for tuning the size and crosslinking density of covalently crosslinked nanoparticles from linear polyesters containing pendant functionality. By tailoring synthesis parameters (polymer molecular weight, pendant functionality incorporation, and crosslinker equivalents), a desired nanoparticle size and crosslinking density can be achieved for drug delivery applications.

Nanosponge Einstellbarkeit in Größe und Dichte Vernetzung

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Entwirren hohe Festigkeit-Copolymer-Aramid-Fasern um die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften ermöglichen

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

Anwendung von Spannung in der dynamischen Lichtstreuung Partikelgrößenanalyse

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative conditions. Excessive iron results in free redox-active Fe(II) and can cause devastating effects within the cell like oxidative stress (OS) and death by lipid peroxidation known as ferroptosis (FPT). Therefore, quantitative measurements of ferrous (Fe(II)) and ferric (Fe(III)) iron rather than total Fe-determination is the key for closer insight into these detrimental processes. Since Fe(II)/(III) determinations can be hampered by fast redox-state shifts and low concentrations in relevant samples, like cerebrospinal fluid (CSF), methods should be available that analyze quickly and provide low limits of quantification (LOQ). Capillary electrophoresis (CE) offers the advantage of fast Fe(II)/Fe(III) separation and works without a stationary phase, which could interfere with the redox balance or cause analyte sticking. CE combined with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) as a detector offers further improvement of detection sensitivity and selectivity. The presented method uses 20 mM HCl as a background electrolyte and a voltage of +25 kV. Peak shapes and concentration detection limits are improved by conductivity-pH-stacking. For reduction of 56[ArO]+, ICP-MS was operated in the dynamic reaction cell (DRC) mode with NH3 as a reaction gas. The method achieves a limit of detection (LOD) of 3 &#181;g/L. Due to stacking, higher injection volumes were possible without hampering separation but improving LOD. Calibrations related to peak area were linear up to 150 &#181;g/L. Measurement precision was 2.2% (Fe(III)) to 3.5% (Fe(II)). Migration time precision was &#60;3% for both species, determined in 1:2 diluted lysates of human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells. Recovery experiments with standard addition revealed accuracy of 97% Fe(III) and 105 % Fe(II). In real-life bio-samples like CSF, migration time can vary according to varying conductivity (i.e., salinity). Thus, peak identification is confirmed by standard addition.

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

This iron redox speciation method is based on capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry with sample stacking combined with short analysis in one run. The method quickly analyzes and provides low limits of quantification for iron redox species across a diverse range of tissues and biofluid samples.

Aufbau der Kapillarelektrophorese-Induktiv gekoppelte Plasmamassenspektrometrie (CE-ICP-MS) zur Quantifizierung von Eisenredoxarten (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...