Unsere Methode ist von Bedeutung, da sie es dem durchschnittlichen Biochemiker ermöglicht, schnell festzustellen, ob Proben, die mit der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie isoliert wurden, mit Übergangsmetallen kontaminiert sind. Der Hauptvorteil ist die Leichtigkeit, mit der der Test durchgeführt werden kann. Der Assay verwendet Instrumente und Techniken, die den meisten Biochemielaboren gemeinsam sind, und es kann einfach und schnell implementiert werden.
Während wir in diesem Artikel diese Methode für Proben anwenden, die mit einer Nickel-NTA-Säule isoliert sind, kann das Verfahren mit jedem anderen Metallaffinitätsharz verwendet werden. Erstmalige Benutzer sollten diese Methode mit einer Nickel-Stammlösung von bekannter Konzentration versuchen. Dadurch werden sie mit dem Workflow, den Beispielfarben und den Harzen vertraut gemacht, die in spektralen Änderungen angezeigt werden.
Demonstriert wird das Verfahren von Cole Swain, einem Techniker aus meinem Labor. Schalten Sie zunächst das UV-Vis Spektralphotometer ein und wärmen Sie es auf. Bestimmen Sie die chromatographischen Fraktionen, die mit einem Diodenarray UV-Vis Spektrophotometer mit optischer Absorption von 280 Nanometern gemessen werden sollen, um das Protein zu quantifizieren.
Erhalten Sie 10 bis 100 Millimolar Probenpuffer mit einem PH zwischen 7 und 12, wie Tris, HEPES, MOPS und Phosphatpuffer. Bereiten Sie eine 12%Gewichts-Volumen-Volumen-Lösung der HNB-Dispersion im Probenpuffer mit 120 Milligramm HNB-Reagenz für jeden millimetergroßen Lagerlösung vor. Stellen Sie das Spektralphotometer ein, um Daten auf 647 Nanometer zu sammeln.
Verwenden Sie eine Quarzküvette, die mit dem Probenpuffer gefüllt ist, um das Spektralphotometer auszublenden. Bereiten Sie eine Kontrolllösung in einer Küvette mit 50 Mikroliter HNB-Lager pro Milliliter Gesamttestvolumen vor. Lassen Sie die Steuerung mindestens drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Messen und erfassen Sie die Absorption bei 647 Nanometern für die Kontrollprobe. Bereiten Sie die Assay-Proben vor, indem Sie 150 Mikroliter HNB-Bestand mit 2850 Mikrolitern entsprechend verdünnter Proteinfraktionen mit dem Probenpuffer vermischen. Lassen Sie die Probe mindestens drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Wiederholen Sie die Spektrumaufzeichnung für jede zu messende Fraktion. Bei unzureichender Verdünnung ist das gesamte Spektralband bei 647 Nanometern verschwunden. Bei zu starker Verdünnung ist die Probe nicht von der Kontrolle zu unterscheiden.
Um die Metallkonzentration in jeder Probe zu bestimmen, ermitteln Sie zunächst den Unterschied jeder Probenabsorption bei 647 Nanometern aus der HNB-Kontrolle. Bestimmen Sie die Metallkonzentration in Mikromolaren mit der Formel, bei der DF der Verdünnungsfaktor für die Assayfraktion ist, Delta A-B-S 647 die Absorptionsänderung bei 647 Nanometern, 3,65 mal 10 zum negativen 2 den Aussterbekoeffizienten von HNB darstellt und l der optische Pfad der Küvetten in Zentimetern ist. In dieser Studie wird hier das Spektrum der freien HNB bei neutralem PH in repräsentativen Spektren von Fraktionen gezeigt, die aus der Isolierung von MSP1E3D1 nach Nickelionen untersucht werden.
Im Vergleich zur HNB-Kontrolle wurde eine verminderte Absorption von 647 Nanometern beobachtet, die der Bildung von HNB-Komplexen in Gegenwart eines Übergangsmetalls entsprach. Um die Anwendung dieses Assays zu demonstrieren, wurden zwei mit seinem Tagged-Membrangerüst versehene Proteine, MSP1E3D1, MSP2N2, und ein neuartiges, dreihäimiges, c-types Cytochrom-GSU0105 aus Geobacter-Schwefelreduzieren analysiert. Der Protein- und Nickelionengehalt jeder Fraktion für GSU0105 wurde signifikant voneinander verschoben, während die Fraktionen für MSP1E3D1 und MSP2N2, die das meiste Protein enthielten, auch den höchsten Nickelgehalt aufwiesen.
Es wird auch veranschaulicht, dass der Metallgehalt nicht gleichmäßig auf Die Fraktionen verteilt werden kann, die mit einer mobilisierten Metallaffinitätschromatographie gesammelt wurden. Es ist am wichtigsten, den Rohling in allen Proben angemessen und konsistent zu mischen und gleiche Inkubationszeiten für den Rohling in allen Proben zu ermöglichen. Proteinfraktionen von besonderem Interesse könnten mit Atomabsorptionsspektrometrie oder ICPMS weiter analysiert werden, um Metallkontaminationen zu bestätigen und auf chelatierte oder stark gebundene Proteinmetallionen zu testen.
Neben der Übergangs-Metallauslaugungkanne kann diese Technik zur Messung von Bindungsaffinitäten in Übergangsmetallionen zu Proteinen eingesetzt werden. HNB und jegliches Nickel, das in Proben enthalten ist, sind Reizstoffe für die Augen bzw. die Haut. Standard-PSA einschließlich Handschuhe nen und Augenschutz sollten während des Verfahrens verwendet werden.
