Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health gewährt 2R01 GM53132 und P50 GM071558 unterstützt.

1. Loading-Zellen mit Calcium-Indikatoren <ol><li> Platte Zellen in 35mm Glasboden MatTek Gerichte (oder irgendeine andere Glasboden betrachten Kammern). </li><li> Bei der Verwendung von primären Myozyten Mantel der Kammern 1 Tag vor mit 10μg/ml Laminin. Platte Herzmuskelzellen (isoliert aus erwachsenen Hunden neugeborenen Ratten oder anderen Organismus) in KB-Puffer (K-Umkehr Tyrode Puffer 35 mmol / l HEPES, 140 mmol / l KCl, 8 mmol / l KHCO 3, 2 mmol / L MgCl 2 und 0,4 mmol / l KH 2 PO 4, pH 7,5) und ändern Sie es nach und nach M199-Medium mit 15% fötalem Rinderserum und 1% streptamycin und 0,5% Gentamicin und bei 37 ergänzt ° C in 5% CO 2. </li><li> Inkubieren Zellen mit Calcium-grünen AM (1-5 uM; Molecular Probes) oder beliebige Kalzium Indikator für 30-45 min bei Raumtemperatur. Bedecken Sie die Form mit Alufolie zu vermeiden Bleichen des Farbstoffs. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit Leibovitz15 Medium mit 14mm EGTA (wenn die Durchführung von Experimenten in niedrigen Kalzium) oder eine entsprechende Anzeige Medien. </li><li> Inkubieren für weitere 30-45 Minuten in Leibovitz15 Medium containing14mM EGTA. </li><li> Wenn der Test Auswirkungen von Inhibitoren (z. B. 10 um U73122 PLC-Inhibitor) fügen Sie diese in einem zweiten. </li></ol> 2. Mikroinjektion Zellen <ol><li> Kultur Kardiomyozyten in Glasboden MatTek Gerichte (oder eine andere Betrachtung Kammern) für 24 Stunden. </li><li> Ändern Sie die mittel-bis Phenol-free Leibovitz-15 mit 14 mM EGTA (Kardiomyozyten haben in Calcium-freiem Medium injiziert werden, können auch andere Zellen in Medium mit Kalzium gespritzt werden). </li><li> Bereiten Mikroinjektion Lösung - unsere Studien verwendeten ein Peptid, das Gα q eliminiert - Caveolae Wechselwirkungen. Beachten Sie, dass nur eine kleine Menge des Volumens in die Zelle (~ fL) injiziert wurden, und so angemessen konzentrierten Beständen verwendet werden muss. Wir haben 2 uM dieses Peptids, CAV3-Gerüst, mit DAPI in Calcium-freiem Medium. DAPI ist ein blue Farbstoff, der Flecken den Zellkern und ermöglicht die Identifizierung von Zellen, die mikroinjiziert haben. DAPI nicht mit der Fluoreszenz von vielen Calcium-Indikatoren stören. Die Höhe des DAPI ist variabel und wir in der Regel genug zu verwenden, um den Kern zu visualisieren (0,5 und 2 M) </li><li> Bereiten Sie Control-Lösung mit DAPI - die Farbtracer allein. </li><li> Für microinjections umluftunabhängiges gezogen oder im Handel erhältlichen Nadeln. Üben Sie mit Farbstoff Injektion, um eine ordnungsgemäße Nadel Parameter zu bestimmen. Wir stellen fest, dass verschiedene Zellen können unterschiedliche Nadeldurchmesser und Mikroinjektion Drücke erfordern. </li><li> Verwenden Sie automatisierte Mikroinjektionssystems, zum Beispiel ein InjectMan NI2 mit einem FemtoJet Pumpe aus Eppendorf. Setzen Sie den Einspritzdruck P i bis 90 hPa, und die Kompensation Druck P c bis 45 hPa. Stellen Sie die Einspritzzeit t auf 0,7 s. Nachstellen Parameter der Injektion benötigen. </li><li> Führen microinjections auf einem inversen Mikroskop (zB Zeiss Axiovert 200M) mit großem Arbeitsabstand Phasenkontrast Ziel (z. B. Luft 40x Phase 2 Objektiv) ausgestattet. </li><li> Inject so viele Zellen wie möglich in eine schnelle Art und Weise. Untersuchen Sie injizierten Zellen mit