Name: rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
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Die Autoren Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert und Louise Rimbault des Cochin Imaging Facility deutlich erkennen. Diese Arbeit wurde von Inserm, CNRS und Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe einem Gütezeichen) unterstützt.

1. Herstellung von T-Lymphozyten <ol><li> Bereiten primären Maus oder humanen T-Zellen wie beschrieben 10,11. </li><li> Kultivieren humaner T-Zellen in komplettem RPMI-Medium mit 10% Humanserum AB in einer Dichte von 2 - 3 x 10 6 Zellen / ml. HINWEIS: Die Verwendung von fötalem Kälberserum (FCS) anstelle von Humanserum kann spontane Polarisation von einem großen Teil der menschlichen T-Zellen in der Kultur hervorruft. Bewahren Sie diese Zellen in Kultur für 4-5 Tage und weiter zu verarbeiten, diese jederzeit während dieser Periode. </li><li> Pflegen Maus-T-Zellen in komplettem RPMI-Medium mit 10% FCS ergänzt war, bei einer ähnlichen Zelldichte. Sofort verwenden oder am nächsten Tag, nach einer O / N-Kultur bei 37 ° C in Gegenwart von 10 ng / ml IL7. </li><li> Kultivieren der CEM menschlichen T-Zelllinie in komplettem RPMI, ergänzt mit 10% FCS. </li></ol> 2. Chemokine Stimulation <ol><li> Waschen 5 x 10 5 Zellen pro Versuchsbedingung in warmem HBSS Medium mit 10 mM Hepe ergänzts. Für einige Experimente, Co-Transfektion von primären humanen T-Zellen am Tag zuvor mit 2 pg pmaxGFP und 8 ug pcDNA3.1 + (Leervektor, Kontrolle), PKCζ Kinase tot, oder N-terminalen Par6 Plasmide. </li><li> Zellpellet in warmem HBSS-HEPES-Medium (0,3 ml verwenden x Anzahl der Versuchsbedingungen). </li><li> Verteilen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Daher wird ein Rohr entsprechend einer einzelnen experimentellen Bedingung 5 x 10 5 Zellen in 0,3 ml HBSS-HEPES Medium enthalten. Für einige Experimente, 500 nM Latrunculin A oder Vehikel (DMSO) und inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten vor dem Chemokin-Stimulation. </li><li> Hinzufügen 10 bis 500 ng / ml CCL19 oder CXCL12 Chemokin in jedes Röhrchen. HINWEIS: Wir verwenden normalerweise 10 bis 200 ng / ml Chemokin für den menschlichen T-Zellen. CEM-Zellen exprimieren keine CCR7 Rezeptor, CCL19 bindet. Daher wird CEM-Zellen nur dann in einem CXCL12 Stimulation reagieren. Darüber hinaus verwenden höheren Chemokin-Konzentrationen (300-500 ng / ml) zu polarisieren, Maus-T-Zellen. </li><li> Mehrmals drehen Sie die Rohre und inkubieren sie in einem 37 ° C Wasserbad für 8 oder 10 Minuten für die primäre T-Zellen oder CEM auf. </li><li> Stoppen des Polarisationsprozesses durch Zugabe zu jedem Röhrchen 0,3 ml einer warmen Lösung, die 2% Paraformaldehyd (PFA) und 10 mM Hepes in PBS. Drehen Sie die Rohre und inkubieren sie bei 37 ° C für 5 min. </li></ol> 3. Färbungen <ol><li> Übertragen Sie die Zellen aus den Mikrozentrifugenröhrchen auf Zytometrie Rohre fließen. </li><li> Vollständig zu füllen die Rohre mit einer RT-Lösung, die 1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 mM EDTA und 10 mM Hepes in PBS. </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei 460 × g für 4 min. </li><li> Den Überstand verwerfen und die Zellen werden in 100 ul einer RT-Lösung, enthaltend 5% FCS in PBS. </li><li> Mit 5 &amp; mgr; l FITC-anti-HLA-ABC in jeder Röhre, Wirbel ihnen und inkubieren für 30 min bei RT, entfernt von Licht. </li><li> Wash-Zellen einmal mit PBS, enthaltend 5% FCS, einnd einmal mit nur PBS. </li><li> Bei RT: add 500 ul 1% PFA, Inkubation für 10 min, dann waschen Sie die Zellen mit einer Lösung, die 1% BSA, 0,5 mM EDTA und 10 mM HEPES in PBS. </li><li> Überstand verwerfen, vollständig zu füllen die Röhrchen mit einer Lösung von PBS, die 0,2% BSA, 0,1% Saponin, 0,5 mM EDTA und 10 mM Hepes (Permeabilisierung Puffer). </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal in diesem Medium. </li><li> Drehen Sie die Rohre, um das Medium zu entfernen und vortexen sie das Zellpellet zu distanzieren. </li><li> Zugabe von 0,25 &amp; mgr; g / ml TRITC-Phalloidin und / oder eine 1: 100-Verdünnung von Anti-P-ERM-Antikörper zu jedem Röhrchen, Wirbel zu und inkubiere für 30 min bei RT. </li><li> Wash-Zellen mit der Permeabilisierung Puffer. Inkubieren mit einem fluoreszierenden sekundären Antikörper, falls erforderlich. </li><li> Die Zellen in 200 ul PBS und sie auf Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Zellen sind bereit für die Übernahme. Alternativ, während eine maximale Gesamtmenge von 200 ul pro Röhrchen, konzentriertes PFA auf einen endgültigen 1%Konzentration, um die Färbungen zu erhalten, wenn die Zellen nicht am selben Tag für die weitere Verarbeitung verwendet werden. </li></ol> 4. Bilder Erfassung und -analyse <ol><li> Schalten Sie das Gerät (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien / Equipment) und lassen Sie es sich selbst zu kalibrieren nach den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die INSPIRE-Software wurde mit einem 40X-Objektiv (0,75 NA) verwendet. Der IDEAS 3.0-Software wurde für alle berichteten Quantifizierungen verwendet. </li><li> Bereiten Sie eine Reihe von Akquisitionsfenster, die in einer Vorlage für zukünftige Experimente gespeichert werden können. Zeichne Histogramme, die die RMS Gradientenwerte zu quantifizieren. Von der &quot;In Focus&quot; Bevölkerung, auf die RMS Gradientenhistogramm ausgewählt, die Abgrenzung der &quot;Einzelzelle&quot; Bevölkerung in einem Histogramm der Umgebung. Sobald der Mikrozentrifugenröhrchen in die Maschine eingelegt worden ist, stellen Sie die Laserleistung, Tor auf einzelne Zellen und erwerben 5.000 T-Lymphozyten. </li><li> In der Idee Weichware, öffnen Sie den Erwerb Datei und erstellen Sie ein Histogramm, das den Wert des Gradienten RMS-Wert für Hellfeld-Bilder zeigen wird (Kanal 1) für jede einzelne Zelle erhalten. Zeichnen Sie ein Tor auf der RMS Gradientenhistogramm, die Zellen, die RMS Gradientenwert oberhalb 57 hält. HINWEIS: Der RMS-Gradienten ermöglicht unter Berücksichtigung der Analyse nur die T-Lymphozyten, die in der Brennebene sind. Wir haben empirisch festgestellt, dass die einzelnen Zellen eine RMS Gradientenwert überlegen 57 zeigen, sind in der Brennebene, und kann genau berücksichtigt werden. </li><li> In der Analyse / Masken-Menü erstellen Sie eine neue Maske, genannt Erodieren (M01,2) von der Morphologie Maske auf den Hell Bilder M01, von 2 Pixeln erodiert. Dann, in der Analyse / Eigenschaften-Menü ein neues Merkmal der Umgebung, auf dem Erodieren (M01,2) Maske errechnet. Aus den im vorigen Tor ausgewählten Zellen, öffnen Sie ein Histogramm, das die Umgebung der Zellen mit dieser neu geschaffenen Maske. HINWEIS: Die Morphologie Masken, die von verfügbarenStandard sind viel größer als die tatsächliche Größe der Zelle. Somit ist es genauer, sie zu erodieren bis zu 2 Pixel. </li><li> Zeichnen Sie ein Tor zu den einzelnen T-Zellen, ohne den Kalibrierungsperlen und Schmutz (kleine Fläche) und die Dubletten (Großraum). Passen Sie dieses