We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. In Vitro Transcription <ol><li> Linearisieren pCS2-H2A.F / Z-EGFP und / oder pCS2-mCherry-CAAX Vektoren durch NotI - Restriktionsenzym 31 verdauen. Unter Verwendung einer RNA in vitro - Transkription - Kit, erzeugen 5 &#39;mRNA mit Cap - Produkte aus jeder Vorlage, nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Reinige die verkappte mRNA eine Reinigung Kit. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Eluieren mit RNase-freiem H 2 O. </li><li> Bestimmung der RNA-Konzentration durch Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. (OD 260 x Verdünnung x 40 &amp; mgr; g / ml). </li><li> Verdünnen Sie die RNA zu 100 ng / &amp; mgr; l für jede H2A.F / Z-EGFP und mCherry-CAAX mit RNase-freiem H 2 O. Wenn die RNA-Konzentration zu niedrig ist, wird die Fluoreszenz vermindert oder abwesend sein. Hellere Proben werden die Bedenken hinsichtlich einer Phototoxizität und Photobleaching verringern. Auf der anderen Seite kann zu viel RNA toxisch und / oder verursachen Tor Wirkungen. Hinweis: Bewahren Sie die restlichengereinigte mRNA in -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol> 2. Zebrabärbling Zucht, Besamungs und mRNA Injection 36-38 <ol><li> Montieren Zuchtbecken mit einer Barriere, den Tank in zwei Bereiche zu trennen und jede Zuchtbecken mit Fischzuchtanlage Wasser zu füllen in der Zebrabärbling-Anlage eingesetzt. </li><li> Um vorzeitige Zucht zu verhindern, legen Sie zwei männliche Fische auf einer Seite der Barriere und zwei weiblichen Fische auf der anderen Seite in der Nacht vor der Zucht. </li><li> Am nächsten Tag, tauen die vorher hergestellten mRNA Mischung auf Eis. Ersetzen Sie das Wasser in Zuchtbecken mit frischem Wasser Aquakultur System und die Hindernisse zu beseitigen. Unmittelbar nachdem die Schranken gezogen werden, erwärmen eine Spritzgießform auf 28,5 ° C und die Ausrüstung für die Mikroinjektion eingerichtet. Hinweis: Weitere Informationen zu Spritzgießwerkzeugen entnehmen Sie bitte Gerlach 36. </li><li> Sammeln Sie alle Eier 10 bis 15 min ein Teesieb mit und spülen Sie die Eier in einen sauberen 100 x 15 mm Petrischale mit E3 Blau (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% Methylenblau). E3 Blau wird verwendet, Pilzwachstum zu verhindern und die richtige Entwicklung von Fischlarven zu gewährleisten. Weitere Informationen über die Paarung und Embryo - Entnahme siehe Gerlach 36 und Porazinkski 37. </li><li> Einbettungs one-Zelle statt Embryonen in einer Spritzgußform erwärmt und die RNA in den Dotter in der gewünschten Menge von Embryos (1A) einzuspritzen. Konto für natürliche Absterben von Embryonen und befruchteten Embryonen, die durch embryonale Injektionen auf 15% mehr Embryonen durchführen als für das Experiment benötigt. Weitere Einzelheiten über die Mikroinjektion von Zebrafischembryonen, finden Sie in Gerlach 36 und Porazinkski 37. HINWEIS: Bei der ersten Verwendung von mRNA, führen Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve Analyse die optimale Dosis für die Fluoreszenz und die Lebensfähigkeit (definiert als keine grobe Entwicklungsstörungen bis zu 5 dpf) vor der Durchführung der 5D-Bildgebung zu bestimmen. 150-200 ng / ulInjektion in Embryonen ist oft die optimale Konzentration, daher ist es ein guter Startpunkt für die Endkonzentration ist. </li><li> unter Verwendung eines modifizierten 9 &quot;Glas Pasteur Pipette vorsichtig die injizierten Embryonen aus der Form zu extrahieren. Die Pipette zu ändern, schmelzen das Ende einen Bunsenbrenner, bis er eine Kugel bildet. </li><li> Legen Sie injizierten Embryonen in einer 100 x 15 mm Petrischale in der E3-Blau und Haus in einem 28,5 ° C Inkubator. </li><li> Sechs Stunden nach der Injektion, entfernen Sie alle tot oder unbefruchtete Embryonen aus den Platten und fügen Sie auch saubere E3 Blau. Haus die Embryonen bei 28,5 ° C. </li></ol> 3. Herstellung und Einbettung von Live-Zebrafischembryonen für Imaging (Abbildung 1B) <ol><li> Zwei Stunden vor der Bildgebung, Bildschirm die injizierten Embryonen für die GFP ein fluoreszierendes Binokular mit. Legen Sie hellgrünes GFP-exprimierenden Embryonen in einem neuen 100 x 15 mm Petrischale mit E3-Blau. </li><li> Kochen Sie eine Stammlösung von 1% niedriger Schmelz Agarose durch Zugabe von 1 g niedrigschmelzende Agarose zu 100 ml E3 Blau. Nach der Verwendung des Agarose, decken den Kolben, der mit Aluminiumfolie. Die Stammlösung bleibt für bis zu einem Monat nützlich. </li><li> Aliquot 3 ml der geschmolzenen Agar in einer 17 x 100 mm Kulturröhrchen. in einem 42 ° C Wasserbad bis zur Verwendung Halten Sie die Agarose warm, indem die Kulturröhrchen platzieren. Bereiten Sie eine 15 mM Tricaine Lösung in VE - Wasser , um die Genaktivität zu betäuben 36. HINWEIS: Wenn Bildgebung zu früheren Zeitpunkten gewünscht wird, kann die Konzentration von Agar als niedrig 39 als 0,3% verringert werden. </li><li> Bringen Sie die 15 mM Tricaine, abgeschirmt