der Phasenkontrast, um lebensfähige Zellen zu markieren. </li></ol> 3. Co-Immunfluoreszenz-Studien <ol><li> Wash Zellen zweimal mit PBS und fixieren mit 3,7% Paraformaldehyd für 30 Minuten. Falls erforderlich, können die Zellen vor der Fixierung stimuliert werden. </li><li> Wash fixierten Zellen dreimal mit PBS und Inkubation mit 0,2% NP40 in PBS für 5 Minuten. </li><li> Block mit PBS 4% Ziegenserum (oder andere geeignete Serum) für 1 Stunde. </li><li> Inkubieren Zellen mit primären Antikörper in entsprechender Verdünnung mit 1% Ziegenserum in PBS für 1 Stunde. </li><li> Wash Zellen dreimal für 10 Minuten mit 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6, durch Zugabe von fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper, wie zB Alexa-Fluor-488-Anti-Kaninchen-oder Alexa-Fluor-647 anti-Maus-sekundären Antikörper verdünnt, gefolgt zu 1: 1000 1% Ziegenserum in PBS (beachten Sie, dass bei Sondierung für zwei verschiedene Proteine ​​der primäre Antikörper in verschiedenen Arten müssen erhöht werden und die sekundären muss gegen entsprechende Spezies). </li><li> Bei 37 ° C für 1 Stunde, dreimal mit TBS. </li><li> Anzeigen Zellen in TBS-Puffer oder ein anderes geeignetes Medium betrachten. </li></ol> 4. Schnelle Kalzium-Imaging <ol><li> Verwenden Sie Laser-Scanning-konfokalen Mikroskops (zum Beispiel FluoView 1000 Olympus). </li><li> Verwenden hoher numerischer Apertur Ziel. </li><li> Stellen Sie den Aufnahme-Parameter. Für Calcium grüne verwenden 488 nm Anregung und langen Pass 515 Sperrfilter. </li><li> Passen Sie die Pixel-Zeit - für schnelle Kalzium-Messungen stellen Sie es auf 2 us / Pixel. </li><li> Stellen Sie den Zoom auf Pixelgröße von 0,05 zu erreichen - 0,3 um. </li><li> Wählen Sie eine Linie aus einer Zelle der Wahl in einer bestimmten Region. </li><li> In der Zeit-Controller-Fenster wählen Sie Zeit Übernahme für mindestens 1500 Scans (die gewünschten Zeitrahmen zu bekommendie Antwort - 1,3 ms / Zeile ergäbe 2 Sekunden). </li><li> Rekord Hintergrund liest vor der Stimulation. </li><li> Stimulieren Sie Zellen mit 5 uM Carbachol und sofort mit der Aufnahme von Daten. Keep Zellen in 1 ml Leibovitz15 Medium, bereiten 10 uM Carbachol in Leibovitz15 und fügen vorsichtig 1 mL in die Schüssel </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Extrahieren Sie die Intensitäten für jedes Pixel aus aufgenommene Bild. Speichern Sie die Intensität Daten als eine Tabelle mit FluoView 1000 Software. </li><li> Import Intensität Daten in Sigmaplot oder ein ähnliches Datenanalyse-Programm und bin die Daten in ~ 9-40 Lagerplätze. Vergleichen Sie Experimente und elektronische Rauschen zu steuern. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Wir abgebildet Zellen auf Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop LSM510 (Zeiss, Jena, Deutschland) mit Multi-Line-Laser-Anregung und einem 40x/1.2 NA Apochromat Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet. In Abb.. 1 (rot) zeigen wir die Distribution der Caveolae in Canine Adult ventrikulären Kardiomyozyten, die behoben wurden und mit einem Antikörper gegen Caveolin-3, die die großen strukturellen Caveolae Protein in diesen Zellen 9 ist gefärbt. Caveolin-3 wurde mit Alexa-647 immunolabelled und aufgeregt mit dem 633-nm-Linie von einem Er: Ne-Laser. Bilder wurden mit LP650 nm-Emission-Filter. Die Verteilung von Caveolin-3 wurde Gα q, die mit Alexa-488 (grün) immunolabeled