Der Wellcome Trust finanziell unterstützt (VIP Award JSY und 074128 Research Fellowship an KLB). Medical Research Council Stipendium an RJA Leica_SP2_Stacker, ein Algorithmus verwendet, um TIFFs für den &quot;Wiederaufbau&quot; in eine Reihe zu importieren, ist auf Leica_tiff_sequence, ein Plugin für das Lesen Leica SP2 TIFFs in ImageJ, von Tony Collins entwickelt und verwendet mit seiner Erlaubnis basiert. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg und TurboReg werden Algorithmen verwendet, um für die Bewegung des Gewebes zu korrigieren, auf Th venaz und Kollegen (1998) 9 basiert. Excel_writer.jar wurde von Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html) geschrieben. JNCT0.08JoVE.ijm, die Partikel Algorithmus, basiert auf einem Algorithmus von KL Gehirn schriftlich und detailliert bisher 5 basiert.

Teil 1: Vorbereitung der Ca 2 +-Indikator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) <ol><li> Oregon Green 488 BAPTA-1.00 kommt in 500 ul Fläschchen als eine kleine Menge (50 g) Pulver. Zugabe von 40 ul Pluronic F-127-Lösung, um das Pulver unter leichtem Schütteln für 30 s, dann fügen Sie 460 ul PSS, und leicht schütteln für 30 s. Die endgültige Lösung bietet 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, 4 x 125 ul Aliquots. Vor Lichteinwirkung und bei -20 C. </li></ol> Teil 2: Ca 2 + loading <ol><li> Entfernen Sie die Ca 2 +-Indikator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) aus dem (-20 C) Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auftauen lassen. </li><li> Nehmen Sie 1 ml der PSS in einem Reagenzglas und in Wasserbad. Bubble mit 95% O 2 / 5% CO 2 bei einer Rate von etwa 1 Blase erscheinen pro Sekunde. Die Bubbler muss in das Reagenzglas mit einem Stopfen oder mit Parafilm zB gesichert werden. </li><li> Präparieren Sie die Gewebe aus der Tier-und in einer Sylgard gesäumten Petrischale vorsichtig Bindegewebe. Unabhängig von der glatten Muskulatur Orgel Art, sollte PSS alle 10 Minuten ersetzt werden und Gewebe sollte gut gewaschen werden (zB durch den Austausch des PSS dreimal) folgende Zerlegung. Für die Samenleiter: Betrachten Sie schneiden die Orgel Länge-Möglichkeiten, um ein Blatt Gewebe zu erzeugen. Für die Harnblase: open in Längsrichtung von der Blasenhals (posterior) an die Spitze der Kuppel (anterior). Bereiten Sie vier Streifen, von 6 bis 8 mm lang und 1 bis 2 mm breit, entlang der dorsalen Oberfläche des Detrusor, Schneiden in die Richtung des dominanten Muskelbündel. </li><li> Legen Sie sezierten Gewebes in der &quot;vorgewärmt und sprudelte &#39;PSS. </li><li> Add 125 ul 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, um das Reagenzglas und gib ein wenig zu schütteln, von Hand zu mischen. </li><li> Fortsetzen Blasenbildung und verlassen, mit Folie abgedeckt. Die Zeit ist dauert genügend Gewebe für die Aufnahme der Ca 2 +-Indikator variiert mit der Größe des Gewebes und die Dicke der glatten Muskulatur. Zum Beispiel: 70 min (Maus Detrusor, Ratte anococcygeus) bis 120 Minuten (Ratte Detrusor, Maus Samenleiter). </li></ol> Teil 3: Vorbereiten des &#39;Ca 2 + geladen &quot;Gewebe für die Mikroskopie Sorgfältige Pinning des Gewebes ist notwendig, um spontane Bewegung des Gewebes (eine Eigenschaft der Abbildung von glatten Muskelzellen aus relativ intaktes Gewebe) zu minimieren und die Lage eines geeigneten Standortes für die Bildgebung (wie ein flaches Stück Gewebe kann zu erleichtern notwendig befragten in zwei Dimensionen statt drei). <ol><li> Spülen Sie das Gewebe in sprudelte PSS für mindestens 5 Minuten. </li><li> Berg in Sylgard gesäumten Vorbereitung Teller, Dehnung der Gewebe (leicht) zu einer flachen Schicht bilden. Verwenden Sie keine langen &quot;Pins&quot;, dass das Ziel kratzen kann, verwenden Sie stattdessen kurze Längen von 25-50 Mikrometer Durchmesser Silberdraht als &quot;Stifte&quot; und legen Sie in einem Winkel. </li><li> Position der Vorbereitung Schüssel auf dem Mikroskoptisch, wobei darauf geachtet, um sicherzustellen, dass die PSS nicht von der Sylgard gesäumten Bereich der Schale escape (da dies zu einer großen Fläche in PSS, wenn die Superfusion beginnt abgedeckt Blei). </li><li> Schalten Sie die Pumpe, um die Vorbereitung mit PSS superfuse. Eine Rate von 100 ml pro Stunde wird oft verwendet. </li><li> Schalten Sie das Heizgerät. </li><li> Legen Sie die Zu-und Abfluss Rohre und Temperaturfühler an der Vorbereitung Schale (Befestigung eines jeden auf das Metallband durch den Magneten auf ihrer