Embryonen, niedrige Schmelz Agarose, E3 Blau, und ein 35 mm Deckglas Boden Kulturschale zu einer Dissektion Lichtmikroskop. Sorgfältig das Chorion mit # 5 Pinzette des Embryos zu entfernen. Tun Sie dies für drei Embryonen. </li><li> Legen Sie die dechorionated Embryonen in einem separaten Behälter betäubt werden. Der Deckel des Deckglases Bodenschale wird oft für diesen Zweck verwendet. Mit Hilfe einer Transferpipette, fügen Sie drei Tropfen (ungefähr 150 ul)von 15 mM Tricaine in die Schale von 5 ml E3 blau (wenn Sie den Deckel des Deckbodenschale verwenden) oder bis Embryonen ausreichend betäubt wurden. Darüber hinaus fügen Sie 3-4 Tropfen (ca. 150 bis 200 &amp; mgr; l) von 15 mM Tricaine Lösung für das 1% geschmolzener Agarose Rohr. </li><li> Mit einer p200 Pipette mit 1 cm der Pipettenspitze abgeschnitten; übertragen Sie die narkotisierten Embryonen auf dem Deckglas Boden Gericht. Entfernen Sie überschüssiges E3 Blau: Tricaine Lösung. </li><li> Langsam von 5 bis 10 &amp; mgr; l von niedrigschmelzende Agarose: Tricaine Lösung über die Embryonen, jeden Tropfen zu halten trennen die Embryonen versehentlich geschlossen haben, um sicherzustellen, nicht driften zueinander. Achtung: Wenn die Agarose zu warm ist, wird es den Embryo schädigen. Eine gute Temperatur des Agar zu halten, bei 42 ° C. </li><li> Unter Verwendung einer 21 G 1 ½ Nadel auszurichten sanft den Embryo in der Agarose auf die gewünschte Position. Wenn ein inverses Mikroskop für Zeitraffer-Bildgebung unter Verwendung richten Sie die Region of Interest (ROI) so nah an dem Deckglas als possible. Anmerkung: Für allgemeine Zwecke, der Schwanzbereich bietet eine einfache Ausrichtung und Klarheit aufgrund der relativ dünnen Gewebe (1A). Andere Gewebe, wie beispielsweise die Epithelschicht umgeben Eigelb und fin Falten können 28,29 verwendet werden. Diese Gewebe bieten große Klarheit, aber diese Regionen sind nur wenige Zellschichten dick. Für den Zweck dieses Protokolls ist es dem Bild vorteilhaft Schwanzbereich, um so viele Zellteilungen wie möglich erfassen. </li><li> Lassen Sie ein paar Minuten zur teilweisen Verfestigung des Agar. Verwenden Sie die Nadel ein kleines Stück Agar auseinander zu brechen, um seine Verfestigung zu testen. Wann kann ein Stück Agar weg aus dem Drop gezogen werden, gehen Sie zum nächsten Schritt. </li><li> Decken Sie die gesamte Deck mit niedriger Schmelz Agar eine Kuppel über den eingebetteten Embryonen zu bilden. Lassen Sie das Agar , bevor die Schale für die konfokale Abbildung (Abbildung 1A) zu festigen. </li><li> Während der Agar Erstarrungsprozesses (ca. 10 min dauert), bereiten Sie 3 ml of E3 Blaue Lösung mit fünf Tropfen (etwa 250 &amp; mgr; l) 15 mM Tricaine auf über den eingebetteten Embryonen während der Bildgebung platziert werden. </li></ol> 4. 5D konfokale Bildgebung von Live Zebrafischembryonen 40,41 HINWEIS: Siehe Ariga 40 und O&#39;Brien 41 für Details, wie 5D Bildgebung mit anderen konfokale Systeme durchzuführen. Für Z-Intervall, Z-Stack, Z-Tiefe, Zeitintervall und 5D Definitionen siehe Abbildung 1C. <ol><li> Öffnen Sie die Imaging-Software und stellen Sie das Mikroskop 60x NA 1,4 Objektivlinse. Bewerben Sionsöl auf die Objektivlinse und legen Sie die Kulturschale in den Diahalter auf dem Mikroskoptisch. Mit Hilfe der Achsensteuerung, zentriert um den Embryo von Interesse über der Objektivlinse und bringen nach oben in die Objektivlinse die Kulturschale zu erfüllen. </li><li> Klicken Sie auf das Okular-Symbol und wechseln Sie in das GFP-Filter auf dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf den ROI. Die Konzentration auf das Gewebe am nächsten an der Deck wird offer die besten Bildergebnisse. </li><li> Entfernen Sie die Verriegelung. Wählen Sie die GFP und mCherry Kanäle (voreingestellten Wellenlängen in Software) und stellen Sie die Zeile mit durchschnittlich Option normal. </li><li> Verwenden Sie &quot;Ansicht / Erfassungs-Bedienelemente / A1 Scanbereich&quot; Befehl auf der A1 Scanbereich Werkzeug zu öffnen. </li><li> Beginnen Sie das Scanning. Unter Verwendung des Achs-Controller, positionieren Sie den Embryo, so dass der Scan-Bereich mit so viel von der Zebrabärbling wie möglich gefüllt ist. Die Laserleistung muss nicht zu diesem Zeitpunkt optimal. Senken Sie die Laserleistung, um unnötige Photobleichens vermeiden. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Ansicht / Acquisition Kontrollen / ND Erwerb&quot; Befehl, um die ND Erwerb Systemsteuerung zu öffnen. </li><li> Beginnen Sie das Scannen der Z-Stack-Parameter einzustellen. Stellen Sie den Z-Stack obere Grenze, wo die Zellen sind nicht im Fokus und untere Grenze, wo Zellen sind nicht mehr sichtbar. Ermöglichen eine 3 um Raum oberhalb der Probe für das Wachstum und die Zellbewegung, die in das Bildfeld erweitern kann. Der Z-Stack für die Figuren in diesem Pro gezeigtkoll bedeckt eine Z-Tiefe von 40 &amp; mgr; m im Embryo Schwanz. </li><li> Stellen Sie den Z-Intervall bis 2 um Schrittweite. Im Durchschnitt eine Zelle ist 10 &amp; mgr; m im Durchmesser; daher 2 &amp; mgr; m werden fünf Intervallen von Abbildungsdaten zu erzeugen für jede Zelle analysiert werden. HINWEIS: Die Tiefe des Bildes, das abhängig von der Z-Intervall erfasst werden können. Z Auflösung wird geopfert Bild so viele Zellen, um die Gesamttiefe in der Z-Dimension zu gewinnen Mitose wie möglich (große Z-Tiefe) unterzogen. Die inverse wahr ist, daß durch die Schrittgröße abnimmt, wird Z Auflösung gewonnen, während Z-Tiefe (kleine Z-Tiefe) geopfert wird. </li><li> Stellen Sie das Bild Laserleistung, HV, und Ebenen ausgeglichen. Für die Experimente in diesem Protokoll demonstriert, verwenden Sie die folgende Laserleistung, HV, und Pegel an den entsprechenden Ebenen versetzt sind, jeweils für die GFP-Kanal; 2 bis 5, 120-140, und -9 bis -11. Für den mCherry Kanal, verwenden Sie die folgende Laserleistung, HV, und Offset-Pegel sind; 3 bis 6, 120-140, und -3 bis-8. Nachdem die Parameter eingestellt sind, schalten Sie die Scan unnötig Laserbelichtung zu verhindern, die Phototoxizität und Photobleaching der Probe führen kann. </li><li> Wählen Sie die Mittelungs Symbol 2x Linie. &quot;Nein Lungs&quot; erzeugt ein körniges Bild, während &quot;4x Linie durchschnittlich&quot; drastisch erhöht die Scan-Zeit. Die Verwendung von 2x Linie Lungs bietet die beste Bildqualität und schnellste Scan-Zeit. </li><li> Wählen Sie das entsprechende Zeitintervall und Zeitdauer, die für das Experiment. Für Wildtyp - Divisionen, zwei-Minuten - Zeitintervalle für 2 Stunden ist am besten für mitotische Dauer Bestimmung (verwendet in den 1, 2, 3A und 3B). Räume, die die Spindelanordnung Kontrollpunkt für länger als 30 Minuten sind besser geeignet für alle fünf Minuten für vier Stunden aktivieren , um Fluoreszenz zu erhalten , wie in 3C gezeigt. </li><li> Überprüfen Sie die &quot;Datei speichern&quot; ein und benennen Sie die Datei automatisch die Datei zu speichern, wie es erworben wird. Überprüfen Sie alle pametern richtig und drücken Sie &quot;Start Run&quot; gesetzt. </li><li> Nach dem Erwerb abgeschlossen ist, wird die Datei in einem dreidimensionalen Format, klicken Sie auf die Lautstärkeschwelle Symbol anzuzeigen. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Verwendung dieses Verfahrens ermöglicht eine Kernhülle Abbau, Bildung einer Metaphase Platte durch Mikrotubuli-kinetochore Anhänge und Segregation von Schwesterchromatiden zu schließen zwei neue Zellen in vivo zu bilden , und in einer zeitabhängigen Weise. Die Fähigkeit, die Mitose in Zebrabärbling zu beobachten ist vorteilhaft gegenüber fixierten Proben und Zellkultur-Systeme, da die Zellen in die natürliche Physiologie abgebildet wird, das Gewebe transparent ist, die für fluoreszierende Proteine ​​können verwendet werden, sie entwickeln sich relativ schnell, und Zeitraffer-Bildgebung erworben werden. Verwendung adulter Zebrabärbling für dieses Protokoll beschränkt ist aufgrund der begrenzten Z-Tiefe, die aufgrund des dickeren Gewebe erworben werden kann, der nicht der Haut oder der Augen ist. Während transgene Tiere H2A.F / Z-EGFP und mCherry-CAAX exprimierenden für den gleichen Zweck verwendet werden konnten, ist die Vielseitigkeit und Einfachheit der mRNA-Injektionen in verschiedene mutierte Zebrabärbling vorteilhaft gegenüber genetischen Kreuzungen. In Situationen, in denen mitotischen Analyseerforderlich in drei Tagen nach der Befruchtung (dpf) oder später Embryonen würden transgene Tiere notwendig sein, aufgrund der Halbwertszeit von RNA in diesem sich rasch entwickelnden Organismus. Andere fluoreszierende Proteine, die für die Mitose Visualisierung sind zu diesem Protokoll zugänglich. Zum Beispiel ist H2B-GFP mRNA eine Alternative zu H2A.F / Z-EGFP für Chromatin und bietet ähnliche Kennzeichnung. Andere fluoreszierend-markierte Proteine, die in dieser Technik verwendet werden können, schließen POM121, Centrin, Eb1, Hec1 und EMTB, die für lebende im Embryo Abbildung der Kernhülle, Centriolen plus-Ende von Mikrotubuli, kinetochore und Mikrotubuli gestatten würde, jeweils 32,47-51. Dieses Protokoll hat mehrere Abbildungsschritte, die Qualität der Ergebnisse durchgeführt werden müssen, um zu erreichen: 1) Stellen Sie sicher, dass die mRNA Qualität und Konzentration zu optimieren, um die hellste Fluoreszenz und keine Toxizität wie möglich zu erhalten. Je mehr Fluoreszenz wird weniger Laserbelichtung führen und daher weniger photobleaching und Phototoxizität. 2) Der Embryo muss vollständig betäubt und sicher in den Agar. Kleinere Bewegungen werden die Ergebnisse verändern und das Experiment ruinieren könnte. 3) Die Agarkonzentration muss angemessen sein für das Stadium der Embryo abgebildet zu wünschen übrig. Bei 24 HPF und weitere 1% niedrigschmelzende Agarose ist geeignet. Wenn Bildgebung bei 12 HPF oder früher, eine 0,3% Agarose - Lösung sollte 39 verwendet werden. 