verglichen wurde. Alexa-488 wurde mit 488 nm Argon-Ionen-Laser-Linie begeistert und das Bild aufgenommen wurde mit BP505-530nm-Emission-Filter. In dieser Kolokalisation Messungen wurden die beiden Fluorophore in einer sequentiellen Weise mit Multi-Track-Übernahme aufgeregt. Diese Vorgehensweise minimiert Kanal cross-talk. Datenanalyse für Kolokalisation wurde mit AIM Software mit Zeiss LSM510-Meta zur Verfügung gestellt. Wie man sehen kann, sind die beiden Proteine ​​kolokalisiert. Um festzustellen, wie die Kopplung zwischen Caveolin-3 und Gα <sub&gt; q beeinflussen Calcium-Signale, von uns durchgeführten Kalzium-Imaging-Studien an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop-System (FluoView, Olympus, Tokyo, Japan) gekoppelt mit einem inversen Mikroskop (IX70, Olympus) mit einem 40x-Objektiv (UPlanApo, Olympus, numerische Apertur 1,3), obwohl diese Messungen auch auf der Zeis-Systemen durchgeführt werden oben beschrieben. Für diese Messungen wurden die Zellen mit Ca 2 + Grün geladen. Wir freuen uns den Farbstoff mit einem 488nm Argon-Ionen-Laser und sammelte Bilder durch eine LP515 Emissionsfilter. Bild Frames wurden bei 500 ms-Abständen entnommen. Intensity-Werte für jedes Pixel extrahiert wurden mit Olympus-Software und ImageJ. Das Line-Scan-Modus wurde für die quantitative Analyse von schnelleren Ca 2 +-Transienten und Ca 2 + Funken verwendet. Die Pixelgröße in der vorliegenden Studie verwendet wurde, 0,1-0,3 um. Das Line-Scan-Rate wurde um mehrere hundert us pro Zeile. In Abb.. 2 zeigen wir eine Linie Scan eines Ca 2 + Green-beladenen Kardiomyozyten, wo die Pixel dgut betrug 2 us, war die Online-Zeit 142 us. Das Bild ist von 1200 Linien zusammen. Jede Zeile des Scans entspricht der Intensität Fluktuation der Ca 2 + Grün, bestehend aus 71 Punkten über ein 142 us Sortiment genommen, und kann als schnelles Auslesen für Calcium Reaktionen verwendet werden. Zum Beispiel in Abb.. 3 zeigen wir die Ca 2 +-Aktivität aus einer einzigen Zeile eines einzelnen Kardiomyozyten, wie Ca 2 + gemessen Grüne Fluoreszenz-Intensität als Funktion der Zeit in Sekunden vor (oben) und nach (unten) der Zusatz von 5 uM Carbachol, die verbessert der Ebene der intrazellulären Ca 2 + durch Gα q-PLCβ Aktivität. Wenn viele Zeilen gemittelt werden, produziert Carbachol Stimulation eine ~ 1,8 fachen Anstieg der Ca 2 + Grün Intensität. Aufgrund von Schwankungen in der experimentellen Bedingungen (Raumtemperatur, Laserleistung, Detektor-Response-, Farbstoff-Distributionen, etc), kann dieser Anstieg nicht in einzelnen gesehen werdenLinien-Scans. Auch wenn die Intensität Werte (y-Achse Werte) ähnlich sind, ist es klar, dass die Carbachol-stimulierte Grundstück auf der Unterseite viel breiter Peaks, entsprechend länger anhaltende Kalziumspiegel, als die engen Schwankungsbreite Gipfel vor der Stimulation gesehen hat. Diese Verbreiterung und relativen Anstieg der Intensität verdeckt kleine, langsamere Schwingungen. Unser Ziel ist es besser, zwischen diesen verschiedenen Typen deutlich von Kalzium Schwankungen zu unterscheiden. Ein weiteres Beispiel für diese schnellen Calcium-Schwankungen ist in Abb. dargestellt. 