We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N&#176; SFI20111203770 and N&#176; PJA 20131200143.

Hinweis: Die Abbildung 1 zeigt den Umriss des Protokolls. 1. Herstellung der Nadeln für die Injektion und Transplantation Hinweis: Nadeln können jederzeit gespeichert und hergestellt werden. Halten Sie sie in einer Petrischale, auf einem Band aus Knetmasse. Verschließen Sie die Schale mit Parafilm vor Staub zu schützen. <ol><li> Für Injektionsnadeln, ziehen eine Glaskapillare (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,58 mm, ohne Filament (siehe Materialliste)) mit einer Mikropipette Abzieher (siehe Materialliste). Bevorzugen kurzen und dünnen Nadeln (verjüngte Teil von etwa 5 mm), da sie effizienter zum Durchdringen der Chorion sind. Hinweis: Die Injektionsnadeln sind Einmalgebrauch. </li><li> Nadel für Zelltransplantation <ol><li> Ziehen Sie eine Glaskapillare (Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser von 0,78 mm, ohne Filament (siehe Materialliste)) mit einer Mikropipette Puller. </li><li> Usingen ein Mikroschmiede (siehe Liste der Materialien), an der Stelle der Spitze der Nadel geschnitten, wo der Innendurchmesser 35 &amp; mgr; m (etwas mehr als der Durchmesser der Zellen transplantiert werden) ist. </li><li> Bevel das geschnittene Ende der Kapillare mit einer microgrinder (siehe Materialliste) mit einem Winkel von 45 °. </li><li> Gegebenenfalls einen Widerhaken am Ende der Nadel ziehen eine Mikroschmiede verwenden. Dazu drücken Sie die Hot-Filament mit der Spitze der Schräge und ziehen Sie sie schnell weg, einen Haken zu schaffen, die das Eindringen des Embryos helfen kann. </li><li> Montieren Sie die Nadel an einem Nadelhalter an einer Spritze befestigt. Mit der Spritze, spülen Sie das Innere der Nadel dreimal mit 2% iger Flußsäure Glasreste zu beseitigen, und spülen Sie dann dreimal mit Aceton. Achtung: Flusssäure ist giftig, zu manipulieren unter der Haube, mit Handschuhen. Hinweis: Die Zelltransplantation Nadeln mehrmals verwendet werden kann. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung desGeschirr für die Injektion und Zelltransplantation <ol><li> Wärme 50 ml Embryo Medium 11 , das 0,5 g Agarose in einer Mikrowelle für 1 min bei voller Leistung 1% Agarose in Embryo - Medium zu erhalten. Kühle das Agarosegel auf etwa 60 ° C und gießt die 50 ml in einer 90 mm Petrischale. An der Oberfläche des Gels eine speziell entwickelte Form (siehe Liste des Materials), entweder mit Linien für die Injektion Schale oder mit Vertiefungen für die Zelltransplantation Gericht. <ol><li> Beachten Sie die Form Schwimmer auf der Agarose, wenn die Agarose nicht zu heiß ist. Nachdem die Agarose - Gel eingestellt ist, entfernen Sie die Form mit einer Pinzette (2A - B). Hinweis: Gerichte können bei 4 ° C gelagert werden, bis zu ein paar Wochen. Halten Sie sie in einem geschlossenen nassen Feld, um ein Austrocknen zu verhindern. </li></ol></li><li> Die Schale in einem 28 ° C Inkubator 30 Minuten vor dem Gebrauch. </li></ol> 3. Sammlung von Embryonen und Injection <ol><li> Injektionslösung Vorbereitung Hinweis: Actin-Bindungsdomänedes