4) Der ROI im Embryo sollte möglichst nahe an der Deck wie möglich sein. Dieser Schritt schränkt man nicht den Schwanz Bildgebung. Die Augen, der Haut, Rückenbereich, Eigelb und Flossenfaltung sind Beispiele für andere Bereiche, die dieses Protokoll verwenden können. Zeit ist der entscheidende Faktor, der dieses Protokoll von der Bildgebung fixierte Embryonen oder Gewebe trennt. Wenn die Z-Stapel - Einrichtung, Z-Intervall, Zeitraffer-Intervall, und Zeitraffer-Dauer ist es wichtig , den Kontext des Experiments (1C) im Auge zu behalten. Ein Wildtyp Zellteilung dauert in der Regel ca. 25 min bei 24 HPF. in thBeispiel 2 &amp; mgr; m Z-Intervall in 40 &amp; mgr; m von Gewebe in einem Z-Stack, mit zwei Minuten Zeitintervall für zwei Stunden ist hat sich als wirksam erwiesen. Des Weiteren wird in Embryonen mit defekten Mitose-Zellen in einem mitotischen Arrest am ehesten vorhanden sein, drastisch Zellteilung Zeiten zu erhöhen. Um mehrere volle Divisionen erwerben, sollte die Zeitdauer erhöht werden, dh von 2 h bis 4 h. Eine längere Erfassungszeit wird die Probe auf mehr Laserleistung ausgesetzt werden und das Risiko von Photobleaching und Phototoxizität erhöhen. In diesem Fall sollte das Zeitintervall zwischen jedem Z-Stapel erhöht werden. Dynamische Chromosoms Bewegungen durch Erhöhen des Zeitintervalls zwischen Z-Stapeln geopfert werden, aber Zeitdauer gewonnen wird. Dies ist notwendig, wenn Zellteilungen Bildgebung, die mehr als zwei Stunden dauern kann. Obwohl es nicht direkt besprochen wurde, kann dieses Protokoll optimiert werden, um ein Bild mit höherer Auflösung in der Z-Ebene zu erhalten, mo, um mehr zu visualisieren genau einzelne Chromosombesserungen. Beispielsweise sind in 4A zwei missegregated Chromosomen beobachtet. Das Chromosom nach rechts (festgestellt durch den dicken Pfeil) zunächst hell und scharf, aber dimmt in den letzten paar Frames. Mit einem 2 &amp; mgr; m Z-Intervall fällt das uncongressed Chromosoms zwischen dem Z-Intervall. Capturing Minute Bewegungen und einzigartige Chromosomenveränderungen kann durch Erhöhung der Auflösung in der Z-Ebene erreicht werden. Um dies zu tun, Zoom auf einer einzelnen Zelle auf der A1 Scanbereich Werkzeug. Wenn die Z-Stack-Parameter einrichten, einen kleineren Z-Intervallabstand verwenden. Eine empfohlene Bereich ist von 0,5 bis 1 &amp; mgr; m. Darüber hinaus zwischen den einzelnen Z - Stack , das Zeitintervall abnimmt werden weichere Übergänge zwischen den einzelnen Zeitrahmen zu erstellen, dh von zwei Minuten auf 30 Sekunden - 1 min. Eine Einschränkung auf diese Art von Bildgebung ist die begrenzte Z-Tiefe, die erreicht werden kann. Aufgrund der kleineren Z-Intervall und das Zeitintervall, mehr Gewebe zu den Lasern in einem kleineren Zeitrahmen ausgesetzt werden. Zur Überwindung dieser, smaller Zeitdauer verwendet werden kann; dies ist jedoch auch davon abhängig, wie lange der Forscher wie Divisionen erfassen würde. Eine Analogie, die mit diesen Modifikationen kann helfen, ist ein Z-Stack als eine Ziehharmonika zu denken. Der Abstand zwischen jeder Falte des Balges ist die Z-Intervall und die Z-Tiefe wird durch die Länge des Akkordeons dargestellt. In einem Fall, wo man möchte nicht mehr Laser-Exponierung der Probe zufließen, wie die Ziehharmonika Ausdehnungen (erhöht die Z-Tiefe), wobei der Abstand zwischen den Falten des Balgs (Z-Intervall) müssen ebenfalls erhöhen. Die inverse ist, dass als Akkordeon Verträge wahr, die Z-Tiefe abnimmt. Die Falten des Balgs Vertrag als auch zu einer Abnahme in Z-Intervall entspricht. Diese Analogie kann zu festen und Live-Proben angewendet werden. Die Komplexität wird in diesem Protokoll erhöht, wenn die Zeit der Gleichung hinzugefügt wird. Es gibt eine begrenzte Menge an Zeit, die der Akkordeonist verlängern oder das Akkordeon Vertrag. Diese Vertrets das Zeitintervall. Um mehr Abstand (Z-Tiefe) das Zeitintervall abdecken muss wachsen. Wie gut, um mehr Musik zu hören, muss man für einen längeren Zeitraum (Zeitdauer) In Bezug auf dieses Protokoll zu hören, um mehr Zellteilungen zu erleben, muss die Zeitdauer erhöhen. Ein Compoundierung Faktor im Auge zu behalten ist, dass die mehr Musik, die gespielt wird, desto müder die Akkordeonisten. Dies ist analog zu dem Endmaß, Fluoreszenz. Je mehr Laserbelichtung die Probe gegeben wird, wird die mehr Photobleaching und Phototoxizität (Müdigkeit) ein Thema. Zusammengefasst Details dieses Protokoll eine Methode der Mitose in einer Live Zebrafischembryo für verschiedene Analysen zu visualisieren; 1) Teilungszahl 2) Teilungszeit 3) Division Schicksal und 4) hohe Auflösung Chromatin Dynamik. Mehrere Möglichkeiten für mitotische Komponenten Visualisierung Attachments Bereich von Mikrotubulus-Dynamik kinetochore Zentriol angewendet werden kann. Kombinieren der FähigkeitBildgebungs Mitose in vivo mit den jüngsten Fortschritte in der Genom Bearbeitung in Zebrabärbling wird es leicht Mutanten in verschiedenen Aspekten der Mitose zu erzeugen 25,26,52-56 menschlichen Krankheit in einem Vertebraten Organismus zu modellieren.