Basis). Die Höhe der Spitze des Ablassrohr bestimmt die Tiefe des PSS. Achten Sie darauf, dass der Ausfluss ist eigentlich das Entfernen PSS (wie es manchmal zunächst nicht). </li><li> Stellen Sie die Temperatur auf dem Heizgerät auf die gewünschte Temperatur, z. B. 33-35 C erreichen </li><li> Lassen Sie das Gewebe für mindestens 10 Minuten ausgleichen. </li></ol> Teil 4: Auswahl von Ort zu Bild Die Exposition gegenüber Anregungsbeleuchtung wird der Indikator photobleach, so vermeiden Sie die Verwendung für mehr als ein paar Sekunden zu einer Zeit. <ol><li> Mit einem Low-Power-Objektiv (10x oder 20x) zu verwenden Epifluoreszenz, spannend mit einem blauen Licht, um die glatte Muskulatur ansehen und identifizieren eine geeignete Region zu überwachen. Versuchen Sie, eine Website basierend auf Pick: Bewegung (die sollte minimal sein) und die Anzahl der glatten Muskelzellen in das Feld ein. Helle &quot;Strukturen&quot; kann eine hohe Anzahl von &quot;false positives&quot; in das Bild Erkennungsalgorithmus verursacht, so vermeiden mit einer großen Anzahl von (zB) durchsetzt Epithelzellen oder Fibroblasten. </li><li> Wechseln Sie zu einer höheren Macht Ziel (40x). </li><li> Drehen der Bühne oder der optischen Achse, so dass die glatten Muskelzellen (s) liegt horizontal (dh parallel zur schnellen Scan-Achse). </li></ol> Teil 5: Die konfokale Mikroskopie Die Details, wie die konfokale Mikroskop &#39;set up &quot;sind spezifisch für jeden Mikroskop-Typ, aberdie wichtigsten Überlegungen sind: Geschwindigkeit (mindestens 5 Hz ist für die meisten Ca 2 +-Transienten erforderlich); Auflösung und Größe des Feldes (die beide gehandelt werden-off mit Geschwindigkeit). Einige der folgenden Protokoll ist spezifisch für eine Leica SP2 aufrecht konfokalen Mikroskop. Ein typisches Protokoll: 100 Frame-Serie, bei 5 Hz (256 x 256 Pixel, ca. 100 x 100 um.) Erworben oder 13,5 Hz (256 x 64 Pixel, ca. 100 x 25 um.). Der Tastkopf eingestellt bidirektional verschieben (zum Erwerb Geschwindigkeit maximieren) und erwerben bei 1000 Hz pro Zeile. <ol><li> Schließen Sie das Loch mit einem &quot;luftigen disk &#39;. </li><li> Stellen Sie den Laser (488 nm) Leistung zwischen 25 und 35% auf den AOTF, dieser Wert ist ein Trade-off zwischen Helligkeit und Ausbleichen. (Letzteres ist ein besonderes Problem bei langen Aufnahmen.) </li><li> Erwerben sechs Serien pro Standort, und 4-6 Seiten pro &quot;Behandlung&quot;. Es ist üblich, in Zukunft den gleichen sechs Standorten pre-Medikament (das heißt &quot;Kontrolle&quot;) und Post-drug-Monitor, obwohl signifikante Bleichen kann der Experimentator von dieser abweichen. </li><li> Es ist wichtig, mit Ca 2 +-Imaging, die &quot;Zeit Kontrollen&quot; durchgeführt werden. </li></ol> Teil 6: Vorbereitung für die Analyse <ol><li> Downloaden und installieren Sie Image J aus: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Laden Sie die Plattform-spezifische Version, und aktualisieren Sie dann auf die neueste Version durch Herunterladen der neuesten imageJ.jar Datei von http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar und ersetzt die alte Datei. Apple Mac Benutzer: wenn es langsam läuft, sicherzustellen, dass Sie die neueste Version der Java Virtual Machine (JVM) von Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li> Herunterladen Excel_writer.jar von: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html und installieren Sie in den Plugins [Verzeichnis]&gt; jar-Verzeichnis. </li><li> Kopieren Sie die folgenden Dateien in das Plugins-Verzeichnis: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installieren Sie jedes dieser Skripte mit den Plugins [Menü]&gt; Makros&gt; Installieren ... Funktion von ImageJ. </li><li> Wir verwenden eine Leica SP2 konfokalen Mikroskop, die Software (Leica LCS), für die jeder Serie erzeugt als eine einzige sichtbare &#39;movie&#39; innerhalb der Software, sondern spart als einzelne Frames. Zur Rekonstruktion Frames in Serie: (i) Stellen Sie sicher, dass alle die &#39;Frames&#39; zu rekonstruieren sind in einem einzigen Ordner (zB &quot;DataFolder&gt; Tiffs &#39;). (Ii) Wählen Sie Plugins [Menü]&gt; Makros&gt; Leica_SP2_Stacker. Wählen Sie das Root-Verzeichnis (zB &#39;DataFolder&#39;). Wählen Sie den gewünschten Ordner aus der Dropdown-Liste (zB &quot;Tiffs / &#39;). Wählen Sie eine Ausgabe-Verzeichnis oder ein neues generieren (z. B. &quot;DataFolder&gt; Stacks &#39;). Das Skript wird dann rekonstruieren Serie von Einzelbildern. </li></ol> Teil 7: Korrektur für Bewegung Obwohl Bewegung der abgebildeten Seite mit guten Pinning minimiert werden kann und gleichmäßig gedehnt Gewebe, zeigen einige der glatten Muskulatur Organe spontanen Kontraktionen, die nicht durch eine sorgfältige Pinning allein abgeschafft werden können. Hier beschreiben wir die Verwendung eines frei verfügbaren Algorithmus, oder richtet Spielen Frames innerhalb einer Serie. <ol><li> Download &#39;StackReg &quot;(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) und&quot; TurboReg &quot;(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Installieren Sie jedes in das Plugins-Verzeichnis mit den Plugins&gt; Makros&gt; Install ... </li><li> Legen Sie einen Stapel zu verarbeiten (File&gt; Open ...) und dann auf einen Rahmen, der deutlich zeigt, das Feld von Interesse zu bewegen. Weitere Bilder werden auf diese Referenzrahmen ausgerichtet werden. </li><li> Plugins&gt; Stacks&gt; StackReg. Versuchen Sie, jeden der verschiedenen &quot;Transformationen&quot; (dh Translation, Rigid Body, Scaled Rotation, Affine) zu bestimmen, was am wirksamsten ist. (Weitere Details: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Teil 8: Particle Detection Algorithmus Für jede &quot;Standort&quot; abgebildet werden Faktoren variieren, die Auswirkungen auf den Nachweis von Ca 2 +-Transienten. Durch die Messung bestimmter Eigenschaften von jedem Standort (&quot;Partikelparameter&quot; - siehe unten), ist der Prozess der Erkennung erleichtert. So für jeden Standort, &quot;abgezogen Schwelle für&quot; berechnet man, &quot;Schwelle für Ratio&quot; und &quot;Zelle Kantenschwelle&quot;. <ol><li> Plugins [Menü]&gt; Makros&gt; Installieren ... und wählen Sie &quot;JNCT0.08Release.ijm&quot;. </li><li> Plugins [Menü]&gt; Makros&gt; load-Stack (Abkürzung: l). Wählen Sie eine Serie und berechnen Partikelparameter: <ol style="list-style:none;"><li> a. Schwelle für subtrahiert (= Hintergrund) </li></ol></li><li> Wählen Sie einen rechteckigen ROI über das, was Sie glauben, &#39;background&#39; werden. </li><li> Measure (Abkürzung: m). Notieren Sie bedeuten. <ol style="list-style:none;"><li> b. Berechnung Schwelle für Verhältnis </li></ol></li><li> Wählen Sie einen rechteckigenROI um eine optisch ebene Fläche der Zelle (n). </li><li> Measure (Abkürzung: m). Notieren Sie Mittelwert und Standardabweichung. </li><li> Wiederholen Sie noch zwei Mal OR können Sie drei Felder auf einmal zu ziehen, indem Sie &quot;Shift&quot;. </li><li> Berechnen und notieren Schwelle für ratio = (1 + SD / Mittelwert) x 32, im Durchschnitt Werte aus den drei Wiederholungen / sites. <ol style="list-style:none"><li> c. Zell Kantenschwelle </li></ol></li><li> Image&gt; Stacks&gt; Z-Projekt ... Wählen Sie Projektionstyp: &quot;Mittlere Intensität&quot; </li><li> Bild&gt; Anpassen&gt; Schwellenwert. </li><li> Wählen Sie Schwarz und Weiß. </li><li> Definieren &#39;unter&#39; (obere Schieber) zu begrenzen und notieren Sie sich den entsprechenden Wert (auf der rechten Seite des Schiebers). Nur Ereignisse, die in den schwarzen Regionen gezählt werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Reset&quot;. </li><li> Analyse-Stacks (Shortcut: 2) </li><li> Wählen Sie nur eine Serie zu diesem Zeitpunkt, dh die &quot;erste Datei &#39;und&#39; last file &#39;sollten die gleichen sein. </li><li> Geben Sie die Werte der &quot;Schwelle für abgezogen&quot;, &quot;Schwelle für Ratio&quot; und &quot;Zelle Kantenschwelle&quot;. Lassen Sie andere Einstellungen auf die Standardwerte zurückgesetzt. </li><li> Der Algorithmus erzeugt einen Dual-Fenster Fenster, in dem die bearbeiteten Serie auf der linken Seite angezeigt wird und das Original auf der rechten Seite. Sorgfältig durch diese gehen, um die Anzahl von Fehlalarmen und die Gelegenheiten, bei denen Ereignisse mit bloßem Auge sichtbar, nicht erkannt wurden zu beurteilen. Um eine genauere Erkennung von Ca 2 +-Transienten kann es erforderlich sein, um leicht anpassen einige der &quot;Partikelparameter&quot;. Während der Prozess ein wenig &quot;hit and miss&quot; erscheinen mag auf den ersten Versuch, eine bekommt schnell ein Gefühl, was Parameter-Schlüssel. </li><li> Für jede Serie liefert der Algorithmus eine Excel-Datei, die Details Eigenschaften der erkannten Ereignis (wie Amplitude, Fläche und Lage). &#39;False Positives&#39; - entfernt werden, kann von Hand, aus dieser Excel-Datei - mit der Durchsicht der Bilddateien, dass der Algorithmus Ausgänge (z. B. Schritt 8.17) identifiziert. </li></ol>

<ol>
	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere und ihr Leiden zu minimieren, alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den britischen Animals (Scientific Procedures) Act 1986 und der Europäischen Gemeinschaften die Richtlinie 86/09/EEC durchgeführt.

Wahl der fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Oregon Green 488 BAPTA-1.00 wurde als Ca 2 +-Indikator gewählt, weil es (i) ist hell im Vergleich zu anderen Indikatoren (zB Fluo-4 und Calcium Green) 1, (ii) ist empfindlich auf physiologische Veränderungen in Ca 2 +-Konzentration mit einem K d in einer ähnlichen Größenordnung 1 auf die intrazelluläre Ca 2 +-Konzentration [Ca 2 +] i (z. B. der Samenleiter 2), (iii) lädt viele glatte Muskelzellen, so dass glatte Muskelzellen Kopplung überwacht werden. Allerdings ist Oregon Green 488 BAPTA-1.00 eine nicht-ratioable Ca 2 +-Indikator und als solche kann nicht einfach benutzt, um die absolute bestimmen [Ca 2 +] i. Darüber hinaus kann es auch Puffer Ca 2 +, wenn in hohen Konzentrationen und gesättigt mit hoher Amplitude Veränderungen in [Ca 2 +] i. Die Hemmung der spontanen Kontraktilität Die spontane Kontraktilität der glatten Muskulatur Organe können pharmakologisch reduziert werden, wie durch die Blockierung der Bewegung des Ca 2 + durch L-Typ Ca 2 +-Kanäle (z. B. durch: Nifedipin 3; Diltiazem 4). Beachten Sie, dass diese Medikamente wird erheblich reduziert die Amplitude der whole-cell Ca 2 + Blitze / Transienten. Die Kontraktion der Samenleiter resultiert aus einer Kombination von allem purinergen und noradrenerge Neurotransmission. Focal Ca 2 +-Transienten in diesem Gewebe sind jedoch unempfindlich gegenüber noradrenergen-Rezeptor-Blockade (z. B. α 1-Adrenozeptor, durch Prazosin 5) so Bewegung ohne Beeinträchtigung der Schwerpunkt Ca 2 +-Transienten reduziert werden kann. Alternativ können Kontraktion verhindert &quot;Downstream&quot; durch die Hemmung der Myosin Light Chain Kinase zB durch Wortmannin 6 sein. Schlussfolgerungen Überwachung Ca 2 +-Fluoreszenz bei Submicron Auflösung ist eine leistungsfähige Technik, um die post-junctional Auswirkungen der Freisetzung von Neurotransmittern 5,7-Studie und die Freisetzung von Ca 2 + aus dem internen Speicher (z. B. &quot;Funken&quot; 8). Die Analyse der Ca 2 +-Transienten mit der beschriebenen Vorgehensweise ist dabei kostengünstig im Vergleich zu handelsüblichen Bildanalyse-Pakete und ermöglicht maßgeschneiderte Analyse durch individuelle schriftliche Java-Plugins für ImageJ.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

Ca 2 +-Imaging der glatten Muskulatur gibt einen Einblick in die zellulären Mechanismen, die zu keiner Änderung des Membranpotentials, wie die Freisetzung von Ca 2 + aus dem internen Speicher führen kann, und ermöglicht es mehreren Zellen gleichzeitig überwacht werden, um zu beurteilen, z. B. Kopplung in Syncytial Gewebe. Subzellulären Ca 2 +-Transienten sind in der glatten Muskulatur gemeinsamen, aber nur schwer genau zu messen, weil der Probleme, die durch ihre stochastische Ereignis entstanden, über ein oft großes Sehfeld, in ein Organ, das es anfällig für Vertrag. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine Reihe von Imaging-Protokolle und-Analyse-Routinen zu erwerben und dann zu analysieren entwickelt, in einer automatisierten Weise, die Häufigkeit, Ort und Amplitude von solchen Ereignissen. Während dieser Ansatz auch in anderen Kontexten angewendet werden können, beinhaltet unsere eigene Arbeit den Nachweis von lokalen purinergen Ca 2 +-Transienten zur Ortung Sender Release mit Submikron-Auflösung. ATP ist als cotransmitter von vegetativen Nerven, bindet dort an P2X1-Rezeptoren auf den glatten Muskelzellen des Detrusors und Samenleiter freigegeben. Ca 2 + in die glatten Muskelzellen, was zu purinergen neuroeffector Ca 2 +-Transienten (NCTS). Der Schwerpunkt Ca 2 +-Transienten ermöglichen die optische Überwachung der Freisetzung von Neurotransmittern in einer Weise, die viele Vorteile gegenüber der Elektrophysiologie hat. Abgesehen von der stark verbesserten räumlichen Auflösung, hat optische Erfassung der zusätzlichen Vorteil, dass die Aufnahme des Senders Entlassung aus vielen unterscheidbaren Seiten gleichzeitig. Darüber hinaus ist die optische Fokusebene leichter zu pflegen oder zu korrigieren während der langen Aufnahme-Serie ist als die Neupositionierung von einem intrazellulären scharfen Mikroelektroden. Zusammenfassend ist ein Verfahren zur Abbildung von Ca 2 +-Fluoreszenz beschrieben, die Details der Vorbereitung des Gewebes und die Erfassung und Analyse von Daten. Wir skizzieren den Einsatz mehrerer Skripte für die Analyse solcher Ca 2 +-Transienten.

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details Methoden zur hochauflösenden Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Darstellung von glatten Muskelzellen in isolierten Organen, einschließlich: Vorbereitung des Gewebes, Bildaufnahme und Datenanalyse.

Focal Ca 2 + Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

11.2K Aufrufe.  University of Oxford. Details Methoden zur hochauflösenden Ca 2 + Darstellung von glatten Muskelzellen in isolierten Organen, einschließlich: Vorbereitung des Gewebes, Bildaufnahme und Datenanalyse.

Serie: Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Forschung

Biologie

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolation der Lungenarterie glatten Muskelzellen aus neugeborenen Mäusen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Murine Aortic Crush Injury: Eine effiziente<em&gt; In vivo</em&gt; Modell der glatten Muskelzellproliferation und Endothelfunktion

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...