Hefe-Actin-bindendes Protein 140 (ABP-140), wie LifeAct zu mCherry gebunden (nachstehend als ABP140-mCherry) verwendet wird polymerisierten Actin innerhalb der Zelle, um die protrusive Aktivität zu analysieren, um zu veranschaulichen. Fügen Sie eine weitere Verbindung , die die Funktion eines Kandidatengens zu testen (zB mRNA von dominant negative oder konstitutiv aktiven Konstrukt oder Morpholino - Oligonukleotide). Um die Funktionen von Sin1 beurteilen , wie in den Ergebnissen beschrieben (Figur 3), wir Morpholino - Oligonukleotide verwendet. Als Kontrolle verwendeten wir eine morpholino identisch mit dem sin1 morpholino aber für 5 Nukleotiden entlang der Sequenz verteilt , so daß diese Steuer morpholino RNA nicht das Ziel übereinstimmt. <ol><li> Thaw sin1 und 5-Mismatch Kontrolle Morpholinos (2 mM Stammlösungen) und ABP140-mCherry mRNAs auf Eis. In 375 ng von mRNAs (75 ng / pl final) und 0,75 ul entweder sin1 oder 5-Mismatch Kontrolle Morpholin (0,3 mM final) in Danieau Puffer (58 mM NaCl, 0,7 mMKCl, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5,0 mM HEPES pH 7,6) mit einem Gesamtvolumen von 5 &amp; mgr; l zu erreichen. </li></ol></li><li> Besamungs Hinweis: Für diese experimentelle Spender und Wirt Embryonen eingerichtet sind transgene Expression der GFP unter der Kontrolle des goosecoid (gsc) Promotor, um die potenzielle Prächordalplatte 11 sichtbar zu machen. <ol><li> Sammeln Tg (gsc: gfp) Eier. Jeweils etwa 80 Eier in einer 90 mm Petrischale mit Embryo Medium gefüllt und Inkubation bei 28 ° C. </li></ol></li><li> Injizieren Spenderembryonen <ol><li> Unter einem Stereomikroskop, drücken Sie sanft gesammelter Embryonen mit einer Pinzette in die Leitungen eines Injektionsform mit Embryo Medium gefüllt. Mit einer Pinzette, orientieren die Embryonen mit den Zellen nach oben. Platzieren das Injektionsschale in den Inkubator bei 28 ° C, bis die Embryonen, die 4-Zellen-Stadium (1 h nach der Befruchtung) erreicht haben. </li><li> Legen Sie eine Injektionsnadel mit 2 ulInjektionslösung. Führen Sie die Nadel in einem Nadelhalter (siehe Liste der Materialien) , die in einem Mikromanipulator angeordnet ist (Liste der Materialien sehen) und mit Polytetrafluorethylen (PTFE) Schläuche (siehe Materialliste) zu einer Luft Transjector (siehe Liste der Materialien verbunden ). </li><li> Öffnen Sie die Kapillare vorsichtig die Spitze mit einer feinen Pinzette berührt. Falls erforderlich, schneiden Sie die Kapillare offen von seinem Ende Kneifen. </li><li> Geben Sie eine der vier Zellen mit der Nadel und die Injektion der Lösung in der Zelle, um 70% des Zellvolumens (2 nl) zu füllen. Injizieren 30 Embryonen. Hinweis: Werden die Nadel in der Zelle kann schwierig sein, da die Plasmamembran weich ist. Ziel an der Verbindung zwischen der Zelle und dem Eigelb erleichtert Nadelpenetration. </li><li> Legen Sie die Embryonen in der 28 ° C-Inkubator, bis sie die Kugel Stufe (4 Stunden nach der Befruchtung) erreicht haben. </li></ol></li></ol> 4. Vorbereitung der Embryonen für die Zelle TransplantatIon <ol><li> Es werden 20 ml Embryo-Medium mit 200 &amp; mgr; l