Tor bei jedem Erwerb. HINWEIS: Variationen in der Zellgröße wird die Position des Tors beeinflussen. Als Maus-T-Zellen sind kleiner als menschliche T-Zellen, die ihrerseits kleiner als CEM-Zellen sind, wird die Fläche eines jeden Zelltyps proportional zu seiner Größe sein. </li><li> Unter Berücksichtigung der einzelnen, fokussierten Zellen, die bei den vorherigen Schritten gated wurden Öffnen ein Punkt-Diagramm, bestehend aus der Rohmaterial Max Pixel auf dem HLA-ABC-Färbung (Kanal 2, x-Achse) als Funktion des Raw Max Pixel auf Phalloidin Färbung (Kanal 4, y-Achse). Erstellen Sie ein Tor, um die ungefärbten oder gesättigten fluoreszierende Veranstaltungen auszuschließen. Öffnen Sie zwei Histogramme, die die Raw Max Pixel für HLA-ABC (Kanal 2) und Phalloidin (Channel 4) Färbungen. </li><li> In der Analyse / Masken-Menü createa neue Maske, genannt Erodieren (M02,2) von der Morphologie Maske der HLA-ABC gefärbten Zellen (Kanal 2), von 2 Pixeln erodiert. Dann, in der Analyse / Eigenschaften-Menü, erstellen Sie eine neue Funktion, die aus dem Kreisformparameter, auf dem Erodieren (M02,2) berechnet. Hinweis: Dieser Parameter misst die Abweichung der Zellform von einem Kreis. Daher wird eine perfekt runde T-Zellen eine hohe Rund Wert während verlängert polarisierten Zellen eine niedrige Kreis Index aufweisen müssen. </li><li> Anschließend erstellen Sie ein anderes Histogramm, das die Werte der Kreisformmerkmal von den zuvor geschlossenen Zellen berichten. Verwenden dieses Histogramm unmittelbar plotten die Verteilung eines einzelnen, fokussierten Zellpopulation gemäß dem Wert der Kreisförmigkeit für jede einzelne Zelle. </li><li> Mit Blick auf die Form des Histogramms für Nicht-stimulierte Zellen, zeichnen ein Gate zum polarisierten Zellen, beginnend mit der untersten Kreis Wert bis zum Rund Grenzwert, wo die meisten der nicht-stimulierten Zellenaufgetragen. Sehen Sie in der Statistikanzeige für den Prozentsatz der polarisierten Zellen unter den Wohnbevölkerung (% Gated). HINWEIS: Wir haben dieses Tor für Kreisformindexwerte unter 13 eingestellt. </li><li> Um bei der Polarisation des Actin-Färbung in den Zellen aus, zeichnet eine Histogramm für die Hell-Detail Ähnlichkeit R3 Wert, Vergleichen des HLA-ABC-Färbung (Kanal 2) und der Phalloidin-Färbung (Kanal 4). HINWEIS: Je größer der Wert dieser Funktion ist, desto mehr überlagert die beiden Färbungen sind. </li><li> Unter Verwendung der gleichen Strategie wie zuvor Gating plotten ein Gate an den nicht-stimulierten Zellen für die gesonderte Färbung, die den Prozentsatz an Zellen mit polarisiertem Aktinfärbung zeigt. </li><li> Nach Beendigung werden der Prozentsatz von Zellen, die eine Entmischung in der Verteilung der MHC-Klasse-I und Phalloidin-Färbungen wurde die prozentuale polarisierter Zellen zusammen mit den Mittelwerten der Kreisförmigkeit und Ähnlichkeit Indizes aller Zellen ± SD im entspr gezeigtenonding Statistiken Panels. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Mit einem letzten Technologie der Bildgebung Durchflusszytometrie, eine schnelle und informative Gating-Strategie zur zellulären und molekularen Ereignisse, die von Chemokin-Stimulation induziert Analyse wird vorgestellt. Die Veränderungen der Zellmorphologie von Chemokin-Stimulation und die subzelluläre Verteilung von verschiedenen Proteinen während des Polarisationsvorganges hervorgerufen: Von einem einzigen Experiment kann man zwei Arten von Informationen zu erhalten. Interessanterweise wird die Beweis auch die M...

