Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im humanen immunologischen Bereich zu beantworten, wie z. B. wie die Kommunikation zwischen Leukozyten auf molekularer und zellulärer Ebene stattfindet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ungereinigte menschliche T-Zellen ex vivo in relativ kurzer Zeit analysiert werden können. Diesem Verfahren wird Henning Kirchgessner, ein Techniker aus unserem Labor, demonstrieren.
Beginnen Sie mit dem Mischen eines Milliliters frisch entnommenen menschlichen peripheren Blutes mit 30 Milliliterack-Lysepuffer in einem 50-Milliliter-Konustube. Nach acht Minuten bei Raumtemperatur das Rohr mit PBS für eine Zentrifugationswäsche füllen und das Pellet in zwei Milliliterkulturmedium für eine 60-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius wieder aufhängen. Am Ende der Inkubation fünfmal 10 zum fünften Staphylococcus aureus Enterotoxin B oder SEB-belasteten oder entladenen Raji-Zellen in 500 Mikroliter Kulturmedium in einzelne FACS-Röhren geben, gefolgt von 650 Mikrolitern Pan-Leukozyten.
Drehen Sie die Kokulturen herunter und setzen Sie die Pellets in 150 Mikroliter frischem Kulturmedium für eine 45-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius wieder aus. Dann wirbeln die Zellen vorsichtig für 10 Sekunden bei 100 Rpm, während 1,5 Milliliter 1,5% Paraformaldehyd hinzugefügt werden. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur, stoppen Sie die Fixierung mit einem Milliliter PBS mit 1%BSA ergänzt und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Setzen Sie die Pellets in 100 Mikroliter PBS plus BSA und 0,1% Saponin wieder auf, und fügen Sie die Zellproben zu zwei einzelnen Bohrungen einer 96-Well-U-Bodenplatte hinzu. Zentrifugieren Sie nach 15 Minuten bei Raumtemperatur die Platte und setzen Sie die Pellets in 50 Mikroliter PBS plus BSA und Saponin wieder auf, die die fluorophorkonjugierten Antikörper oder Verbindungen enthalten, die für eine 30-minütige Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur von Interesse sind. Am Ende der Inkubation die Zellen dreimal in 150 Mikroliter PBS plus BSA und Saponin waschen und die Pellets in 60 Mikroliter PBS wieder aufsetzen.
Um die Zellen durch Durchflusszytometrie abzubilden, öffnen Sie die Analysesoftware, überprüfen Sie den Flüssigkeitsstand, und klicken Sie im Menü Instrument auf Start. Klicken Sie als Nächstes auf Laden, und laden Sie die Beispiele in den Port, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Ändern Sie unter der Registerkarte Beleuchtung die Anregungslaserleistung auf die entsprechenden Nanometerlängen.
Passen Sie dann die Tore für die Kanäle vier und 11 an, und passen Sie den Bereich für Kanal 1 an. Um die Gating- und Laserleistungseinstellungen auszuwerten, wechseln Sie das Menü Ansicht auf das jeweilige Tor und passen Sie die Tore und Laserkräfte an, bis die Zellen und Zellpaare sichtbar sind. Definieren Sie dann auf der Registerkarte Dateierfassung den Beispielnamen und die Anzahl der zu erfassenden Bilder und das entsprechende Gate für die CD3-Färbung, und klicken Sie auf Acquire, um mit der Erfassung zu beginnen.
Um die erfassten Zellbilder zu analysieren, öffnen Sie die entsprechende Analysesoftware. Erstellen Sie gemäß den Anweisungen in der Dropdown-Liste Kompensation eine Kompensationsmatrix und speichern Sie die Matrix als Comp Date ctm. Öffnen Sie als Nächstes eine Beispiel-Rohbilddatei, und wenden Sie die Comp-Datums-CTm im Fenster an, um das kompensierte Bild und die Standarddatenanalysedateien zu generieren.