Penicillin / Streptomycin (siehe Liste der Materialien) (Pen / Strep EM). </li><li> Dechorionation der Embryonen im Bereich der Stufe (4 Stunden nach der Befruchtung) Hinweis: dechorionated Embryonen sehr zerbrechlich sind und bei Kontakt mit Luft oder Kunststoff explodieren. Sie müssen also in Agarose-beschichteten Schalen gelegt werden, und übertragen mit feuerpolierten Pasteur-Glaspipetten. <ol><li> Mit Hilfe einer Pasteurpipette aus Kunststoff, übertragen Host Embryonen im Schritt gesammelt 3.2 und Spender in Schritt 3.3 in zwei 35-mm-Petrischalen mit 1% Agarose in Embryo-Medium beschichtet injizierten Embryonen und mit Pen / Strep EM gefüllt. Halten Sie Host-Embryonen und Spenderembryonen in zwei getrennten Gerichten. </li><li> Extrahieren Sie manuell die Embryonen aus ihrem Chorion mit einer feinen Pinzette (siehe Liste der Materialien). </li><li> Legen Sie die Embryonen in der 28 ° C-Inkubator, bis sie die Schildstufe (6 Stunden nach der Befruchtung) erreicht haben. </li></ol></li></ol>5. Cell Transplantation <ol><li> Ordnen Sie die Embryonen für die Zelltransplantation. <ol><li> Unter einem Fluoreszenzstereomikroskop, wählen Spender Embryonen exprimieren ABP140-mCherry (rot) innerhalb der Abschirmung (grün). </li><li> Mit einem feuerpolierten Pasteur-Pipette, übertragen Sie die Embryonen in den Vertiefungen der Schale Zelltransplantation mit Pen / Strep EM gefüllt. Legen Sie die Host-Embryonen in einer Reihe und die Spenderembryonen in der benachbarten Reihe. </li><li> Mit einem Wimpern orientieren sorgfältig die Embryonen mit dem Schild nach oben. Hinweis: die Position der Abschirmung kann durch GFP-Expression oder anatomisch beurteilt werden. </li></ol></li><li> Transplantation System Set-up. Hinweis: Das Transplantationssystem besteht aus einem Nadelhalter (siehe Liste der Materialien) , die mit PTFE - Schlauch (siehe Materialliste) und einem Rohrverbinder (siehe Materialliste) mit einer Spritze Hamilton mit einem Microdrive (siehe Liste of Materials). Der Nadelhalterangebracht ist , auf einem 3-Wege - Mikromanipulator (siehe Materialliste). <ol><li> Mit Hilfe eines Nadelhalters an einer Spritze befestigt ist, spülen Sie die Nadel für die Zelltransplantation mit 70% Ethanol. Dry von Luft in die Nadel aufsaugt. Nicht trocken durch Blasen, da dies in Staub auftreten kann in dem konischen Teil der Nadel stecken zu bleiben. </li><li> Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter an der Spritze Hamilton verbunden ist, mit der Fase nach oben. </li></ol></li><li> Schild-to-shield Cell Transplantation <ol><li> Geben Sie den Schirm eines Spenders Embryo mit der Nadel Transplantation und ziehen bis etwa 10-20 mit ABP140-mCherry markierten Zellen. vermeiden vorsichtig Dotter zu ziehen. </li><li> Transplantation der Zellen in der Abschirmung des Wirtsembryo. Wiederholen, bis alle Host-Embryonen transplantiert wurden. </li><li> Entfernen Sie alle beschädigten Embryonen mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette. Legen Sie die transplantierten Embryonen im Inkubator bei 28 ° C und lassen Sie sie für etwa 30 Minuten zu erholen. </li><li> Verwendung