Mitose ist ein wichtiger zellulärer Prozess essentiell für das Wachstum, Differenzierung und Regeneration in einem lebenden Organismus. Von der genauen Zubereitung und Replikation von DNA in der Interphase, wird die Zelle zu unterteilen grundiert. Die erste Phase der Mitose Prophase, wird durch die Aktivierung von Cyclin B / Cdk1 eingeleitet. Prophase wird durch Kondensation von Chromatin Material in Chromosomen charakterisiert. Kernhülle Schlag erfolgt am Übergang zwischen der Prophase und Prometaphase. In Prometaphase, Zentrosomen, die Keimzentrum für Spindelbildung, beginnen zu entgegengesetzten Polen während Verlängerung Mikrotubuli auf der Suche nach kinetochore Anlage zu migrieren. Nach Befestigung, bis Ende auf Conversions Mikrotubuli Befestigung und Spannungskräfte orientieren die Chromosomen eine Metaphaseplatte 1 bildet. Wenn alle Chromosomen korrekt, wird die Spindelanordnung Kontrollpunkt zufrieden, cohesin Ringe halten die Schwesterchromatiden zusammen gespalten gebunden sind, und Mikrotubuli verkürzen Schwester zu ziehenChromatiden zu entgegengesetzten Polen während der Anaphase 2,3. Die letzte Phase, Telophase beinhaltet Dehnung der Zelle und Rückbildung der Kernhülle um die beiden neuen Kernen. Zytokinese vervollständigt den Teilungsprozess durch das Zytoplasma der beiden neuen Tochterzellen 4-6 trennt. Änderung der Schlüssel mitotischen Wege (dh Spindelanordnung Kontrollpunkt, Zentrosom Vervielfältigung, Schwester-Kohäsion, usw.) Kann in der Metaphase Verhaftung missegregation von Chromosomen führen, und genomische Instabilität 7-10. Letztlich können Defekte in Wege steuern Mitose verursachen Entwicklungsstörungen und Krebs, erfordert die Visualisierung von Mitose und ihre Mängel in einem Live, Wirbel mehrzelligen Organismus 16.10. Zebrabärbling-Embryonen dienen als große Modellorganismus für die Live-Darstellung aufgrund des transparenten Gewebe, einfache Mikroinjektion und schnelle Entwicklung. Mit Zebrabärbling, ist das übergeordnete Ziel dieses Manuskriptein Verfahren der lebenden 5D (Abmessung X, Y, Z, Zeit und Wellenlänge) Abbilden von Mitose 17 (1C) beschreiben. Die Verwendung von Mutanten Zebrabärbling defekt in verschiedenen mitotischen Bahnen zeigen die Folge solcher Defekte. Für dieses Protokoll, Aurora B und ESCO2 Mutanten wurden diese Mängel zu illustrieren gewählt. Aurora B ist eine Kinase, die ein Teil des Chromosoms Fahrgast Komplex (CPC), die zur Spindelbildung und Mikrotubuli Befestigungs ist. Es ist auch für Spaltungsfurche Bildung in Zytokinese 18,19 erforderlich. In Zebrabärbling führt Aurora - B - Mangel zu Defekten in Furche Induktion, Zytokinese und Chromosomensegregation 20. ESCO2, andererseits ist eine Acetyltransferase, die Schwester - Chromatid - Kohäsions 21,22 wesentlich ist. Es acetyliert cohesin auf dem SMC3 Abschnitt des Rings so cohesin 23 korrekte Chromosomensegregation in der Metaphase-Anaphase Übergang zu gewährleisten stabilisieren. Der Verlust der ESCO2 in Zebrabärbling führt zu chromosome missegregation, vorzeitige Trennung der Schwesterchromatiden, genomische Instabilität und p53-abhängige und unabhängige Apoptose 24,25. Aufgrund der Verfügbarkeit, auroraB hi1045 und ESCO2 hi2865 mutant Zebrabärbling (nachfolgend als Aurb m / m und ESCO2 m / m, jeweils) werden verwendet , um 25-27 um diese Technik zu veranschaulichen. Die Kopplung der konfokalen Mikroskopie mit Fluoreszenz-markierten Zellmaschinerie hat Forscher aktiviert Chromatin und Zellmembran Dynamik während der Mitose 25,28,29 visualisieren. Fluorescent-markierte Histone haben in der Vergangenheit verwendet wurden Chromatin sichtbar zu machen. Histone sind Kernproteine ​​bestehen aus vier verschiedenen Paaren (H2A, H2B, H3 und H4), die für die Nukleosomenstruktur verantwortlich sind, die 30 Chromosomen komponiert. Während H2B ist wohl das am häufigsten verwendete Histon für fluoreszierende ProteineMaus und Zellkultur, die Verwendung von Histon 2A, Familie Z (H2A.F / Z) ist für den Einsatz in Zebrabärbling 31,32 gut bewährt. Concanavalin A und Casein - Kinase - 1-gamma beispielsweise lokalisiert auf der Zellmembran und haben in Visualisierung der Zellmembran in Seeigeln und drosophila 33,34 vorher wirksam erwiesen. Andere Studien haben gezeigt , dass die CAAX fluoreszierend-markierte Protein bezeichnet die Zellmembran und war erfolgreich in Zebrabärbling 31. CAAX ist ein Motiv, das durch post-translationale Modifikationsenzyme wie Farnesyltransferasen und geranylgeranyltransferases erkannt wird. Änderungen durch diese Enzyme verursachen Proteine ​​membranassoziiertes zu werden, wodurch die Zellmembran Markierung 35. Aufgrund der Vorbenutzung in Zebrabärbling, wählte dieses Protokoll H2A.F / Z und CAAX zu etikettieren Chromatin und die Zellmembran zu verwenden. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht es dem Forscher Mitose auf Einzelzellebene zu überwachen einzelnen Chromosom zu beobachtenDynamik, sowie gleichzeitig mehrere Zellteilungen zu überwachen, die Gewebedifferenzierung und Entwicklung auswirken können. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Abbildung der Dynamik von Chromosomensegregation während der Mitose auf Einzelzellebene. Innerhalb dieses Manuskript, die Fähigkeit, mehrere mitotische Teilungen zu beobachten, Teilungszeit berechnen und die mitotische Phänotypen entziffern wird dargestellt und diskutiert werden. Durch die Verwendung dieser Parameter kann, physiologisch relevanten Daten durch mitotische Mängel betroffen mehrere Krankheitszustände gesammelt und angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1094">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pCS2 vectors</td>
			<td style="width:175px;">Gift from K. Kwan</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:460px;">For plasmid of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:175px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>For restriction digest of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">mMessage SP6 kit</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>For in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:175px;">Qiagen</td>