Konvertieren Sie nach dem Öffnen der kompensierten Bilddateien die Bilder in den Farbmodus. Passen Sie die Nachsuchtabellen an, um optimale sichtbare Farben in der Symbolleiste Bildgalerieeigenschaften zu erhalten. Öffnen Sie den Masken-Manager im Menü Analyse, und definieren Sie die T-Zellen, indem Sie eine 60%-Schwellenwertmaske für Kanal 5 auswählen und die Maske füllen, um die T-Zellenmaske zu erstellen.
Wählen Sie als Nächstes die Talmaske für Kanal zwei mit einer Breite von drei Pixeln aus, um die Valley-Maske zu erstellen, und kombinieren Sie die T-Zellen- und Talmasken, um die Synapsemaske der T-Zelle zu erstellen. Um den gesamten CD3-Ausdruck in T-Zellen zu berechnen, öffnen Sie den Feature-Manager, und erstellen Sie das Feature Intensität, T-Zelle, Kanal 5. Um die Gesamtmenge an F-Actin in den T-Zellen zu berechnen, erstellen Sie das Feature Intensität, T-Zellen, Kanal sechs.
Um die CD3-Menge in Immunsynapsen zu bewerten, erstellen Sie das Feature Intensität, T-Zell-Synapse, Kanal fünf. Um die Menge an F-Actin in der Immunsynapse zu bestimmen, erstellen Sie das Feature Intensität, T-Zell-Synapse, Kanal sechs. Um schließlich die Anreicherung von F-Actin und CD3 zu definieren, berechnen Sie die Verhältnisse von F-Actin oder CD3 in der Immunsynapse bzw. die Gesamtexpression des ausgewählten Proteins.
In diesen Graphen wird ein Überblick über die kritische Gating-Strategie zur Quantifizierung der Proteinanreicherung in der Immunsynapse zwischen den Ersatzantigen-präsentierenden Zellen oder APCs und den T-Zellen in ungereinigten Pan-Leukozyten aus einer geringen Volumen-Humanblutprobe gezeigt. Hier werden repräsentative Bilder von T-Zell-APC-Konjugaten mit niedrigem CD3- und F-Actin-Gehalt in ihren Immunsynapsen in Abwesenheit von SEB gezeigt, während diese T-Zell-APC-Konjugate eine starke CD3- und F-Actin-Anreicherung in Gegenwart von SEB aufweisen. In Ermangelung von Superantigen zeigten 15% der T-Zellen eine Anreicherung von CD3 und F-Aktin an der Immunsynapse, während eine 29%ige Anreicherung in Gegenwart von Superantigen beobachtet wird.
In Der Tat, in Abwesenheit von Superantigen, weniger als 20% der gesamten F-Actin in den Zellen an der Immunsynapse ansammelt, mit über 30% an der Synapse in Gegenwart von Superantigen beobachtet. Bemerkenswert ist, dass sich CD3 auch ohne Superantigen an der Immunsynapse ansammelt, obwohl diese Akkumulation auch durch die Zugabe von Superantigen signifikant erhöht wird, was die Eignung dieser Methode zur Quantifizierung der Proteinakkumulation an der T-Zell-APC-Immunsynapse demonstriert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs bis sieben Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle relevanten Kontrollen einzubeziehen, einschließlich Proben ohne Superantigen, da Proteinanreicherung auch auftritt, wenn APCs ohne SEB verwendet werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Superauflösungsmikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die feine Struktur der Immunsynapse zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der zellulären Kommunikation, um die Immunsynapse beim Menschen für Grundlagenforschung, klinische Studien und translationale Wissenschaft zu erforschen.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die T-Zell-APC-Verbindungszone und die Immunsynapse in menschlichen T-Zellen ex vivo analysieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Primärmaterialien gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen oder das Arbeiten unter Biosicherheitsstufe zwei Bedingungen immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