Chemokine sind kleine lösliche Proteine, die Zellen zu spezialisierten Standorten 1 gewinnen. Daher nehmen sie an der korrekten Positionierung von Zellen in Geweben, eine entscheidende Funktion bei der Entwicklung und Physiologie. Das Immunsystem ist keine Ausnahme von dieser Regel, wie es auf die Einwirkung von vielen verschiedenen Zelltypen, die in einem Strang, um eine wirksame Immunantwort beruht. Durch die Steuerung der spezifischen Position eines Immunzelltyps in einem bestimmten Zustand sind Chemokine vorge erforderlich, bevor Fremdantigene erkannt und neutralisiert werden. In T-Lymphozyten, insbesondere Chemokine binden an spezifische Oberflächenrezeptoren, die bei Eingriff, entlocken viele intrazelluläre Signale (Calcium-Anstieg, ERK Phosphorylierung, Rho-GTPasen Aktivierung Anstieg der Integrine Affinität und Zytoskelett-Änderungen), die T-Zell-Motilität 2,3 begünstigen. Auf zellulärer Ebene kann eine morphologische Veränderungen bei Chemokin Stimulation ausgelöst beobachten.Diese Veränderungen in der Zellformen sind besonders dramatisch in T-Zellen: ruhende T-Zellen bei Reisen in den Blutstrom über eine wulstartige runde Morphologie. Jedoch ist die Erfassung der Gegenwart von Chemokinen an Entzündungsstellen oder zumin Nähe Lymphorganen gehen, um die Form von T-Zellen, die nun eine typische &quot;hand-Spiegel&quot; Morphologie, bestehend aus einer bipolaren Form annehmen ändern: eine führende Kante an der Vorderseite und eine Hinterkante oder Uropod, an der Rückseite 4. Darüber hinaus kann die intrazelluläre Komponenten in diesen zwei gegenüberliegenden Bereichen eines polarisierten T-Zelle zu trennen, um die Migration zu erhalten. Beispielsweise Aktinfilamente Polymerisation steigt auf Chemokin Stimulation 5 und polymerisierten Actin reichert sich an der Vorderseite eines polarisierten T-Zelle 2. Auf der anderen Seite, mehrere Proteine, wie phosphorylierte Proteine ​​der Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) -Familie, die Plasmamembran zu der kortikalen F-Aktin zu verbinden, erneut lokalisiert am Uropod polarisierterT-Zellen 6. Interessanterweise haben wir und andere zeigen, dass diese Polarisierung Prozess wird für T-Zell-Migration erforderlich. Tatsächlich wird jede Behandlung, die mit Polarisations stört zellulären Motilität zu hemmen. Zum Beispiel die Hemmung der Aktivität der Mitglieder der atypischer Proteinkinasen C (PKC) Familie PKCζ und PKCι Blöcke T Zellpolarisation und deren Migrationsscanprozess der dendritischen Zellen 7. T-Zell-Polarisation auch von Rho-GTPasen geregelt. Wir haben gezeigt, dass die Modulation des RhoL Aktivität durch den kürzlich beschriebenen Fam65b Protein interferiert mit T-Zell-Veränderungen in der Morphologie und ihrer Fähigkeit, in einem Transwell-Assay 6 migrieren. Als Polarisations Voraussetzung Schritt zelluläre Motilität ist es daher von entscheidender Bedeutung, um es als eine Haupt Auslesen Chemokin Reaktionen zu quantifizieren. Zellform Veränderungen wurden bisher manuell 8 gemessen. Allerdings ist diese Art der Quantifizierung sehr zeitaufwendig, so dass in der Regel nur wenigeZehn Zellen berücksichtigt. Hier wird ein neues Verfahren vorgestellt, um schnell quantifiziert den Grad der Formänderungen von T-Lymphozyten auf die Stimulation Chemokin ausgesetzt. Eine Abbildungs ​​Durchflusszytometrie-Technologie (siehe Tabelle Spezifische Reagenzien / Equipment) verwendet wird, der die Vorteile eines Durchflusszytometers und ein Mikroskop 9 kombiniert, um die Menge des polarisierten Zellen unter verschiedenen Bedingungen von Chemokin Stimulation effizient zu quantifizieren. Zusätzlich zur Quantifizierung der morphologischen Veränderungen, die eine robuste Konstruktion mit dieser Technik gemessen werden kann, ist es auch möglich, Veränderungen der subzellulären Lokalisation von einigen Proteinen bei Chemokinsignalisierung bewerten.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Human serum AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Human T cell nucleofactor kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC antibody</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream&lt;sup&gt;x&lt;/sup&gt; Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling

Zellen reagieren auf die Stimulation durch in einem Prozess namens Polarisation verlieren ihre runde Form, und durch Änderung der subzelluläre Lokalisierung vieler Proteine ​​Chemokin. Klassischen Bildgebungstechniken sind verwendet worden, um diese Phänomene zu untersuchen. Jedoch benötigt sie die manuelle Erfassung vieler Zellen gefolgt von zeitaufwendig Quantifizierung der Morphologie und die Co-Lokalisation der Färbung von zig Zellen. Hier wird ein schnelles und leistungsfähiges Verfahren beschrieben, um diese Phänomene zu Proben aus mehreren Tausenden von Zellen unter Verwendung eines Abbildungs ​​Durchflusszytometrie Technologie, die die Vorteile eines Mikroskops mit denen eines Zytometers kombiniert studieren. Verwendung von T-Lymphozyten mit CCL19 und Färbung für MHC Klasse I-Molekülen und filamentöses Aktin stimuliert wird eine Gating-Strategie dargestellt, um gleichzeitig die den Grad der Gestalt Änderungen und das Ausmaß der Co-Lokalisierung von Markern, die von CCL19 Signalisierung betroffen sind. Darüber hinaus konnten wir diese Gating-Strategie Observe die Trennung von filamentösen Aktin (vorne) und phosphoryliert Ezrin-Radixin-Moesin (Phospho-ERM) Proteine ​​(auf der Rückseite) im polarisierten T-Zellen nach CXCL12 Stimulation. Diese Technik war auch nützlich, um die blockierende Wirkung der Polarisation von zwei verschiedenen Elementen zu beachten: Hemmung der Aktin-Polymerisation von einem pharmakologischen Inhibitors und Expression von Mutanten des Par6 / atypische PKC Signalweg. Somit wird Beweise gezeigt, dass diese Technik ist nützlich, um sowohl morphologische Veränderungen und Protein Umverteilungen analysieren.

Die erste hier gewählten Beispiel betrifft die Verwendung von humanen primären T-Lymphozyten mit CCL19 stimuliert. Jedoch kann die gleiche Strategie mit primären Maus-T-Zellen, T-Zelllinien oder andere Zelltypen, die auf Chemokin Stimulation verwendet werden. Die Gating-Strategie hier vorgestellten eine Reihe von Fenstern, die die fokussierten Veranstaltungen, dann die einzelnen Zellen auszuwählen. MHC-Klasse-I-HLA-ABC und polymerem Aktin zur Anlage (Figur 1) oder CCL19-stimulierte (Abbildun...

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Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Schnelle und robuste Analyse Zelluläre und Molekulare Polarisation durch Chemokine Signaling Induced

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

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Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

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Forschung

Immunologie und Infektion

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

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Biotechnik

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polydimethylsiloxanhaltigen Polycarbonat Mikrofluidiksysteme für Zellmigrationsstudien unter Perpendicular Chemische und Sauerstoff Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Biologie

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

Zeitraffer-Bildgebung von Mausmakrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Imaging G Protein-gekoppelten Rezeptor-vermittelte Chemotaxis und seine Signalereignisse in Neutrophilen-like HL60-Zellen

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...