einer NadelHalter an einer Spritze befestigt, spülen Sie die Zelltransplantation Nadel mit Wasser und legen Sie es auf einem Band aus Knetmasse in einer Petrischale zurück. Verschließen Sie die Schale mit Parafilm. </li></ol></li></ol> 6. (Optional) Single Cell Transplantation Hinweis: Im Embryo haften Zellen miteinander, so dass es schwierig ist, nur eine Zelle in der Transplantationsnadel zu ziehen. Wir entwickelten ein modifiziertes Protokoll auf einfache Weise einzelne Prächordalplatte Vorläuferzellen transplantiert. Die Idee besteht darin, Zellen vor der Transplantation zu dissoziieren. Da isolierte prächordalen Zellen Platte Vorläufer neigen dazu, ihre Identität zu verlieren, wir verhängen sie genetisch eine prospektive Identität Prächordalplatte, durch die Nodal-Signalweg zu aktivieren, in Abwesenheit des Sox32 Transkriptionsfaktor. Wir haben bestätigt , dass diese induzierten Zellen wie endogene Prächordalplatte Vorläuferzellen verhalten 8. Im Folgenden sind die einzelnen Schritte Einzelzelltransplantationen durchzuführen. Handy dissociation ist , indem Embryonen in Calcium-Ringer 11, sezieren eine Explantation und mechanisch Rühren erreicht. <ol><li> Im Schritt 2.1 Vorbereitung der Transplantation Schale mit 1% Agarose in Calcium-Ringer anstelle von Embryo Medium. </li><li> Im Schritt 3.1, zusätzlich zu ABP140-mCherry RNA und sin1 Morpholino, fügen Sie 3 ng RNAs codieren , um die aktive Form des Nodal Rezeptor Taram-A (0,6 ng / ul final) und 1,25 ul Morpholin gegen sox32 (Stammlösung bei 2 mM, also 0,5 mM final). </li><li> Nach Schritt 4 Transfer drei ausgewählten Spenderembryonen in der Schale für mit Pen / Strep Calcium-Ringer gefüllt Zelltransplantation eine feuerpolierte Pasteur-Pipette. Mit einer feinen Pinzette, sezieren eine Explantation die injizierten Zellen (ABP140-mCherry markierten Zellen) enthält. Schnell den Rest der Embryonen verwerfen. </li><li> Mit einer Wimpern, rühren Sie vorsichtig die Explantation, bis die Zellen distanzieren. </li><li> Zeichnen Sie eine einzelne isolierte Zelle in der Transplantation Nadel nach obenund verpflanzen sie in die Abschirmung eines Host-Embryo. </li><li> Mit einem feuerpolierten Pasteur-Pipette, übertragen Sie die Embryonen in einem Agarose-beschichtete Schale gefüllt mit Pen / Strep EM. Platzieren Sie die Embryonen in den Inkubator bei 28 ° C für 30 min. </li></ol> 7. Embryo Montage <ol><li> Imaging-Kammer <ol><li> Methode 1: Verwenden Sie eine Imaging - Kammer aus einem Kunststoffschieber zusammengesetzt (75 * 25 * 0,5 mm) durchbohrt mit 4 Löchern (5,5 mm Durchmesser), mit 3 mm hohen Rändern auf einer Seite (2C - D). Kleben Sie ein Deckglas auf der Rückseite, mit Sekundenkleber (Superkleber). Hinweis: Am Ende des Experiments, legen Sie die Kammer in Wasser für eine Nacht das Deckglas zu entfernen und loszuwerden Klebstoffreste mit Sandpapier erhalten. </li><li> Methode 2: verwenden 35 mm MatTek Glasbodenschalen (siehe Materialliste) mit einem 10 - mm - Loch. </li></ol></li><li> Embryo Montage <ol><li> Füllen Sie eine Glasflasche mit 1 ml heißem 0,2% Agarose in Embryo Medium auf.Halten