			<td style="width:129px;">74104</td>
			<td style="width:460px;">For purifying mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 x 15 mm petri dishes</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">FB0875712</td>
			<td>For housing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">microinjection mold</td>
			<td style="width:175px;">homemade</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For holding embryos during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Agarose II</td>
			<td style="width:175px;">Amresco</td>
			<td style="width:129px;">0815-25G</td>
			<td>For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Tricaine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>For anesthetizing embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">S9888</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">P3911</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C8106</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">M7506</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Methylene Blue Hydrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">MB1</td>
			<td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">100 mm culture tube</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-819-812</td>
			<td>For melted agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">35 mm glass coverslip bottom culture dish&#160;</td>
			<td style="width:175px;">MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-20-C&#160;</td>
			<td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">#5 tweezers</td>
			<td style="width:175px;">Dumont</td>
			<td style="width:129px;">72701-D</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">21G 1 1/2 gauge needle&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:129px;">305167</td>
			<td>For positioning embryos in agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon AZ100</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon A1+</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For time-lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Confocal software</td>
			<td style="width:175px;">NIS Elements AR 4.13.00</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td>For image acquisition and processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

Mitose ist entscheidend für organismal Wachstum und Differenzierung. Der Prozess ist sehr dynamisch und erfordert Ereignisse bestellt richtige Chromatin-Kondensation, Mikrotubuli-kinetochore Befestigung, Chromosomensegregation und Zytokinese in einem kleinen Zeitrahmen zu erreichen. Fehler in der heiklen Prozess kann in der menschlichen Krankheit, einschließlich Geburtsschäden und Krebs führen. Traditionelle Ansätze menschlicher Zustände mitotischen Krankheit untersuchen verlassen sich oft auf Zellkultursysteme, die die natürliche Physiologie und Entwicklungs / gewebespezifischen Kontext vorteilhaft fehlt, wenn die menschliche Krankheit zu studieren. Dieses Protokoll überwindet viele Hindernisse, die durch einen Weg, um sichtbar zu machen, mit hoher Auflösung, Chromosomendynamik in einem Wirbeltier-System, das Zebrafisch. Dieses Protokoll wird ausführlich ein Ansatz, der verwendet werden kann , dynamische Bilder von sich teilenden Zellen zu erhalten, die Folgendes umfassen: In - vitro - Transkription, Zebrabärbling Zucht / Sammeln, Embryo Einbettung und Zeitraffer-Bildgebung. Optimierung und modifikationen dieses Protokolls werden ebenfalls untersucht. Mit H2A.F / Z-EGFP (Etiketten Chromatin) und mCherry-CAAX (Etiketten Zellmembran) mRNA-injizierten Embryonen, die Mitose in AB - Wildtyp, auroraB hi1045 und ESCO2 hi2865 Mutante Zebrabärbling visualisiert. Hochauflösende Live-Bildgebung in Zebrabärbling ermöglicht eine mehrere Mitosen zu beobachten, statistisch zu mitotischen Defekten und den Zeitpunkt der mitotischen Progression zu quantifizieren. Darüber hinaus Beobachtung der qualitativen Aspekte , die unsachgemäß mitotische Prozesse definieren (dh congression Defekte, missegregation der Chromosomen, etc.) und falsche Chromosomen Ergebnisse (dh Aneuploidie, Polyploidie, Mikronuklei, etc.) beachtet werden . Dieser Assay kann zur Beobachtung der Gewebedifferenzierung / Entwicklung angewendet werden und ist zugänglich für die Verwendung von mutierten Zebrafisch und pharmakologischen Mitteln. Visualisierung, wie Mängel in der Mitose zu Krebs und Entwicklungsstörungen führen wird starkVerständnis der Pathogenese der Krankheit zu verbessern.

Abbildung 2 zeigt die Fähigkeit , viele Zellteilungen mit einem weiten Feld Ansicht eines AB Wildtyp Zebrabärbling Schwanz zu beobachten. Über sieben mitotischen Zellen werden in einem 14 min Zeitrahmen (Film 1) abgebildet. Innerhalb der zwei Stunden Zeitverlauf über 40 mitotische Ereignisse wurden gefangen genommen. Im Durchschnitt 50 teilende Zellen wurden in der AB und 30 teilende Zellen in aur B m / m Embryonen (2B) beobachtet. Zur Berücksichtigung der Anzahl der Zellen abgebildet wird , abgebildet wird das Verhältnis von mitotischen Zellen zu Anzahl der Zellen wurde berechnet (Abbildung 2C). Diese Daten legen nahe , dass es nicht eine geringere Anzahl von Zellen ist durch Mitose in den aur B m / m Embryonen (2B) , jedoch eine geringere Anzahl von Zellen abgebildet werden würde. Die Fähigkeit, eine statistisch signifikante Anzahl von Veranstaltungen wie diese zu erwerben, wird die statistische Aussagekraft unterstützen. 3 erweitert auf diese Technik mitotischen Dauer enthalten zu quantifizieren. Sobald eine Zeitraffer-Sitzung erworben wird, kann eine einzelne Zelle für Zeit in der Mitose mit ausreichender Auflösung mit dem Zoom - Werkzeug (3A, B) ausgegeben werden analysiert. Mitotischen Dauer wird manuell berechnet durch Zählen, wie viele Zeitintervalle eine Zellteilung in Anspruch nehmen. Die Anzahl der Zeitintervalle wird dann durch das Zeitintervall zwischen jedem Z-Stapel multipliziert. Beispielsweise in 3C hat die Abteilung 12 Zeitintervalle und das Zeitintervall zwischen den einzelnen Z-Stapel betrug 2 min. Daher wurde die Teilungszeit für diese Zelle 24 min. Die durchschnittliche AB Wildtyp Teilungszeit beträgt 25 min und 58 min für Aurb m / m (3B). Eine verlängerte Teilungszeit wie im Aurb m gesehen / m legt nahe , dass die Spindelanordnung checkpoint nicht durch fehlerhafte kine erfüllt wordentochore Anhänge 1,2. Einen genaueren Blick auf die gezoomt in Wildtyp - Embryonen, kann jede mitotischen Phase unterscheiden (3C, Movie 2). Darüber hinaus können mitotischen Defekten in der Aurb m / m Embryo beobachtet werden , die mitotischen Arrest umfassen und scheiterte in einer zweikernigen Zelle cytokinesis resultierende und die anschließende Bildung einer Mikrokern - (3D, Movie 3). Diese in der Analyse gezoomt zeigt mitotischen Defekte unterstützt die erhöhte Teilungszeit in 3B erworben. Verschiedene andere diverse mitotischen Defekte und Zellschicksale , die 4 in erforscht Figur begegnet werden kann; im ESCO2 + / m und ESCO2 m / m Embryonen nachgewiesen. In einem ESCO2 + / m Embryo, sind fehlerhafte Chromosomenbewegungen erfasst und kann als congression Defekt definiert werdens. Congression Defekte auftreten, wenn unsachgemäße Mikrotubuli Anhängen werden. Diese Defekte verursachen den Ausfall der Chromosomen in Richtung der Metaphaseplatte zu migrieren. Gepaart Schwesterchromatiden, besonders erkennbar an mindestens 20 und 46, die nicht in Richtung der Metaphaseplatte congressed haben zunächst bei min 14. Anaphase beobachtet werden Beginn der Schwesterchromatiden trennt an der Metaphaseplatte sowie die paarigen Schwesterchromatiden nach rechts ausgerichtet ist, in Minute beobachtet 50. Zusätzlich ist möglich Mikronukleus - Bildung , da diese getrennt Schwesterchromatiden beobachtet bleiben außerhalb des Zellkerns (T = 50, 4A, Film 4) isoliert. In Figur 4B ist ein multipolares Teilung visualisiert (Movie 5). Multi-polar Divisionen treten häufig aufgrund von Zentrosomen Verstärkung, aber auftreten können , durch andere 42 bedeutet. In 4C ist ein ESCO2 m / m Zelle zeigt zunächst eine vorzeitige Schwesterchromatiden separatIon und Spindeldreh 9,43,44. Eine weitere Zelle Schicksal in diesem Panel zeigte eine anaphase Brücke , in dem merotelic Anlagen ungelöst 45,46 sind. Die anaphase Brücke kann erst in Minute zu sehen ist 62. Das Chromatin erscheint vorzeitig decondense, während die Zelle cytokinesis unterliegt. Als Zytokinese tritt, trifft der Teilungsfurche auf den dekondensiert Chromosomen und, wie abscission auftritt, das Chromatin Material zieht eine Anaphase Brücke (4C, Film 6) zu bilden. Obwohl hier nicht gezeigt, um die zellulären Schicksale zu quantifizieren sind, erfassen alle mitotischen Teilungen in jedem Rahmen und die Art des Zellschicksals sie zeigen. Teilen Sie die Anzahl von Zellen in jedem Schicksal durch die Gesamtzahl der Divisionen erfasst und mit 100 multipliziert das Zellschicksal Prozentsatz zu berechnen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig1.jpg" /> Abbildung 1: Protokoll Zeichnungen Gliederung. (EIN) </strong&gt; Schematische Darstellung der Progressionsbildgebungstechnik beginnend bei H2A.F / Z-GFP und CAAX-mCherry mRNA - Injektionen, dann auf zu konfokale Mikroskopie von Embryonen und Prozession einzubetten. (B) Schematische Darstellung des Embryos Einbettungsprozess. Die injizierten Embryonen müssen dechorionated und betäubt werden. Embryos werden dann an dem Deckglas-Bodenschale überführt und überschüssiges E3 Blau entfernt wird. Niedrige Schmelz Agar wird verwendet, getrennte Kuppeln zu schaffen jeden Embryo bedeckt. Richten Sie die Embryonen so der Schwanz der Nähe des Deckglases ist. Warten Sie zwei Minuten vor der Zugabe von Agar die ganze sie abgedeckt werden. Warten Sie, bis der Agar , bevor er nach Bild verfestigt wird. (C) Schematische Darstellung der Begriffe Z-Intervall, Z-Stack, Z-Tiefe, Zeitintervall, Zeitdauer und 5D zu definieren , die in dem Protokoll und Diskussion verwendet werden. Z-Intervall wird als der Abstand zwischen jedem Bild definiert als das Mikroskop tiefer in die Probe bewegt, um eine Z-Stapel zu erstellen. Z-Stapels alle Bilder durch ein aufgenommenesProbe an der Z-Intervall definiert. Die zurückgelegte Strecke in einer Z-Stack definiert die Z-Tiefe. Zeitintervall ist die Menge an Zeit zwischen einem Z-Stapel und dem nächsten Z-Stapel eine Zeitraffer-Bild zu erzeugen. Zeitdauer ist die Gesamtzeitmenge zu Bildes verwendet. 5D ist als die Dimensionen X, Y, Z, Zeit definiert, und Fluoreszenzemission. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/54218fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/54218fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig2.jpg" /> Abbildung 2. Time-Lapse - Imaging Erfasst Multiple mitotische Ereignisse in einem Live - Embryo Zebrabärbling. (A) Zeitrafferbilder aus einem Experiment heraus gezoomt in einer AB - Wildtyp, 24 HPF Zebrabärbling mehrere mitotische Ereignisse zeigt. Sterne weisen auf sieben Zellen in der Mitose. t = Zeit in min verstrichen ist. Maßstabsbalken = 5 &amp; mgr; m. (B) Die Anzahl der mitotischen cells in AB und Aurb m / m Zebrabärbling Schwänze bei 24 HPF beobachtet. Mittelwert ± st. dev., n = 3 Embryonen / Genotyp. (C) Das Verhältnis von mitotischen Zellen pro Gesamtzahl der Zellen in AB und Aurb m / m Zebrabärbling Schwänze bei 24 HPF. Mittelwert ± st. dev., n = 3 Embryonen / Genotyp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/54218fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/54218fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig3.jpg" /> Abbildung 3. Einzelzellanalyse Captures Jede mitotischen Phase und mitotischen Dauer. (A) Eine Zelle aus dem weiten Feld Ansicht von AB Wildtyp ausgewählt, 24 HPF Zebrafischembryo in 2A gezeigt. (B) der Division Zeit für AB beobachtet und Aurb m / m Zellen und von Folgern Kernhülle bre berechnetakdown (NEB) bei der ersten Beobachtung von kondensiertem Chromatin in einer Zelle zur Bildung von zwei neuen Tochterzellen. n = 3 Embryonen / Genotyp, n = 66 Divisionen für AB, n = 29 Divisionen für Aurb m / m, *** p-Wert &lt;0,001. (C) AB Wildtyp - Zelle wird zugeschnitten , um die Phasenprogression durch Mitose zu visualisieren . t = min. Maßstabsbalken = 5 &amp; mgr; m. (D) Aurb m / m Zelle abgeschnitten wird mitotischen Progression durch Mitose zu visualisieren, die in cytokinesis Versagen und Kernbildung resultierende mitotischen Arrest enthält. Die Pfeile zeigen auf die Mikronuklei. t = Zeit in min verstrichen ist. Maßstabsbalken = 5 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/54218fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/54218fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54218/54218fig4.jpg" /> Figur 4.Single Cell Live - Imaging Erfasst Multiple mitotischen Defekte Verbunden mit Chromosome Segregation und der Division in mitotischen Mutant Zebrabärbling. (A) Ein zugeschnittene Bild einer Zelle unterzogen congression Defekte in einem ESCO2 + / m Embryo. Der dünne Pfeil überwacht die linke Chromosom, das wieder in die Metaphaseplatte gezogen wird. Der dicke Pfeil überwacht die richtige Chromosom, das nicht zurück in die Metaphaseplatte gezogen wird und geschlossen ein Mikrokern zu bilden. Der Doppelpfeil zeigt die Trennung des rechten Chromosom, das in der Anaphase Einsetzen nicht Kongress tat. Einschübe zeigen in Ansichten der Chromosomen gezoomt, der Kongress gescheitert. Einfügungen wurden abgeschnitten und Helligkeit für eine bessere Visualisierung verbessert. CAAX Fluoreszenz wurde die Chromosomen leichter zu visualisieren entfernt. Maßstabsbalken = 5 &amp; mgr; m. (B) A zugeschnittene Bild einer Zelle die Mitose unterziehen , die in einem ESCO2 in einer multipolaren Division Ergebnisse </em&gt; + / M embryo. Maßstabsbalken = 5 &amp; mgr; m. (C) Ein beschnittene Bild einer Zelle erfährt Müdigkeit Zusammenhalt was anaphase Brückenbildung durch den fadenförmigen Ziehen zwischen den beiden Kernen festgestellt durch die Klammern gesehen. Maßstabsbalken = 5 &amp; mgr; m. t = Zeit in Minuten vergangen sind . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/54218fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_1.mov">Film 1. Mehrere Zellteilungen können in einem weiten Blick eines injizierten Wildtyp Zebrafischembryo sichtbar</a> gemacht <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_1.mov">werden</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_1.mov">(rechts Download anklicken).</a> <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie2.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_2.mov">Film 2. Phasen der Mitose kann leicht in einem Wildtyp</a> - <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_2.mov">Zebrafischembryo sichtbar</a> gemacht <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_2.mov">werden</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_2.mov">(r</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_2.mov">ight Download anklicken).</a> Kernhülle Abbau wird durch die unregelmäßige Auftreten des Kerns und geht in Richtung congression der Schwesterchromatiden gefolgert eine Metaphaseplatte zu bilden . Genaue Entmischung und liefert zwei neue Tochterzellen. <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie3.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_3.mov">Film 3. Live</a> - <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_3.mov">Bildgebung von</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_3.mov">Aurb m / m Embryo zeigt Chromosom vermissen</a>egregation, scheiterte cytokinesis und Mikronuklei - Bildung (rechts Download anklicken). Kernhülle Abbau wird durch die unregelmäßige Auftreten des Kerns abgeleitet, streuen Chromosomen zu entgegengesetzten Polen momentan keine passende Metaphaseplatte zu bilden, und gehen Sie auf Achse zu drehen , die Teilung erstreckt Zeit der Zelle. Zytokinese tritt nicht in einer 4N Zelle und mehreren Mikrokerne führt. <img alt="Film 4" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie4.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_4.mov">Film 4. Congression Defekte in einer beobachtet</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_4.mov">ESCO2 + / m Embryo (rechts herunterladen anklicken).</a> Kernhülle Abbau wird durch die unregelmäßige Auftreten des Kerns abgeleitet. Nachdem die Metaphaseplatte gebildet wird, ein paar indizelne Chromosomen streuen zu jeder Seite. Ein einzelnes Chromosom nach links wird schließlich wieder in die Metaphase Platte gezogen, während das Chromosom nach rechts bleibt außerhalb der Platte Metaphase und kann zu Beginn der Anaphase Trenn Schwesterchromatiden zu sehen. Die Zelle weist eine verlängerte Teilungszeit aber ultimative teilt mit potentiellen Mikronukleus-Bildung. <img alt="Film 5" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie5.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_5.mov">Film 5.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_5.mov">Multi-polar Division wird in einer ESCO2 + / m Embryo beobachtet (rechts Download anklicken).</a> Kernhülle Abbau wird durch die unregelmäßige Auftreten des Kerns entnommen und dann Chromosomen verschmelzen , um eine Y-Form Indikativkurse zu bildene von 3-Spindelpole. Die Zelle weist eine verlängerte Teilungszeit aber schließlich teilt sich in drei Tochterzellen. <img alt="Film 6" src="/files/ftp_upload/54218/54218movie6.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_6.mov">Film 6.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_6.mov">Vorzeitige Trennung</a> der <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54218/Movie_6.mov">Schwesterchromatiden und anaphase Brückenbildung in einer ESCO2 m / m Embryo beobachtet werden (Rechtsklick zum Download).</a> Kernhülle Abbau wird durch die unregelmäßige Auftreten des Kerns entnommen und dann streuen Chromosomen in der Zelle nicht in der Lage ein zu bilden richtige Metaphaseplatte. Das Chromatin decondenses vor Zytokinese und wie die Zelle teilt, erzeugt eine Anaphase Brücke zwischen den beiden Zellen.

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Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

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11.9K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham. Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Serie: Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...