D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada's Discovery Grant program.

Hinweis: Stufen 1 und 2 erfolgen vor dem Tag der Bildgebung; sicherzustellen, dass alle Medien und Ergänzungen vor oder am Tag der Bildgebung ins Gleichgewicht gebracht werden, verwendet werden. Gleichgewichtseinstellung wird durch Erwärmung von Medien und Ergänzungen zu 37 ° C in einem Inkubator, um 5% CO 2 gelöst. Alle Zellkulturarbeit und Deckbeschichtungsschritte erfolgen unter sterilen Bedingungen unter einer Sterilbank. 1. Zelltransfektion <ol><li> Transfektion die T-Zellen, um 24 Stunden abgebildet werden vor dem Versuch mit einem Plasmid kodiert eine fluoreszierende Fusionskonstrukt für F-Actin GFP Kennzeichnung und Bildgebung. Hinweis: Die Zellen sollten 24 Stunden vor der Transfektion (48 Stunden vor der Abbildung), um sicherzustellen, Zellen sind an eine optimale Gesundheit und in ihrer logarithmischen Wachstumsphase aufgeteilt werden. <ol><li> Zeigen 5 ml RPMI Ergänzung (RPMI 1640 plus 10% FBS und 1% Pen-Strep (optional)) in einer einzelnen Vertiefung einer 6-Well-Platte in den Inkubator ins Gleichgewicht. </li><li> Pellet 2 × 10 7 T-Zellen-Kultermittelt und mit 37 ° C + 5% CO 2 in RPMI Ergänzung unter Verwendung eines Zentrifugenröhrchen bei 327 x g für 5 min und waschen in einem gleichen Volumen von vorgewärmtem Elektroporation Medien. Hinweis: Die Elektroporation Medium eine verringerte Serum-Medium, das Puffern und Nahrungsergänzungsmittel (siehe Verbrauchsmaterialien). </li><li> Nach der Wieder Pelletierung bei 327 xg für 5 min, resuspendieren Zellen in 500 ul Elektroporation Medien und langsam zu einer Küvette, fügen 5 ug des Plasmids in PCR Grade dH 2 O für die Kennzeichnung F-Actin. </li><li> Klopfen Sie leicht die Küvette auf der Motorhaube Arbeitsbereich um die Entfernung von Luftblasen in den Medien, die Lichtbogenbildung der Elektrizität verursachen können, und um die Zellen gleichmäßig innerhalb der Medienformaten zu gewährleisten. </li><li> Schalten Sie den Elektroporationseinrichtung und setzen Spannung bis 300 V und die Kapazität bis 290 Ω. Elektroporieren Probe unter Verwendung eines exponentiellen Abfall für 20 ms. Anmerkung: Die Optimierung für unterschiedliche Zellen und verschiedene Plasmidkonstrukte erforderlich. </li><li> Sobald das Transfektionsprotokoll istkomplette, speichern Zellen auf Eis für 1 Minute, bevor Sie fortfahren. </li><li> Die Zellen vorsichtig zu übertragen aus der Küvette zu der 6-Well-Platte mit 5 ml RPMI äquilibriert Ergänzung von Schritt 1.1.1. </li><li> Die Zellen O / N bei 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Mantel Deckgläser und Pre-warmen Imaging Supplement <ol><li> Mantel Deckgläser mit Antikörpern gegen T-Zell-Stimulierung hervorzurufen. <ol><li> Coat jede Kammer eines 8-Well-Deckglas mit 1 ug / ml &amp; agr; CD3 und &amp; agr; CD28 in 200 ul PBS. </li><li> Lagerung bei 4 ° CO / N. Alternativ fällt Deck 2 h vor der Bilderzeugung und in einem Inkubator Halten bei 37 ºC, um eine Drift während des Abbildungsprozesses zu reduzieren durch Temperaturänderungen um das Deckglas zu minimieren. </li></ol></li><li> Erstellen Sie ein Deckglas Testprobe mit 0,1 um Unterbeugungs fluoreszierende Mikrosphären. <ol><li> Vortex-Stammlösung von Perlen, um Klumpen zu vermeiden. </li><li> Auf einem neuen, sauberen Deckglas von the gleichen Typ wie die in Schritt 2.1.1 verwendet, Pipette 5 ul fluoreszierende Mikrosphären-Stammlösung auf die Oberfläche (nach Herstellerangaben). </li><li> Verbreiten Mikrokugel-Lösung über das Deckglas mit Pipettenspitze. </li><li> Trocknen lassen, dann gelten 200 ul Eindeckmedium wie PBS. Hinweis: Das Eindeckmedium sollten übereinstimmen, dass für die Bildgebung Zellproben verwendet. </li></ol></li><li> Äquilibrieren HBSS (+ 20 mM HEPES, nachstehend &quot;HBSS Ergänzung &#39;) in einem Zentrifugenröhrchen, indem Sie in einem Inkubator vor, eine warme O / N bei 37 ° C + 5% CO 2. Hinweis: die Zugabe von HEPES ist in den Puffer CO 2, wenn mit Hilfe eines Inkubationskammer mit CO 2 Eingangs überspringen Sie diese Ergänzung. </li></ol> 3. Mikroskop Set-up <ol><li> Biegen Sie auf der Bühne-Top-Inkubator des TIRF-SIM-Mikroskop und Platz genug destilliertes Wasser in das Reservoir des Mikroskops, um die Basis des Heizelements vollständig abdecken. Damit das Wasser eine Equilibrate bis 37 ° C. Hinzufügen der Heizmanschette zu der Objektivlinse, die auch auf 37 ° C eingestellt. Hinweis: Wegen der Empfindlichkeit der Einrichtung, diese Schritte werden in der Nacht zuvor getan die optischen Komponenten bei einer stabilen Temperatur vor der Bildgebung. </li><li> Legen Sie die TIRF-488 kompatibel Gitterblock in den Strahlengang des Mikroskops und sicher am Platz. <ol><li> Schalten Sie den Kanal-Modus und das Glasfaserkabel an die &#39;Single&#39; Position auf dem Laser-Bett und Mikroskoptisch jeweils um die richtige optische Weg für die TIRF-SIM-Modus zu aktivieren. Hinweis: Überspringen Sie diesen Schritt wird zu einem Fehler (Abbildung 1A) im Software-Fenster führen. </li></ol></li><li> Schalten Sie alle Mikroskop und Computer-Komponenten und öffnen Sie die Aufnahmesteuerung Software. <ol><li> Öffnen Sie das Bedienfeld OC, Ti Pad, N-SIM-Pad und ND Acquisition Fenster (Abbildung 1B). In der &#39;OC Panel&#39; die Option &#39;TIRF 488&#39; (2B, gelber Pfeil). </li&gt; <li> In der N-SIM-Pad-Fenster, wählen Sie die &#39;TIRF-SIM &quot;und&quot; Verschieben &quot;Einstellungen (2C, gelbe Pfeile). Wählen Sie die Schaltfläche Einstellungen (1C, gelber Kasten) und wählen Sie &quot;TIRF 488 (für 100x TIRF 488 nm)&quot; aus dem Dropdown-Menü, klicken Sie auf &#39;Übernehmen &quot;und&quot; OK &quot;. </li><li> Stellen Sie die Kamera-Einstellungen innerhalb der &quot;DU897-Einstellungen&quot; auf: Frame Rate 50 ms, Auslesemodus EM Gewinn 3 MHz bei 14 Bit, und EM-Gewinn-Multiplikator 300 mit einer Umwandlungsverstärkung 1 (1C, grüner Kasten). Hinweis: Siehe Repräsentative Ergebnisse für Bildrate Überlegungen. </li><li> Kalibrieren des Mikroskops Beleuchtung für TIRF-SIM, indem Sie die 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF Ziel, auf der &quot;N-SIM-Pad &#39;schalten Sie den 488 nm Laserleistung bis 10%. Hinweis: Pixelgröße der Rohbilder ist 60 nm, mit einem 512 x 512 Pixel-Sichtfeld. </li><li> Reinigen Sie die Objektivlinse mit Linsenpapier, um Staub und Öl zu entfernen. </li></ol></li&gt; <li> Finden Sie die TIRF-SIM Brennebene. <ol><li> Beginnen Sie mit dem Ziel, in der niedrigsten möglichen z-Ebene. Geben Sie einen Tropfen Öl auf Linse des Objektivs und fügen Sie die fluoreszierenden Mikrokügelchen Probe aus Schritt 2.2 auf den Mikroskoptisch. </li><li> Wählen Sie die perfekte Focus System (PFS) Funktion auf dem Körper des Mikroskops befindet. </li><li> Bewegen sich langsam das Ziel, nach oben durch die z-Ebene, bis der PFS-Taste hört auf zu blinken, um die Brennebene bestätigen, wurde erreicht. </li><li> Wechseln Sie in den &quot;Live&quot; Blick auf die Steuerungssoftware und Bild die Mikrosphären für die endgültige Anpassungen mit Hilfe des PFS Mikromanipulator Rad gemacht. </li></ol></li><li> Die eine gleichmäßige Ausleuchtung zu beobachten ohne out-of-focus Fluoreszenzemission über der 75 nm abklingende Welle. Hinweis: Bestätigen strukturierten Beleuchtung wird durch die Beobachtung einer schwankenden Beleuchtungsmuster von der fluoreszierenden Mikrosphärenprobe erfüllt. </li><li> Messen Sie fluoreszierende Mikrokügelchen Probe und zu quantifizieren, die verbesserte Bildgebung resolutIonen durch die Beobachtung der Halbwertsbreite (FWHM) des Intensitätsprofils. <ol><li> Öffnen Sie die Analyze-Software (v4.20.01), mit der NIS-A N-SIM-Analyse-Modul installiert und wählen Sie &#39;Anwendungen&#39; -&gt; &#39;Show N-SIM-Fenster&#39;. </li><li> Mit der Beleuchtungsmodulationskontrast (IMC) und hochauflösende Rauschunterdrückung (HRNS) bis 1 für die TIRF-SIM-Datensätzen (Abbildung 2) gesetzt, rekonstruieren die Mikrosphärenprobe Bild, um ein rekonstruiertes Bild von 1.024 x 1.024 Pixeln bei einer Pixelgröße von 30 zu erzeugen, nm. </li><li> Verwenden der Linienprofilwerkzeug mit einer Breite von 1 Pixel (3A, gelber Kasten), ziehen Sie eine Linie durch die Mitte eines einzelnen Mikrokügelchen. </li><li> Wählen Sie das FWHM Taste (3B, gelber Kasten), und klicken Sie auf der Intensitätsmaxima der Gaußschen Verteilung, gefolgt von seiner Intensität Minima. </li><li> Bestätigen die FWHM der Mikrosphäre in einem Bereich von 100 nm (Figur 3C). Hinweis: die Auflösung achieved bei der Abbildung von biologischen Proben wird in Abhängigkeit von dem Signal-Rausch-Verhältnis von Markierungseffizienz und die Hintergrundfluoreszenz zu variieren. </li></ol></li></ol> 4. Probenvorbereitung für die Imaging <ol><li> Deckglas Vorbereitung. <ol><li> Abrufen &amp; agr; CD-beschichtete Deckglas aus Schritt 2.1 vom Kühlschrank oder Inkubator und entfernen PBS, das &amp; agr; CD3 und &amp; agr; CD28 aus jeder Vertiefung. </li><li> Fügen Sie 200 ul vorgewärmtes HBSS Ergänzung von Schritt 2.3 in jede Vertiefung des Deckglases. Waschen und zu entfernen, um eine minimale &amp; agr; CD3 gewährleisten und &amp; agr; CD28 wird in der Lösung belassen. Fügen Sie eine weitere 200 ul des HBSS Ergänzung zu den Deck Brunnen. </li><li> Reinigen Sie die Unterseite des Deckglases mit Linsenpapier, um Öl und Partikel zu entfernen. </li></ol></li><li> Decklage auf dem Mikroskoptisch und um die TIRF Brennebene des Deckglases unter Verwendung des PFS z-Ebene, wie in Schritt 3.4 festgestellt. </li><li> Zellpräparation. <ol><li> Je 200 &amp; mgr; l der Medien conTaining transfizierten Zellen aus Schritt 1.1.8 in einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Pellet-Zellen in einer Mikrozentrifuge bei 268 · g für 20 sec und entfernen Zellmedien. </li><li> Die Zellen in 200 ul vorgewärmtes HBSS Ergänzung von Schritt 2.3. </li></ol></li></ol> 5. Imaging Cells <ol><li> Nehmen zellhaltigen HBSS Ergänzung des Mikroskops und sanft Je 200 ul in einer der Vertiefungen. </li><li> Während in der TIRF Brennebene verbleibenden am Deckglas (im PFS-Modus), verwenden Sie den Mikroskopen Okular und Epifluoreszenz-Beleuchtung, um fluoreszierende Zellen Annäherung an das Deckglas zu verfolgen. </li><li> Sobald die Zellen landen auf dem Deckglas, um &quot;Live&quot; Modus in der N-SIM-Pad-Schalter, um das Bild auf dem Monitor zu bringen und überprüfen Sie die Zellen im Fokus auf dem Computerbildschirm. </li><li> Um Zeit-Kurse aufzunehmen, öffnen Sie das ND-Aufnahmefenster und wählen Sie die Registerkarte &#39;Time&#39;, klicken Sie auf &quot;Hinzufügen&quot;, und setzen Sie &quot;Interval&quot;, um keine Verzögerung, &#39;Dauer&#39;bis 10 min, &quot;Loops&quot; auf 1 gesetzt ist. Anmerkung: Die Dauer kann je nach Verfahren von Interesse verändert werden; die stics Software kann quantitative Ergebnisse mit Bild Stapel von ≈10 Frames zu extrahieren, wenn sie mit &quot;keine Verzögerung&quot; festgehalten. </li><li> Mit identischen Übernahme-Einstellungen an dem Wulst Probe, starten Sie die Aufnahme-Daten, indem Sie &quot;Jetzt ausführen&quot; in der ND-Aufnahmefenster. </li></ol> 6. Rekonstruktion SIM Bilder <ol><li> Nach der vollständigen Bildgebung ist, öffnen Sie die Analyze-Software (v4.20.01), mit der NIS-A N-SIM-Analyse-Modul installiert und wählen Sie &#39;Anwendungen&#39; -&gt; &#39;Show N-SIM-Fenster&#39;. </li><li> Mit der Beleuchtungsmodulationskontrast (IMC) und hochauflösende Rauschunterdrückung (HRNS) bis 1 für die TIRF-SIM-Datensätzen festgelegt (Abbildung 2), zu rekonstruieren, eine (oder mehrere mit der Batch-Tool) raw SIM-Datei um ein rekonstruiertes Bild SIM zu produzieren. </li><li> Bestätigen Sie die rekonstruierten Datei eine Pixelgröße von 30 nm, in der angegebenBildstatusleiste. Hinweis: Pixelgröße hat keinen Einfluss auf stics Analyse, aber es sollte mindestens 2x kleinere Abmessung als der PSF räumliche Auflösung, um räumliche Korrelation zwischen den Pixeln zu gewährleisten. </li><li> Exportieren Sie die Daten als TIFF-Dateien, bereit für stics Analyse. </li></ol> 7. stics Analysis <ol><li> Download und Dekomprimierung der STIC (C) S Matlab-Software-Paket (Wiseman Labor; als Zusatzinformation zur Verfügung). Das Skript stics_vectormapping.m ist der Kern eines einzelnen Kanals stics Analyse und die ersten 30 Zeilen Code werden verwendet, um die Eingangsparameter zu definieren, wie in Abschnitt 2.1 des Handbuchs definiert. Öffnen Sie dieses Skript und definieren Sie die Eingangsparameter für TIRF-SIM-Datenanalyse. Es wird vorgeschlagen, auch die STIC (C) S-Ordner mit Unterordnern hinzuzufügen, auf die lokale Maschine Matlab-Pfad, wie im Anhang dieses Handbuchs beschrieben. <ol><li> Definieren die Eingangsparameter für die Datenanalyse durch Bearbeiten der entsprechenden Linien des Code </li><li> Um ana führenLyse der TIRF-SIM-Daten auf 1-Vektor-Karte zu generieren, legen Sie die zeitliche Parameter, um die zeitliche Teilbereich in der Leitung 31 auf die maximale Anzahl der Bilder und der zeitlichen Verschiebung der Linie 32 bis 1. Um eine Zeitreihe von Vektorkarten zu erhalten, variieren diese Parameter . </li><li> Für die Immobile Entfernungsfilter, setzen Sie den Parameter &quot;Filterung&quot; (Linie 23) zu &quot;Gleitender Durchschnitt&quot; und stellen Sie die &#39;MoveAverage&#39; Parameter (Linie 24) bis 21. Hinweis: Diese Einstellung hat gezeigt, dass der vorausfahrende und großen Fluoreszenzsignale zu arbeiten, wie es auf Subtrahieren Serienrahmen aus dem Rahmen, die analysiert basiert. </li><li> Ändern Linien 33-38 den Namen der Ausgabedateien und Titel der Ausgangsvektorkarten, sowie die Ausgangsverzeichnispfad zu setzen und zu definieren, in welchem ​​Format die Vektorkarte Bilder gespeichert werden sollen. </li></ol></li></ol><table><tbody><tr><td> Pixelgröße (um) </td><td> 0,03 um </td><td> Linie 19 </td></tr><tr><td> Bildrate (sec) </td><td> 1 Sek </td><td> Line 20 </td></tr><tr><td> Maximale Verzögerungszeit (Frames) </td><td> 20 Rahmen </td><td> Zeile 21 </td></tr><tr><td> Subregion Größe (Pixel) </td><td> 8 Pixel </td><td> Zeile 29 </td></tr><tr><td> Subregion Abstand (Pixel) </td><td> 1 Pixel </td><td> Zeile 30 </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Öffnen Sie die Skript run1ChannelSTICS in der Matlab-Editor-Fenster. Laden Sie das Bild-Serie von Laufleitungen 1-23 von diesem Skript. Hinweis: Dieses Skript kann verwendet werden, um zu laden und Pre-Prozessabbild-Serie, zeichnen Sie die Vektorkarten und Geschwindigkeit Histogramme und führen Sie eine Stapelverarbeitung für viele Dateien werden. Falls erforderlich, das Bild zuschneiden, um einen interessierenden Bereich unter Verwendung der Linie 24-26 dieses Skripts. <ol><li> Führen Linien 29-35 von run1ChannelSTICS zu stics Analyse zu starten. Wählen Sie bei Aufforderung ein Polygon, eine bestimmte Region of Interest (ROI) anzugeben, falls gewünscht. Stellen Sie sicher, dass der ROI nicht mit dem Zellenrand überlappen, als Randartefakte auftreten, wenn stics analysiert diese WiederRegionen. </li><li> Führen Linien 38-52, um die Vektorkarten anzuzeigen. Um die Größenordnung der Geschwindigkeit Histogramm darstellen, führen Linien 53-72. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+interaction+between+T+and+B+cells.">Antigen-specific interaction between T and B cells.</a> Nature. 314, 537-539 (1985).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Delon, J., Bercovici, N., Liblau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+antigen+recognition+by+naive+CD4++T+cells:+compulsory+cytoskeletal+alterations+for+the+triggering+of+an+intracellular+calcium+response.">Imaging antigen recognition by naive CD4+ T cells: compulsory cytoskeletal alterations for the triggering of an intracellular calcium response.</a> European journal of Immunology. 28 (2), 716-729 (1998).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster.">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li><li>Rust, M. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Diese Technik wird Forschern, die dem Bild zu ermöglichen und zu quantifizieren, bisher nicht auflösbaren Details in Zellen Fluoreszenz exprimieren. In unseren Ergebnissen zeigen wir, dass F-Actin fließt in einer symmetrischen Art und Weise aus der Zellperipherie in Richtung der Zellzentrum in der T-Zelle. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Ergebnissen von 1D Linienprofil kymograph Daten 13 und erstrecken sich die Kapazität der Analyse, um 2D- und Super-Resolution-Daten. D...