Sie es bei 42 ° C in einem Wärmeblock. </li><li> Unter dem Fluoreszenzstereomikroskop, wählen Sie ein Embryo , in dem rot transplantierten Zellen Teil der potenziellen Prächordalplatte in grün markiert sind (dh rot transplantierten Zellen sind im grünen prospektiven Prächordalplatte, und haben die Migration in Richtung des Tier Pole gestartet). </li><li> Übertragen eines ausgewählten Embryos in die Agarose-Lösung mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette. Entsorgen Sie die mehr als Embryo Medium aus der Pipette. Zeichnen Sie den Embryo in der Pipette mit Agarose und übertragen den Embryo in der Imaging-Kammer, einen Tropfen Agarose abscheidet. Bevor Agarose gesetzt ist, orientieren, den Embryo mit einer Wimpern. Legen Sie die prospektive Prächordalplatte nach oben für die Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop oder auf dem Glasboden für die Bildgebung mit einem inversen Mikroskop. Warten Sie, bis die Agarose eingestellt ist (ca. 1 min, je nach Raumtemperatur), bevor ein anderer Embryo in der nächsten Vertiefung der Kammer Montage. Hinweis: ein Abbildungs ​​chamber 4 Vertiefungen, die erlaubt zu 4 Embryonen bis Montage. </li><li> Wenn die Agarose eingestellt ist, füllen Sie die Kammer mit Pen / Strep EM ein Austrocknen zu verhindern. </li></ol></li></ol> 8. Live-Imaging <ol><li> Verwenden Sie ein 40-facher Wassertauchlangstrecken-Objektiv. Verwenden Sie geeignete Filtersets Bild GFP und mCherry (für GFP: Anregung BP 470/40, Strahlteiler FT 510 und Emission BP 540/50; für mCherry: Anregung BP 578/21, Strahlteiler FT 596 und Emission LP 641 / 75). Stellen Sie Expositionsdauer, um die Bilddynamik zu optimieren. </li><li> Um das Bild zu allen Zellen in der Platte, zu erwerben z-Stapel, um nur einige um über der prospektiven Prächordalplatte beginnen (im Ektoderm) und ein paar &amp; mgr; m unterhalb der prospektiven Prächordalplatte endet (im Dotter). Verwenden Sie einen z-Schritt von 2 um. Zur Optimierung der Erfassungsgeschwindigkeit, wechseln Farben zwischen z-Stacks statt zwischen Frames. Hinweis: Diese zu geringe Unterschiede zwischen den grünen und roten Bilder führen können, aber es ist kein Problem, da keine genauen Co-localization zwischen den grünen und roten Signale erforderlich. Zur weiteren Abbildungszeit und Belichtung verringern, grün darf nur einmal alle 5 Zeitpunkten erworben werden, die Prächordalplatte Vorläuferzellen zu identifizieren, ausreichend ist. </li><li> Unter Verwendung solcher Einstellungen Bild bis zu 4 Embryonen innerhalb der Zwei-Minuten-Zeitintervall, das notwendig ist, Vorsprung Frequenz und Orientierung zu analysieren. Für die Analyse der Vorsprung Lebensdauer, Zeitintervall auf 30 Sekunden reduzieren, um höhere zeitliche Auflösung erhalten. Bild von 60% epiboly zu 80% epiboly. </li></ol> 9. Zelldynamik Analyse <ol><li> Laden Sie 4D-Bilder in ImageJ Hinweis: Je nach der Software für den Erwerb verwendeten Bilder gespeichert sind, in verschiedenen Formaten (eine Datei pro Bild, eine Datei pro Z-Stapel, eine Datei für das ganze Experiment). Einige ImageJ Plugins sind online verfügbar 4D