4. Die obere Grafik zeigt raw line Daten zur stimulierten ventrikulären Kardiomyozyten (rot) und einem Durchschnitt von 3 line Spuren ist in schwarz dargestellt. Um zu bestimmen, soweit diese Kalzium-Schwankungen durch Gα q vermittelt wurden - caveoline3 Interaktionen, mikroinjiziert wir ein Peptid, das Caveolin-3 destabilisiert - Gα q Interaktionen (dh CAV3 Peptid), das mehr beseitigt Ca 2 + und diese Daten werden in blau dargestellt(Wir beachten Sie, dass wir 500 subtrahiert CAV3 Peptid Intensitäten, so dass die beiden Spuren besser erkennen können). Wir importierten die Spalten von Rohdaten aus unserer Excel-Dateien in Sigmaplot (Jandel, Inc.) und führte eine Histogramm-Analyse. In dieser Analyse wird die Anzahl der Ereignisse in eine gleiche Anzahl von Kisten (Bins), um ein Histogramm erzeugen gruppiert. Die Breite bin stellt eine gleiche Zeitspanne. Die Intensitäten sind in den verschiedenen Zeiten eingeführt bindet, so dass die Höhe eines bestimmten bin die Anzahl der Male, dass die Intensität tritt in der jeweiligen Zeitfenster darstellt. Da diese Art der Analyse hängt nur auf das Sammeln von Daten mit der gleichen Abtastrate, können viele Spuren gleichzeitig analysiert werden. Darüber hinaus ist diese Analyse nicht empfindlich auf Unterschiede in der Farbstoff-Ebenen, Laserleistung, etc., sowie die elektronische und Hintergrundgeräusche tritt an Zeitskalen sehr schnell und sind nur in den ersten 1-2 Behälter gesehen. Die entsprechenden histograms der Rohdaten in Abb.. 4 sind auf der unten auf der Seite angezeigt. Das Histogramm für die Kontroll-Zellen werden über eine große Anzahl von Behältern entsprechend einem breiten zeitlichen Verteilung, wie von der roten Linie (Linie ist für die Führung des Auges und kein Modell wird davon ausgegangen,) dargestellt zu verbreiten. Im Gegensatz dazu sind die Behälter für die Reaktion der Zellen, in denen die Gα q-CAV3 Interaktion von Peptid gestört wurde zu einem engen bin Verteilung darauf hindeutet, dass die Anwesenheit von Peptid längere Flüsse beseitigt beschränkt. Mikroinjektion einer Kontrolle Peptid, das nicht stört Gα q-CAV3 erzeugt ein Histogramm ähnlich un-injizierten Zellen 8. In Abb.. 5 haben wir vergleichen die schnelle Intensitätsschwankungen Ca 2 + Grün bei erwachsenen Hunden ventrikuläre Kardiomyozyten (links) und frisch, unstimulierten Ratten neonatalen Kardiomyozyten, dass Caveolae (rechts) fehlt. Hier wurden die entsprechenden Histogramme der Intensitäten über einen 3 Minuten Zeit binned<html> bei 35 bis Ansicht langsamer Kalzium Veranstaltungen. Beachten Sie, dass die neonatale Kardiomyozyten schnelle Schwankungen Anzeige auf einem flachen Basislinie zeigt das Fehlen von langsameren Ca 2 +-Aktivität, während eine stärker strukturierte Basis für die erwachsenen Zellen zu sehen ist. Diese Unterschiede lassen sich am einfachsten in die Histogramme sehen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig1.jpg" /> Abbildung 1. Images of Canine Adult ventrikulären Kardiomyozyten zeigt die Verteilung der Gα q immunolabeled mit Alexa-488, wo Alexa-488 mit 488 nm Argon-Ionen-Laser-Linie und das Bild war aufgeregt wurde unter Anwendung BP505-530nm-Emission-Filter. Die oben rechts ist das gleiche Bild sehen die Lokalisation von Caveolin-3 mit Alexa-647 immunolabeled, mit der 633-nm-Linie von angeregten He: Ne-Laser und erfasst mit LP650 nm-Emission-Filter. Das fusionierte Bild, wo Kolokalisation in orange zu sehen ist, ist auf der Unterseite mit einem erweiterten Bild auf der rechten Seite. <html> &quot;Pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig2.jpg" /> Abbildung 2. Calcium Imaging eines lebenden Hundes erwachsenen ventrikulären