Das Ziel des Experiments ist es, Bild und Charakterisierung der molekularen Strömung von filamentous- (F-) Aktin in lebenden T-Zellen, jenseits der Beugungsgrenze, um die Strömungsrichtung und die Größe bei immunologischen Synapse (IS) Bildung zu etablieren. Diese Technik wird unter Verwendung einer strukturierten Beleuchtung Mikroskop (SIM) in Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF)-Modus durchgeführt werden, die Abbildung Jurkat T-Zellen bilden eine künstliche Synapse zur Aktivierung Deckgläser mit Anti-CD3- und anti-CD28-Antikörper beschichtet. Der IS Formen zwischen einer T-Zelle und dessen Ziel; eine Antigen-präsentierende Zelle (APC) bei der T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierungs 1,2. Da dies der erste Schritt bei der Bestimmung, ob das adaptive Immunsystem eine Immunantwort auf eine Infektion, können die Folgen von Fehl auf Stimuli an einer Reihe von Krankheiten verursachen. Die Bedeutung der T-Zell-APC-Wechselwirkung ist gut dokumentiert, jedoch die Rolle (n) des reifen nach dem erstmaligen TCR signal Internalisierung sind noch nicht vollständig verstanden werden. Wie das Zytoskelett wird angenommen, dass zwei Prozesse zur TCR-Aktivierung (die Bewegung von Molekülen in der Plasmamembran und die Steuerung der Signalmoleküle abhängig Aktinzytoskeletts 3,4), zu verstehen, wie das Zytoskelett umlagert räumlich und zeitlich verknüpft unterstützen wird die Schritte erläutern molekularer Reorganisation während der Synapsenbildung. Die retrograde Strom von F-Aktin ist gedacht, um TCR-Cluster in Richtung der Mitte der immunologischen Synapse Koppel, wird diese Translokation angenommen Vitalsignal Aufhören und Recycling zu sein; Hilfe für die feine Balance der T-Zellaktivierung 5. Während Standard-Fluoreszenzmikroskopie ist ein flexibles Werkzeug, um einen Einblick zu vielen biologischen Ereignisse, einschließlich Zell-Zell-Interaktionen bieten weiterhin, wird es durch die Fähigkeit des Systems, mehrere Fluorophore genau aufzulösen Wohnsitz näher als die diffr begrenztAktionsgrenze (≈200 nm) voneinander. Wie viele molekularen Ereignisse innerhalb von Zellen beinhalten dichten Populationen von Molekülen und weisen dynamische Umlagerung entweder in Ruhe oder auf ausdrückliche Anregung, keine konventionellen Lichtmikroskopie nicht die vollständige Bild. Die Verwendung von Super Resolution Imaging konnten Forscher die Beugungsgrenze unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken zu umgehen. Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) wie PALM und STORM 6,7 hat die Fähigkeit, die Position von Molekülen bis zu einer Genauigkeit von etwa 20 nm zu beheben, aber diese Techniken beruhen auf langen Erfassungszeiten, den Aufbau eines Bildes über viele Frames . Im Allgemeinen erfordert diese Proben fest oder für die Strukturen, die geringe Mobilität aufweisen, so einzelne Fluorophore nicht als mehrere Punkte fehlinterpretiert. Während Stimulated Emission Depletion (STED) Bildgebung ermöglicht Super-Resolution durch sehr selektiv konfokale Anregungs 8, die erforderliche ScanAnsatz kann über die ganze Zellfelder langsam sein. STED zeigt auch signifikante Photo hohen Auflösung aufgrund der Erhöhung der Leistung des Verarmungsstrahls. Strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM 9) stellt eine Alternative zu diesen Verfahren in der Lage, die Verdoppelung der Auflösung eines Standard-Fluoreszenzmikroskop und ist mit Live Cell Imaging ist als aktuelle SMLM Techniken kompatibel. Es nutzt niedrigere Laserleistungen, auf einem Weitfeldsystem für Ganzzellfelder; Versehen erhöhten Akquisitionsgeschwindigkeiten und ist mit Standard-Fluorophor Kennzeichnung kompatibel. Die Weitfeld Natur der SIM gestattet auch die Verwendung von interner Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) für hochselektive Anregung mit Eindringtiefen in axialer Durchmesser von &lt;100 nm. Bildkorrelationsspektroskopie (ICS) ist ein Verfahren zum Korrelieren von Fluktuationen der Fluoreszenzintensität. Eine Weiterentwicklung des ICS; Raum-Zeit-imAlter Korrelationsspektroskopie (STICs 10) korreliert intrazellulären Fluoreszenzsignale in Zeit und Raum. Durch die Korrelation Pixelintensitäten mit umgebenden Pixeln in rückständigen Rahmen über eine Korrelationsfunktion wird Informationen über Strömungsgeschwindigkeiten und Direktionalität gewonnen. Um sicherzustellen, statische Objekte nicht mit dem STICs Analyse stören, ist ein unbewegliches Objekt-Filter implementiert, das durch Subtrahieren des gleitenden Durchschnitts der Pixelintensitäten funktioniert. Die hier vorgestellte Technik wird angenommen, dass die erste Demonstration von Bildkorrelationsspektroskopie an superauflösende Mikroskopie Daten angewendet, um die molekulare Strömung in lebenden Zellen 11 quantifizieren. Dieses Verfahren verbessert beugungsbegrenzte Abbildung von F-Actin Fluss über STICs Analyse 12 und würde Forschern, die zweidimensionale molekulare Strömung in lebenden Zellen zu bestimmen, von der bei räumlichen Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze von Licht erfaßten Daten Wunsch zu entsprechen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Consumables:</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat E6.1 cells</td>