Stapel zu öffnen. Unsere Daten werden als eine Datei pro Z-Stapel gespeichert. Da die Datenmenge groß sein können, kann es zweckmäßig sein, nur einen Teil davon zu öffnen (einige time Punkte oder ein Unterpunkt der z-Stapel oder 8-Bit konvertiert Bilder ...). Wir verwenden eine maßgeschneiderte ImageJ-Plugin, so zu tun, was wir gerne auf Anfrage zu verteilen. </li><li> Die Analyse der Orientierung und Häufigkeit der Zell Vorsprünge <ol><li> Verwenden Sie GFP Bilder die Hauptrichtung der zukünftigen Prächordalplatte Migration zu bestimmen. Nehmen Sie diese als Referenz für die Zell Vorsprünge Winkelmessungen. Drehen, um den Stapel, so daß diese Bezugsrichtung zu einer Seite des Bildes parallel ist. </li><li> Folgen Sie einer Zelle. Wählen Sie Winkel-Tool. Für jeden Rahmen und jedes Vorsprungs, verwenden , um die Winkel - Werkzeug um den Winkel zwischen dem Vorsprung und der Bezugsrichtung (3A) zu messen. Verwenden Sie die Analyse / Messen Befehl, um den Wert zu speichern (oder drücken Sie M auf der Tastatur). Speichern Sie die Ergebnisse als txt-Datei. Wiederholen Sie mit der nächsten Zelle. </li><li> Importieren Sie die Daten in R und Plotten Winkelverteilung als Histogramme. Verwenden Sie den Kolmogorov-Smirnov-Test (ks.test in R) unterschiedliche Bedingungen zu vergleichen. Hinweis: Der Winkel Werkzeug stellt Werte zwischen 0 ° und 180 °, was die Verwendung der klassischen statistischen Tests ermöglicht und nicht kreisförmig Tests. </li><li> Mit diesem Datensatz, Emissionsfrequenz als die Anzahl der Vorsprünge pro Zelle pro Minute zu berechnen. Verwenden Student T-Test (t.test in R) unterschiedliche Bedingungen zu vergleichen. </li></ol></li><li> Die Analyse der Zell Vorsprünge Lebensdauer <ol><li> Für jede Zelle und jeder Vorsprung, messen Vorsprung Dauer (Anzahl der Rahmen, in dem der Vorsprung vorhanden x Zeitintervall zwischen den Bildern ist). </li><li> Importieren Sie die Daten in R. Verwenden Student T-Test (t.test in R) zu unterschiedlichen Bedingungen zu vergleichen. Hinweis: Andere Migrationsfunktionen können interessant sein, zu analysieren, um die Zellmigration zu charakterisieren. Dazu gehören Zellspuren, für Geschwindigkeit, Richtung und Persistenz Messungen oder Zellmorphologie. Einige kommerzielle Software-Anwendungen sind verfügbar, um diese Funktionen zu messen, aber eine große Anzahl von Open-Source-Software-AnwenKationen und ImageJ Plugins auch zur Verfügung stehen, wie zum Beispiel Morphodynamik 12 zu analysieren ADAPT Diper zu betrachten Zelle Trajektorien und Richtungs Persistenz 13, 14 Celltrack während der Migration Zellgrenzen zu verfolgen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll stellt eine einfache Möglichkeit , die Rolle eines Kandidaten - Gen in die Zellmigration in vivo zu untersuchen, durch die Schaffung von Chimären - Embryonen Kombination Zelltransplantation mit Live - Bildgebung. Erstellung von Mosaik-Embryonen Untersuchung der Dynamik einer Zelle erfordert die Visualisierung seiner Kontur zytoplasmatischen Erweiterungen zu analysieren. oder anders bezeichnet - - Dies kann durch Markierung isolierten Z...

