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1. Einrichten osmotischen Stress-Perfusionssystem Fig. 1 ist eine schematische Protokoll von Calcium Funken Bewertung in intakten Skelettmuskelfasern. <ol><li> Richten Sie ein Drei-Achsen (xyz) Mikromanipulator in der Lage, die Positionierung der Steckdose Spitze der Perfusions-System mit mindestens zwei Kanälen. Weg Luer - - Lok Hahn auf und / oder aus der Strömung des Perfusionslösungen wechseln Dies könnte mit Luer-Spritzenzylinder mit drei befestigt werden. Diese Kanäle sollten Perfusion der Lage ist,&gt; 1 ml / min der Lösung durch eine einzige Spitze mit einer Perfusion&gt; 0,2 mm Durchmesser sein. </li><li> Legen Sie zwei Kanäle der Perfusion System, eine mit Isotonische Tyrode-Lösung und die andere mit Hypotone Tyrode-Lösung. </li></ol> 2. Vorbereiten Intakte Einzel Flexor digitorum brevis (FDB) Muskelfasern aus Maus <ol><li> Nehmen Sie den Fuß von einer Maus eufolgenden NIH und IACUC Richtlinien mit einem Paar schwerer Sezieren von Schere schneiden durch die Bein oberhalb des Sprunggelenks thanized. </li><li> Pin den Fuß auf eine Dissektion Kammer mit Minimal Ca 2 + Tyrode-Lösung gefüllt mit der Sohlenfläche nach oben zeigt. </li><li> Sezieren FDB durch Schneiden der Sehne und leichtes Ziehen auf der Sehne des Muskels aus dem umgebenden Gewebe zu trennen. </li><li> Beenden Dissektion durch Schneiden des distalen Sehnen wo es sich in einzelne Ziffern in den tiefen Schichten des Muskels. </li><li> Übertragen Sie die FDB Muskel durch Abheben mit der Pinzette über seine Sehnen, um zusätzliche Schäden an den Muskelfasern zu vermeiden und in einen Schlauch mit einem aufgetauten Aliquot Kollagenaseverdau Lösung vorgewärmt auf 37 ° C </li><li> Das Röhrchen FDB enthält aufrecht auf einem Orbitalschüttler bei 37 ° C für 60-90 min mit einer Drehzahl von 160 Umdrehungen pro Minute. Experimentell für verschiedene Stämme von Tieren untersucht werden Diese Muskelbündel Dissoziation Protokoll muss, Besonders für jene Krankheit / Mutante Fasern anfällig für Membranschäden. </li><li> Übertragen Sie die Faul FDB in das Rohr mit 700 ul Isotonische Tyrode-Lösung und sanft verreiben, um die Fasern durch Ziehen der Muskel mehrmals durch eine Reihe von 200-ml-Mikropipettenspitzen mit allmählich abnehmender Durchmesser über das Schneiden mit einer sauberen Rasierklinge freizugeben, um die Spitzen zu entfernen 200 ml Mikropipette. Um eine Beschädigung der Fasern in besonders schwachen Muskeln von der Krankheit zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Spitze ist gerade groß genug, um das Faserbündel durch ohne zu kleben passieren. Sie das Bündel durch eine Öffnung zu klein, nicht mit Gewalt. </li><li> Platte aus der FDB Fasern durch leichtes Klopfen resuspendiert und FDB Fasern in dem Rohr und dann Herausziehen 70 ml (1/10 der Gesamtfasern) mit einem Ausschnitt 200 ml Mikropipette in die Mitte einer 35 mm Delta TPG Schale mit 1 ml isotonischer Tyrode-Lösung, um die Diffusion über die Schüssel zu reduzieren. </li><li> Bestimmen der Anzahl der intakten, einzelnen Fasern in der dish mit einem Dissektionsmikroskop. Fügen Sie zusätzliche Aliquots der FDB Fasern zu 3-4 Fasern intakt auf den Teller zu bekommen. </li><li> Bewahren Sie zusätzliche isolierte Muskelfasern bei 4 ° C und innerhalb von 6 Stunden. </li></ol> 3. Fluo-04.00 Farbstoffbeladung und Ca 2 +-Imaging (Sparks Measurement) <ol><li> Über 500 ml Isotonische Tyrode-Lösung von plattierten Gericht mit FDB-Fasern in ein Rohr mit 10 ml Fluo-04.00 Lager (1 mM), vermischen und wieder in die Schüssel zu einer endgültigen Fluo-04.00-Konzentration von 10 mM. Alternativ können Pluronsäure verwendet werden, um Farbstoffbeladung Effizienz zu erhöhen. </li><li> Laden für 60 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Fasern durch eine sorgfältige Zeichnung aus 500 ml Fluo-4 AM-haltigen Isotonische Tyrode-Lösung von der Schale mit einem ungeschnittenen 200 ml-Kunststoff-Mikropipettenspitze und ersetzen mit gleichen Volumen frischen Isotonische Tyrode-Lösung. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal wiederholen. </li><li> Um die Funktion der Mitochondrien zu visualisieren, zu übertragen 500 ml Isotonic Tyrode-Lösung von Gericht mit FDB-Fasern in ein Röhrchen mit 5 ml TMRE Lager (1 mM), Mix, und fügen Sie zurück in die Schale für eine endgültige Konzentration von 50 nM. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Waschen Sie die Fasern durch eine sorgfältige Zeichnung aus 500 ml TMRE haltigen Isotonische Tyrode-Lösung von der Schale mit einem ungeschnittenen 200 ml Kunststoff-Mikropipettenspitze und ersetzen mit gleichen Volumen frischen Isotonische Tyrode-Lösung. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal wiederholen. </li><li> Die Schale in dem konfokalen Mikroskop und wählen Sie eine intakte Faser mit klaren Rillen und einer glatten sarkolemmalen Membran für Experimente. </li><li> Positionieren Sie die Spitze des Perfusionssystems 400-500 um weg von der Zielmuskelfaser und aus der Mitte mit Mikromanipulator Kontrollen. </li><li> Beginnen Fluss des Isotonische Tyrode-Lösung, um sicherzustellen, dass die FDB Faser bleibt an seinem Platz. </li><li> Nehmen Sie das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 AM mit einem 40X Ölimmersionsobjektiv und begeistern Fluo-4 AM mit einArgon-Laser (Anregungswellenlänge 488 nm) und Rekordemissionssignale (Wellenlänge 510-580 nm). Die Intensität des Fluoreszenzsignals ist proportional zu der relativen Höhe der intrazellulären Ca 2 +-Konzentration ([Ca 2 +] i). </li><li> Induzieren die Ca 2 +-Transienten durch Änderung der osmotische Druck der extrazellulären Lösung, um auf osmotischen Stress Faser herzustellen. Perfusion zunächst die Fasern mit isotonischer Tyrode-Lösung (290 mOsM) (Basissammlung für 60 sec) und anschließend mit Tyrode-hypotonischen Lösung (170 mOsM) für 100 Sekunden, um das Quellen zu induzieren. Perfundieren die FDB Fasern zurück mit Isotonische Tyrode-Lösung. Im allgemeinen wird nur ein osmotischer Schock auf einen einzigen intakten Faser in einem Delta TPG Schale und den Funkenereignisse letzten 10 min für die Datenerfassung angelegt wird. </li><li> Datensatz räumliche Lokalisierung von Ca 2 + Funken (Fig. 2) unter Verwendung einer Zeitreihe von xy zweidimensionalen Bildern mit Scan-Geschwindigkeit von 166 LPS (Zeile pro Sekunde, und each Linie von 512 Pixeln, was zu 3,08 sec / Rahmen) für jede Bedingung der isotonischen (1 min umfasste), hypotone Stress (100 sec) und Post-hypotone Stress (5 min). Speichersignale für die Offline-Analyse, um die Verteilung und die Häufigkeit von Ca 2 + Funken nach Abschluss des Experiments zu bewerten. </li><li> Suchen Sie eine neue Faser auf einem neuen Teller und folgen den gleichen osmotischen Schock-Protokoll zu induzieren Ca 2 +-Transienten. Verwenden Sie einen konfokalen Zeilen (xt)-Modus (512 Pixel in der Länge, Abtastrate von 2 ms / Zeilen Ca 2 +-Transienten für eine Minute (dh 30.000 Zeilen) mit dem konfokalen Scanlinie direkt unter sarkolemmalen Membran platziert aufzuzeichnen (Abbildung 3 ). Ändern Sie den Zeilen zu unterschiedlichen Fokusebenen zu drei aufeinanderfolgende Serie (bei ​​1-min-Takt) des Linescans für die Analyse der Größe und der Kinetik der einzelnen Ca 2 +-Sparks aufzeichnen. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Sammeln einer großen Anzahl vonxt Zeilen Spuren, die Morphologie und die Kinetik der einzelnen Ca 2 +-Sparks-Parameter zu bewerten, dh die Amplitude (F / F 0; wobei F 0 ist die Ruhe Ca 2 +-Fluoreszenz), Anstiegszeit, Zeit bis zum Gipfel, Dauer (FDHM , Vollzeit bei halber Größe) und räumliche Breite (FWHM, volle Breite bei halber Größe) der aufgezeichneten Funken. Diese Parameter stellen die grundlegenden Eigenschaften des Gating RYR Ca 2 +-Kanäle wie das Ca 2 +-Fluss (Amplitude) und Gating-Kinetik des RyRs (Dauer). </li><li> Analysieren Sie digitale Bilddaten mit einem speziell entwickelten, halbautomatische Algorithmus, der mit Bildbearbeitungssprache IDL (Interactive Data Language) erstellt wurde, wie zuvor beschrieben, 11,16. Weil die einzigartige Kinetik der Ca 2 +-Freisetzung im Fall von Ca 2 +-Sparks in FDB Fasern durch osmotischen Stress induziert, ist es besser, die manuelle und automatisierte Funktionen von Ca 2 + Veranstaltungen kombinieren FunkeIdentifikation und Bearbeitung mit dieser Bild custom-build-Analyseprogramme 11. Dieser Algorithmus ist sehr nützlich, wenn es notwendig ist, in einigen Muskelerkrankung Modelle manuell identifizieren ROI (Region of Interest). Sobald ein ROI definiert ist, könnte der Algorithmus die oben genannten Parameter Funken, die dann auf Excel-Datei exportiert werden könnten, automatisch abzuleiten. Alternativ kann die Öffentlichkeit verfügbaren Bildverarbeitungssoftware, wie zB SparkMaster in ImageJ, verwendet, um die kinetischen Eigenschaften von Ca 2 + Funken und ihre räumliche Verteilung im Skelettmuskel 17 definieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Stutzmann, G. E., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+Ca2++handling+in+excitable+cells+in+health+and+disease.">Endoplasmic reticulum Ca2+ handling in excitable cells in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 63 (3), 700-727 (2011).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks.">Calcium sparks.</a> Physiol. Rev. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li><li>Brochet, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+release+events+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+the+heart.">Elementary calcium release events from the sarcoplasmic reticulum in the heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 499-509 (2012).</li><li>Brochet, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quarky+calcium+release+in+the+heart.">Quarky calcium release in the heart.</a> Circ. Res. 108 (2), 210-218 (2011).</li><li>Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+sparks+in+cardiac+myocytes.">Imaging calcium sparks in cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 689, 205-214 (2011).</li><li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium.">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33 (9), 763-772 (2006).</li><li>Dulhunty, A. F., Casarotto, M. G., Beard, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor:+a+pivotal+Ca2++regulatory+protein+and+potential+therapeutic+drug+target.">The ryanodine receptor: a pivotal Ca2+ regulatory protein and potential therapeutic drug target.</a> Curr. Drug Targets. 12 (5), 709-723 (2011).</li><li>Kirsch, W. G., Uttenweiler, D., Fink, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spark-+and+ember-like+elementary+Ca2++release+events+in+skinned+fibres+of+adult+mammalian+skeletal+muscle.">Spark- and ember-like elementary Ca2+ release events in skinned fibres of adult mammalian skeletal muscle.</a> J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+amplification+of+ROS+and+Ca2++signals+in+stressed+mdx+dystrophic+skeletal+muscle+fibers.">Reciprocal amplification of ROS and Ca2+ signals in stressed mdx dystrophic skeletal muscle fibers.</a> Pflugers. Arch. 458 (5), 915-928 (2009).</li><li>Lovering, R. M., Michaelson, L., Ward, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malformed+mdx+myofibers+have+normal+cytoskeletal+architecture+yet+altered+EC+coupling+and+stress-induced+Ca2++signaling.">Malformed mdx myofibers have normal cytoskeletal architecture yet altered EC coupling and stress-induced Ca2+ signaling.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 297 (3), 571-580 (2009).</li><li>Weisleder, N., Ma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sparks+as+a+plastic+signal+for+skeletal+muscle+health,+aging,+and+dystrophy.">Ca2+ sparks as a plastic signal for skeletal muscle health, aging, and dystrophy.</a> Acta. 27 (7), 791-798 (2006).</li><li>Weisleder, N., Zhou, J., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+calcium+sparks+in+intact+and+permeabilized+skeletal+muscle+fibers.">Detection of calcium sparks in intact and permeabilized skeletal muscle fibers.</a> Methods Mol. Biol. 798, 395-410 (2012).</li><li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SparkMaster:+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ.">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293 (3), 1073-1081 (2007).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+aging+is+associated+with+compromised+Ca2++spark+signaling+and+segregated+intracellular+Ca2++release.">Muscle aging is associated with compromised Ca2+ spark signaling and segregated intracellular Ca2+ release.</a> J. Cell. Biol. 174 (5), 639-645 (2006).</li><li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Ca2++sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle.">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Res. Rev. 7 (3), 177-188 (2008).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uptake+regulates+rapid+calcium+transients+in+skeletal+muscle+during+excitation-contraction+(E-C)+coupling.">Mitochondrial calcium uptake regulates rapid calcium transients in skeletal muscle during excitation-contraction (E-C) coupling.</a> J. Biol. Chem. 286 (37), 32436-32443 (2011).</li><li>Tjondrokoesoemo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+inositol+(1,4,5)-trisphosphate+receptor+activates+ryanodine+receptor+1+to+mediate+calcium+spark+signaling+in+adult+Mammalian+skeletal+muscle.">Type 1 inositol (1,4,5)-trisphosphate receptor activates ryanodine receptor 1 to mediate calcium spark signaling in adult Mammalian skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 288, 2103-2109 (2013).</li><li>Martins, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+contribute+to+Ca2++signals+produced+by+osmotic+stress+in+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Reactive oxygen species contribute to Ca2+ signals produced by osmotic stress in mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 586 (1), 197-210 (2008).</li><li>Apostol, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+calcium+signals+induced+by+hyper-osmotic+stress+in+mammalian+skeletal+muscle+cells.">Local calcium signals induced by hyper-osmotic stress in mammalian skeletal muscle cells.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 30 (3-4), 97-109 (2009).</li><li>Jiang, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acid+adenine+dinucleotide+phosphate+(NAADP)+Activates+Global+and+Heterogeneous+Local+Ca2++Signals+from+NAADP-+and+Ryanodine+Receptor-gated+Ca2++Stores+in+Pulmonary+Arterial+myocytes.">Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) Activates Global and Heterogeneous Local Ca2+ Signals from NAADP- and Ryanodine Receptor-gated Ca2+ Stores in Pulmonary Arterial myocytes.</a> J. Biol. Chem. 288 (15), 10381-10394 (2013).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Methode zur Beurteilung der Ca 2 +-Sparks in intakten Skelettmuskel ist ein nützliches Werkzeug für Muskelphysiologie und Krankheitsforschung. Wir zeigten, dass die Ca 2 +-Funken Reaktion wurde unter verschiedenen Bedingungen verändert wurde, einschließlich Muskeldystrophie 11, Alterungs 18, 19, sowie in der amyotrophen Lateralsklerose 20. Unsere aktuelle Studie ergab auch, funktionelle Kopplung zwischen IP 3-Rezeptor und RyR, die ein...

Intrazellulären freien Ca 2 + ([Ca 2 +] i) ist eine vielseitige und wichtige sekundäre Messenger, der mehrere zelluläre Funktionen in erregbaren Zellen wie Neuronen, Herz-, Skelett-und glatte Muskulatur reguliert (für eine Übersicht siehe Stutzmann und Mattson 1). Geregelte Ca 2 +-Mobilisierung und Übersprechen zwischen Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) und T-Tubuli (TT)-Membranen sind grundlegende Regulatoren der Muskelphysiologie. Ferner können Änderungen in Ca 2 +-Signal gezeigt worden war, um eine zugrundeliegende Mechanismus des kontraktilen Dysfunktion bei verschiedenen Erkrankungen zu sein. Ca 2 +-Sparks lokalisiert sind elementare Ca 2 +-Freisetzung Ereignisse vom Öffnen des Ryanodin-Rezeptor (RyR) Kanal auf dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) Membran 2 stammen. Im Herzmuskel auftreten Funken spontan durch die Öffnung des RyR2-Kanal von einem Ca 2 +-induzierte Ca 2 + release (IKRK)-Mechanismus 05.03. Im Skelettmuskel wird RyR1 ausschließlich durch den Spannungssensor an der Membran TT 6,7 gesteuert. So Ca 2 + Funken werden unterdrückt und in Ruhebedingungen in intakten Skelettmuskelfasern selten erkannt. Bis vor kurzem sarkolemmalen Membran benötigt, um durch verschiedene chemische oder mechanische &quot;Hautbildung&quot; Methoden aufgebrochen werden, um die Unterdrückung des Spannungssensors auf RyR1 entkoppeln und Ca 2 +-Ereignisse erlaubt in Skelettmuskel 8,9 detektiert werden entfachen. Ein Verfahren zuvor beschrieben erforderlich Permeabilisierung der Membran von Muskelfasern von Saponin Reinigungsmittel 10. Im Jahr 2003 entdeckten wir, dass entweder transient hypoosmotischen Stress oder hyperosmotischen Stress könnte peripheren induzieren Ca 2 + Funken neben dem sarkolemmalen Membran in intakten Muskelfasern 11. Dieses Verfahren ist seit modifiziert worden, um die molekularen Mechanismen und Modulation von Ca 2 + zu studieren </sup&gt; Release und Dynamik 16.12. Hier beschreiben wir die Details unserer experimentellen Ansatz für Induktion, Erfassung und Analyse von Ca 2 +-Sparks in intakten Skelettmuskulatur. Wir präsentieren auch unsere maßgeschneiderten Funke-Analyse-Programm, das verwendet werden kann, um die elementaren Eigenschaften der einzelnen Ca 2 +-Sparks in der Skelettmuskulatur, z. B. Funken Frequenz und Amplitude (Δ F/F0, die die Offenwahrscheinlichkeit der RyR Kanäle spiegelt quantifizieren und die Ca 2 +-Last in der SR), die Zeit bis zum Peak (Anstiegszeit) und Dauer (FDHM, Vollzeit bei halb-maximale Amplitude) der Funken, sowie die räumliche Verteilung der Ca 2 +-Funken. Darüber hinaus präsentieren wir Beweise, die auf die verschiedenen pathophysiologischen Zuständen in der Skelettmuskulatur, wie Muskeldystrophie und amyotrophe Lateralsklerose verändert Ca 2 +-Sparks Links. Der Vorteil dieser Technik beinhaltet die Fähigkeit, Ca 2 + in relativ unbeschädigt zu messengealterten Zellen, anstatt Strippen der Muskelfasern ermöglicht Aufnahme von Ca 2 + Funken in physiologischen Bedingungen näher. Darüber hinaus bietet unsere maßgeschneiderten Programm genauere Berechnungen der Eigenschaften des Funkens in Bezug auf die Muskelfasern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:367px;">Dissect out fibers and check muscle integrity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dissection tools -scissors, and fine tip forceps</td>
			<td style="width:111px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW CORNING</td>
			<td style="width:119px;">184 SIL ELAST KIT</td>
			<td style="width:367px;">&#160;Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm glass petri dish&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Pyrex</td>
			<td style="width:119px;">3160</td>
			<td>Fiber dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isotonic Tyrode Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Minimal Ca2+ Tyrode Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypotonic Tyrode Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">collagenase type I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-5138</td>
			<td>Fiber digestion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Fluo-4 AM&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Fluorescent Ca2+ imaging dyes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TMRE</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td>T669</td>
			<td>mitochondrial membrane potential fluorescent dyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delta TPG dishes&#160;</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td style="width:119px;">0420041500C</td>
			<td>35 mm glass bottom dish for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Spark Fit software</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope</td>
			<td style="width:111px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">3 axis micromanipulator</td>
			<td style="width:111px;">Narishige International</td>
			<td style="width:119px;">MHW-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">temperature controllable orbital shaker</td>
			<td style="width:111px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fiber dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers

Aufrechterhalten homöostatischen Ca 2 +-Signal ein Grund physiologischer Prozess in lebenden Zellen. Ca 2 +-Sparks sind die elementaren Einheiten der Ca 2 +-Signalgebung in der quergestreiften Muskelfasern, die als stark lokalisierten Ca 2 +-Freisetzung Veranstaltungen von Ryanodin-Rezeptor vermittelt (RyR) Ca 2 +-Freisetzung Kanäle auf dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR)-Membran erscheinen. Die richtige Einschätzung der Muskel Ca 2 +-Sparks könnten Auskunft über die intrazelluläre Ca 2 + Handhabungseigenschaften von gesunden und kranken quergestreiften Muskeln. Obwohl Ca 2 + Funken Ereignisse werden bei Ruhe Kardiomyozyten zu sehen, sind sie selten in Ruheskelettmuskelfasern beobachtet, somit besteht ein Bedarf an Verfahren zur Erzeugung und Analyse von Funken in Skelettmuskelfasern. Detaillierte hier ist ein experimentelles Protokoll für die Messung Ca 2 +-Sparks in isolierten Beuge digitorm brevis (FDB) Muskelfasern mit fluorescent Ca 2 +-Indikatoren und konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Bei diesem Ansatz, isoliert FDB Fasern, um transiente hypoosmotischen Stress, gefolgt von einer Rückkehr zu isotonischen physiologischen Lösung ausgesetzt sind. Unter diesen Bedingungen wird eine robuste Ca 2 +-Antwort Funken ist angrenzend an die Membran sarkolemmalen bei jungen gesunden FDB Muskelfasern nachgewiesen. Veränderte Ca 2 + Funken Antwort wird in dystrophischen oder im Alter von Skelettmuskelfasern nachgewiesen. Dieser Ansatz wurde kürzlich gezeigt, dass Membran-getrennte Signalisierung mit Übersprechen zwischen Inositol-(1,4,5)-Triphosphat-Rezeptor (IP 3 R) und RyR trägt zur Ca 2 + Funke Aktivierung der Skelettmuskulatur. Zusammenfassend unsere Studien durch osmotischen Stress induzierte Ca 2 + Funken zeigten, dass diese intrazelluläre Antwort spiegelt eine Muskelsignalisierungsmechanismus in der Physiologie und Altern / Krankheitszuständen, einschließlich Mausmodellen der Muskeldystrophie (mdx-Mäusen) oder Amyotrophe Lateralsklerose (ALS Modell).

Frühere Studien zeigten, dass vorübergehende hypoosmotischen Stress induzierte periphere Ca 2 + Funken neben dem sarkolemmalen Membran in intakten Muskelfasern 11. Abbildung 1 zeigt die Bilder der intakten einzelnen Muskelfasern mit glatten sarkolemmalen Membran und charakteristischen Rillen klar. Abbildung 2 zeigt typische Ca 2 + Funken (als xy-Bilder) wurden durch transiente (100 sec) Behandlung mit einer Lösung, die die hypoosmotischen FDB...

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Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Hier wird ein Verfahren beschrieben, um Calcium Funken direkt zu messen, die Elementareinheiten der Ca 2 +-Freisetzung aus Retikulum in intakten Skelettmuskelfasern. Dieses Verfahren nutzt osmotischen Stress-vermittelte Auslösung der Ca 2 +-Freisetzung aus Ryanodinrezeptor in isolierten Muskelfasern. Die Dynamik und die Homöostase Kapazität der intrazellulären Ca 2 +-Signalisierung kann eingesetzt werden, um die Muskelfunktion in Gesundheit und Krankheit zu beurteilen.

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

assessment-of-calcium-sparks-in-intact-skeletal-muscle-fibers

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Aufrufe.  The Ohio State University Wexner Medical Center.  Hier wird ein Verfahren beschrieben, um Calcium Funken direkt zu messen, die Elementareinheiten der Ca 2 +-Freisetzung aus Retikulum in intakten Skelettmuskelfasern. Dieses Verfahren nutzt osmotischen Stress-vermittelte Auslösung der Ca 2 +-Freisetzung aus Ryanodinrezeptor in isolierten Muskelfasern. Die Dynamik und die Homöostase Kapazität der intrazellulären Ca 2 +-Signalisierung kann eingesetzt werden, um die Muskelfunktion in Gesu...

Serie: Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Forschung

Biologie

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

Hochdurchsatz-Kontraktionsmessungen von Hydrogel-eingebetteten intakten Muskelfasern der Maus mit einem optikbasierten System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Skelettmuskelzellen

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, including voltage-gated ion channels. This approach has been used primarily in heterologous expression systems to simultaneously measure membrane currents, the electrical manifestation of the channels&#39; activity, and fluorescence measurements, reporting local domain rearrangements. Functional site-directed fluorometry combines electrophysiology, molecular biology, chemistry, and fluorescence into a single wide-ranging technique that permits the study of real-time structural rearrangements and function through fluorescence and electrophysiology, respectively. Typically, this approach requires an engineered voltage-gated membrane channel that contains a cysteine that can be tested by a thiol-reactive fluorescent dye. Until recently, the thiol-reactive chemistry used for the site-directed fluorescent labeling of proteins was carried out exclusively in Xenopus oocytes and cell lines, restricting the scope of the approach to primary non-excitable cells. This report describes the applicability of functional site-directed fluorometry in adult skeletal muscle cells to study the early steps of excitation-contraction coupling, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction. The present protocol describes the methodologies to design and transfect cysteine-engineered voltage-gated Ca2+ channels (CaV1.1) into muscle fibers of the flexor digitorum brevis of adult mice using in vivo electroporation and the subsequent steps required for functional site-directed fluorometry measurements. This approach can be adapted to study other ion channels and proteins. The use of functional site-directed fluorometry of mammalian muscle is particularly relevant to studying basic mechanisms of excitability.

Autor im Rampenlicht: Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur  

Functional site-directed fluorometry is a method to study protein domain motions in real time. Modification of this technique for its application in native cells now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+ channels in murine isolated skeletal muscle fibers.

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur durch Dezellularisierung

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Autor im Rampenlicht: Dezellularisierungsbasierte Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.