			<td>APCC</td>
			<td>ATTC TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Strepromycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>&#160;Life Technologies</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#1.5 8-well Labtek coverslips</td>
			<td>NUNC, Labtek</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LifeAct GFP construct</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>60101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OptiMem</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51985-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD3</td>
			<td>Cambridge Bioscience</td>
			<td>317315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD28</td>
			<td>BD Bioscience / Insight Biotechnology</td>
			<td>555725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lens oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulsar Xcell System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cuvette (0.4cm)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5805 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (Heraeus)</td>
			<td>Biofuge pico</td>
			<td>75003235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stage-top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INUH-TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon N-SIM microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Analyse software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator (190D)</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cortical actin flow in t cells quantified by spatio-temporal image correlation spectroscopy of structured illumination microscopy data

Filamentösen -Actin spielt eine entscheidende Rolle bei der Mehrheit der Zellprozesse einschließlich Motilität und in Immunzellen, die Bildung eines Schlüssels Zell-Zell-Interaktion als der immunologischen Synapse bekannt. F-Actin ist auch spekuliert, eine Rolle bei der Regulierung des Molekular Verteilungen auf der Membran von Zellen einschließlich der Unter membranöse Vesikel Dynamik und Protein Clustering spielen. Während Standard-Lichtmikroskop-Techniken ermöglichen verallgemeinert und beugungsbegrenzte Beobachtungen gemacht werden, treten viele zellulären und molekularen Ereignisse, einschließlich Clusterbildung und molekulare Strömung in der Bevölkerung auf Längenskalen weit unter dem Auflösungsvermögen des Standard-Lichtmikroskopie. Durch die Kombination interner Totalreflexion Fluoreszenz mit dem Superauflösungsabbildungsverfahren strukturierten Beleuchtung Mikroskopie wurde die zweidimensionale molekulare Strömung von F-Aktin an der Immun Synapse von T-Zellen aufgezeichnet. Räumlich-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie (stics), wurde dann angewendet, die quantifizierbar Resul erzeugtts in Form von Geschwindigkeits Histogramme und Vektorkarten, die Strömungsrichtungs und Größenordnung. Dieses Protokoll beschreibt die Kombination von superauflösenden Abbildung und STICs Techniken zur Strömungsvektoren an Unterbeugungsdetailniveaus zu erzeugen. Diese Technik wurde verwendet, um ein Aktin-Strömung, die symmetrisch ist und retrograde zentripetalen der gesamten Peripherie der T-Zellen bei der Synapsenbildung zu bestätigen.

Mikroskopeinstellungen Nach der erfolgreichen Verwirklichung aller Schritte der Forscher muss erreicht strukturierten Beleuchtung (SIM) Abbildung von F-Actin Fluss in einer T-Zelle Synapse (Video 1), und quantifiziert diese Molekularströmung durch raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie (4 11). Vor der Aufnahme von Bildern, sicherzustellen, dass die Probenbeleuchtung ist einheitlich über die ...

Watch this Scientific Journal Video about Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data at JoVE.com

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

cortical-actin-flow-t-cells-quantified-spatio-temporal-image

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K Aufrufe.  King's College London. To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy. 

Serie: Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

Herstellung von CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen für die Analyse von GD3 und GD2 Gangliosid Membran-Expression durch Mikroskopie

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...