Kardiomyozyten mit Ca 2 + Grün geladen. Das Bild wurde auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop-System mit einem 40x-Objektiv mit einem 488 nm Argon-Ionen-Laser und einem LP515 Emissionsfilter genommen. Das Bild von 1200 Zeilen zusammengesetzt ist, wohnen die Pixel betrug 2 us, und die Pixelgröße betrug 0,1 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig3.jpg" /> Abbildung 3. TOP Intensitätsschwankungen eine Linie verfolgen von einem lebenden Canine Adult ventrikulären Kardiomyozyten mit Ca 2 + Grün geladen und abgebildet, wie beschrieben, und BOTTOM derselben Zelle durch die Zugabe von 5 uM Carbachol stimuliert. <html> / 3505fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. TOP Ein Beispiel für line Spuren von einem lebenden Canine Adult ventrikulären Kardiomyozyten mit Ca 2 + geladen Green (rot) über 180 ms, wo der Mittelwert von 3 Spuren als schwarze Linie dargestellt ist, und im Vergleich zu einer Zelle, wurde mikroinjiziert genommen mit einem Peptid, das stört Gα q-Caveolin-3-Vereinigung (rot), wo durchschnittlich drei Spuren ist in schwarz. Wir nehmen zur Kenntnis, dass wir 400 Intensität zählt abgezogen von der unteren Reihe von Daten zur Ansicht. Die unteren Platten sind die entsprechenden Histogramme der klassierten Daten, wie im Text beschrieben, und wo die Zahl bin, ist willkürlich und die bin count (oder einfach count) entspricht dem Gesamtbetrag der Intensität in diesem speziellen bin. Wir stellen fest, dass die Linie roten und blauen Linien in der Kontrollgruppe (links) und Peptid (rechts) Histogramme erstellt, um eine leichtere Identifizierung und Vergleiche der Daten zu ermöglichen und kein Modell angenommen wird. files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Intensitätsschwankungen Ca 2 + Grün bei erwachsenen Hunden ventrikuläre Kardiomyozyten (links) und frisch, unstimulierten Ratten neonatalen Kardiomyozyten, dass Caveolae (rechts) und ihre entsprechenden Histogramme fehlt, sind unten dargestellt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben eine Methode zum Anzeigen und isolieren schnellen Calcium-Signale in lebenden Herzmuskelzellen entwickelt. Während die experimentellen Bedingungen dieser Messungen zuvor auf andere Zellsysteme 10 sowie Kardiomyozyten 11 angewendet wurde, erlaubt die Verwendung von Histogrammen und bin Analyse von Daten aus vielen Ca 2 + Veranstaltungen erworben werden. Schneller Ereignisse können leicht aus langsameren und Modelle angepasst, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes

Kardiomyozyten mehrere Ca 2 + Ströme von unterschiedlicher Dauer, die zusammenarbeiten, um Funktion 1,2 zu optimieren. Änderungen in Ca 2 +-Aktivität in Reaktion auf extrazelluläre Substanzen wird überwiegend durch die Phospholipase Cb-Gα q Weg auf der Plasmamembran, die durch Mittel wie Acetylcholin stimuliert 3,4 lokalisiert ist geregelt. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass Plasmamembran Proteindomänen genannt Caveolae 5,6 Gα q 7 aktiviert einzufangen. Dieser Einschluss hat den Effekt der Stabilisierung des aktivierten Zustand des Gα q und was zu einer verlängerten Ca 2 +-Signale in Kardiomyozyten und anderen Zelltypen 8. Wir deckten dieses überraschende Ergebnis durch die Messung dynamischer Kalzium Antworten auf eine schnelle Skalierung in lebenden Herzmuskelzellen. Kurz gesagt, werden die Zellen mit einem fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator geladen. In unseren Studien haben wir Ca 2 + Green (Invitrogen, Inc.), die eine Zunahme der Fluoreszenzemission Intensität der Bindung von Kalzium-Ionen aufweist. Die Intensität der Fluoreszenz wird dann für ein Line-Scan-Modus eines Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop aufgenommen. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Erfassung des zeitlichen Verlaufs der Fluoreszenz-Intensität in Pixel entlang einer ausgewählten Linie, produziert mehrere hundert Mal Spuren auf die Mikrosekunde Zeitskala. Diese sehr schnell Spuren in Excel und dann in Sigmaplot zur Analyse übertragen werden, und sind die Spuren für die elektronische Rauschen, freien Farbstoff und andere Bedienelemente, verglichen. Um sezieren Ca 2 + Antworten von verschiedenen Flussraten führten wir eine Histogramm-Analyse, dass Pixelintensitäten mit der Zeit klassierte. Binning ermöglicht es uns, Gruppe über 500 Spuren überprüft und visualisieren die erarbeiteten Ergebnisse räumlich und zeitlich in einer einzigen Kurve. So kann die langsame Ca 2 + Wellen, die schwer zu erkennen sind, wenn die Scans überlagert werden durch unterschiedliche Peak Platzierung und Lärm, ohne darin zu sehen,die klassierten Histogramme. Sehr schnelle Flüsse in der Zeitskala der Messung zeigen eine enge Verteilung der Intensitäten in der sehr kurzen Zeitintervallen während mehr Ca 2 + Wellen zeigen klassierten Daten mit einer breiten Verteilung über längere Zeit zu lagern. Diese unterschiedlichen Zeit-Distributionen ermöglichen es uns, das Timing der Ca 2 + Ströme in den Zellen zu zerlegen und deren Auswirkungen auf die verschiedenen zellulären Geschehen bestimmen.

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Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Wir präsentieren eine Methode zur schnellen (Mikrosekunde) Calcium Ereignisse aus langsamer Flüsse in lebenden Zellen mittels Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie zu isolieren. Das Verfahren misst Fluoreszenzintensität Schwankungen des Kalzium-Indikatoren, die von der Aufnahme Line-Scans von mehreren hundert Pixel in einer Zelle. Histogramm-Analyse ermöglicht es uns, die Zeitskalen der verschiedenen Kalzium-Ströme zu isolieren.

Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Aufrufe.  Queensborough Community College. Wir präsentieren eine Methode zur schnellen (Mikrosekunde) Calcium Ereignisse aus langsamer Flüsse in lebenden Zellen mittels Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie zu isolieren. Das Verfahren misst Fluoreszenzintensität Schwankungen des Kalzium-Indikatoren, die von der Aufnahme Line-Scans von mehreren hundert Pixel in einer Zelle. Histogramm-Analyse ermöglicht es uns, die Zeitskalen der verschiedenen Kalzium-Ströme zu isolieren.

Serie: Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Forschung

Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Spannung und Calcium Dual Channel Optical Mapping von Cultured HL-1 Vorhofmuskelzellen Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Die Messung der extrazellulären Ionenflüsse Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektroden-Technik

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

Forward Genetic Screen Mit transgenem CalciumReporter Aequorin, um neuartige Ziele bei der Calciumsignalisierung zu identifizieren

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.