In vielzelligen Organismen, ist die Zellmigration wesentlich sowohl für die Entwicklung des Embryos, wo sie die Organisation von Zellen in Geweben und Organen, und für das Erwachsenenleben gewährleistet, wo es Teil Gewebshomöostase (Wundheilung) und Immunität nimmt. Neben diesen physiologischen Funktionen, ist die Zellmigration in verschiedenen pathologischen Situationen beteiligt, einschließlich, insbesondere Krebsmetastasen. Die Zellmigration ist seit Jahrzehnten in vitro untersucht, ein umfassendes Verständnis der molekularen Mechanismen , die Bereitstellung zu gewährleisten Zellbewegungen auf ebenen Flächen. In vivo jedoch Zellen werden durch eine komplexere Umgebung konfrontiert. Es ist deutlich in den vergangenen Jahren zeigte sich, dass die Migration innerhalb eines Organismus kann durch externe Signale, wie beispielsweise die extrazelluläre Matrix beeinflusst werden, Zellen oder sezernierte Chemokine benachbarten Migration führen, und dass die Mechanismen der Zellmigration Antriebs von variieren, was beschrieben wurde &lt;em&gt; in vitro 1,2. Die Mechanismen in vivo Zellmigration sichergestellt haben weniger Aufmerksamkeit bisher, vor allem wegen der erhöhten technischen Schwierigkeit, im Vergleich zu in - vitro - Untersuchungen. In vivo - Analyse der Zellmigration insbesondere migrierenden Zellen direkten optischen Zugang erfordert, Techniken einzigartige Zellen zu markieren in um ihre Dynamik und Morphologie sowie Gewinn oder Verlust der Funktion zu sehen, nähert sich die Rolle der Kandidatengene zu testen. Bisher sind nur wenige Modellsysteme diese Merkmale beherbergen wurden 3 verwendete in vivo Zellmigration zu sezieren. Wir haben vor kurzem die Migration der prospektiven Prächordalplatte in frühen Genaktivität als neues praktisches System - Modell bei der Kontrolle der in vivo Zellmigration 4,5 die Funktion der Kandidaten - Gene zu untersuchen. Prospective Prächordalplatte (auch als vordere mesendoderm bekannt) ist eine Gruppe von Zellen bei Beginn der gast bildenrulation auf der dorsalen Seite des Embryos. Während der Gastrulation wandert diese Gruppe kollektiv gegenüber dem Tier Pol des Embryos 6-8, die Prächordalplatte zu bilden, eine mesendodermal Verdickung, anterior der Chorda und die neurale Platte zugrunde liegt. Der vordere Teil der Prächordalplatte führen zur Schraffur Drüse geben, während sein hinterer Teil trägt wahrscheinlich Mesoderm 9 Kopf. Dank der externen Entwicklung und optische Klarheit des Fischembryo, Zellmigration unmittelbar werden kann und leicht in dieser Struktur beobachtet. Zelltransplantation ist eine sehr potente Technik , die 10 für die schnelle und einfache Erstellung von Mosaik-Embryonen erlaubt. Exprimieren fluoreszierenden Marker Zytoskelett in transplantierten Zellen führt zur Markierung von isolierten Zellen kann die Morphologie und die Dynamik, die leicht beobachtet werden. dies zu einem Verlust oder Gewinn von Funktions Kombination Ansätze ermöglicht die Analyse von Zell-autonome Funktionen einer Dosetritts Gen. Das dargestellte Protokoll beschreibt , wie wir die Funktion des TORC2 Komponente Sin1 in Steuerung der Zellmigration und Aktindynamik in vivo 5 beurteilt. Aber, wie in den Ergebnissen genannten und weiter diskutiert, könnte es verwendet werden , um die potentiellen Auswirkungen jeder Kandidatengens Migration in Steuern Zelle in vivo zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58&amp;nbsp;mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300085</td><td>standard thickness</td></tr><tr><td>Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300085</td><td>thin-walled</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>10&amp;nbsp;000&amp;nbsp;units penicillin and 10&amp;nbsp;mg streptomycin per ml</td></tr><tr><td>fine tweezers</td><td>Dumont Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>5F</td></tr><tr><td>glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Air transjector</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (for injection)</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (for cell transplantation)</td><td>Leica</td><td>Leica Micromanipulator</td><td></td></tr><tr><td>Hammilton Syringe</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Transplantation mold</td><td>Adapative Science Tools</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Tube connector</td><td>Narishige</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE tubing</td><td>Narishige</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing in vivo cell migration using cell transplantations and time-lapse imaging in zebrafish embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Die vorgestellte Technik wurde verwendet , um die Rolle der Sin1, einer der Kernkomponenten des Tor - Komplex 2 (TORC2), bei der Kontrolle der in vivo Zellmigration zu analysieren. Die Verwendung von Zelltransplantation ermöglicht die Kennzeichnung von isolierten Zellen und Analyse von Zell-autonome Effekte. Film S1 zeigt die Migration von transplantierten Prächordalplatte Vorläuferzellen. Aktin Kennzeichnung mit ABP140 ermöglicht die einfache Visualisierung von Aktin-reiche...

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Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

7.7K Aufrufe.  IBENS, Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure. Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration. 

Serie: Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Forschung

Krebsforschung

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Entwicklungsbiologie

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Biologie

Verwendung von Zebrafischlarven für effiziente In-vivo-Tumorstudien

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung von Krebstherapeutika mit Tumor-Xenotransplantation im Zebrafisch

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

<meta charset="utf8"></head><body>Robuste Zebrafischzelltransplantation für die Regenerations- und Entwicklungsforschung

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Kartierung der zellulären Konnektivität im Nervensystem des Zebrafisches während der Entwicklung und Regeneration

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

Analyzing

Zusammenfassung

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Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen