Name: using a laminating technique to perform confocal microscopy of the human sclera
Uploaded: 2016-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera at JoVE.com

German Research Foundation (FOR2240 "(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye" to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 "Joining Forces to Corneal Regeneration" (to CC).

Die Verwendung von menschlichen Geweben müssen von einem Institutional Review Board oder gleichwertig geprüft und genehmigt werden. Die hier beschriebene Arbeit wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt und hatte die Genehmigung für die wissenschaftliche Untersuchung. Diese Arbeit wurde nach der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Die menschlichen scleral Proben wurden vor den Augen der ganzen Welt Spender (maximal post-mortem Zeit 24 h) an der Augenbank der Augenklinik der Universität zu Köln, Deutschland, erhalten. 1. Experimentelle Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung 96% Ethanol und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) in verschiedenen Röhren. Bereiten Sie die primären Antikörper in der empfohlenen Verdünnung von PBS, die 2% Rinderserumalbumin (BSA) und halten alle Lösungen auf dem Eis. Bereiten Sie 100 ul pro Probe. </li><li> Reinigen Sie alle Instrumente und verwenden scharfe Skalpelle. Nachdem er mit dem gleichen Skalpell wiederholte Schneiden, das Skalpell ändern. </li><li> Erhalten Sie 1-2 Colibri Zange, gerade Mikro Dissektionsscheren, ein # 10 Skalpelloder ophthalmische Skalpell Mikro Feder und vier 26 G Nadeln. </li><li> Wickeln Sie Aluminiumfolie um eine Polystyrolplatte oder verwenden Sie eine Korkplatte um das Gewebe zu befestigen. Arbeiten unter einem binokularen Stereomikroskop. Arbeiten steril unter einem laminaren Luftstrom, wenn nötig. </li></ol> 2. Bereiten Sie die Sclera <ol><li> Sie vorsichtig die Lampe halten und ein Perforieren Trepanation auf dem korneoskleralen Teil ausführen, drehen Sie dann den trepan. Drehen Sie den trepan sorgfältig und gleichmäßig auf der Oberfläche eine ebenso runde Schnitt durchzuführen. Verwenden Sie einen 15,5 mm große trepan. Schneiden Sie die restlichen Anlagen mit einer gebogenen Schere. Entfernen Sie die korneoskleralen Trepanation. Dies wird sich in einer nach vorne geöffneten Lampe führen. <ol><li> Legen Sie die Sklera auf einem Tupfer mit dem offenen Teil nach oben. Entfernen Sie die Retina und Uvea, Colibri Zange mit beiden Schichten abziehen (Retina und Uvea) von der Sklera. Sie nicht die pigmentierte Uvea auf der inneren Lederhaut verlassen. Verwenden einer gebogenen Schere die Retina und Uvea von der Papille zu entfernen. Entfernen Sie die remaining Konjunktiven, Augenmuskeln, und Tenon-Kapsel von der oberflächlichen Sklera. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die scleral Probe in der gewünschten Größe von straight-Typ Schere und Colibri Zange. Nehmen Sie etwa 2 cm 2 Größe scleral Proben von verschiedenen Orten aus . Aufgrund der geringen Größe, halten Sie die Lederhaut sanft und die gewünschte Größe als Quadrate schneiden Sie die straight-Typ Schere. Die korneoskleralen Trepanation definiert den vorderen Rand der Sklera-Proben. <ol><li> Vermeiden Sie wiederholte greifen mit der Zange als den Bereich, wo das Gewebe wurde gepackt ist nicht geeignet für die konfokale Mikroskopie analysiert. Bereiten Sie die erforderliche Anzahl von Proben je nach Experiment Typ (zB ventral nach dorsal vs., vergleiche Abbildung 1) und die Menge von Antikörpern verwendet. </li></ol></li><li> Setzen Sie die Proben in 1,5-ml-Röhrchen für die spätere Verwendung. Befestigen Sie die Proben in 1,5 ml 96% Ethanol für 15 Minuten und dann waschen Sie sie dreimal jeweils 5 minin 1,5 ml PBS auf dem Schüttler. Wenn mit gefrorenem Gewebe arbeiten, führen Sie diesen Schritt vor dem Snap Einfrieren. </li><li> Verwenden Sie frische Gewebe. Ist dies jedoch nicht möglich ist, rasten die Sklera in flüssigem Stickstoff einfrieren und halten Sie sie bei -20 ° C für die spätere Verwendung. Wenn mit gefrorenem Gewebe arbeiten, Tauwetter vor dem Gebrauch. Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen und Einfrieren Zyklen. </li><li> Halten jede Probe in PBS, die 1,5 ml 5% BSA bei Raumtemperatur für 2 Std. Dieser Schritt bewirkt eine Quellung der Probe, die für die Laminierung nützlich ist und verhindert auch unspezifische Bindung. </li><li> Nachdem die Proben schwoll haben, bereiten Sie die scleral Quadrate für die Laminierung. Arbeiten unter einem Mikroskop, zB einem binokularen Stereomikroskop. Befestigen Sie die hinteren scleral Proben auf die Polystyrol-Membran in Aluminiumfolie eingewickelt oder die Korkplatte mit den 26 G Nadeln. </li><li> Biegen Sie die Kanten der Nadeln, so dass sie nicht mit dem Gesichtsfeld unter dem Mikroskop stören. </li><li> Laminat, das die gesamte Dicke scleral samples. <ol><li> Zunächst halten die vordere Kante scleral mit Colibri Pinzette. Dann schneiden Sie vorsichtig eine dünne Schicht der oberflächlichen Sklera die # 10 Skalpell, das ophthalmologische Skalpell Mikro Feder oder einem Spatel Klinge. Halten Sie das Skalpell horizontal und schneiden Sie die oberflächliche Schicht so dünn wie möglich von der darunter liegenden Schicht. </li><li> Präparieren einer dünnen scleral Schicht aus dem scleral Platz. Dieses Verfahren ist vergleichbar mit Standard - OP - Techniken , um eine Klappe während der Trabekulektomie vorzubereiten und in 30-80 um dicke Schichten (vergleiche Abbildung 2) zur Folge haben sollte. </li></ol></li><li> Trocknen der Sklera verhindern , indem kleine Mengen an PBS zu dem Gewebe, beispielsweise 50 &amp; mgr; l PBS mit einer Pipette hinzugefügt wird . </li><li> Setzen Sie die geschnittenen Schichten in 100 ul PBS in der 96 - Well - Platte und beschriften sowohl die Ausrichtung (Richtung extern und intern) und die Schicht (oberflächliche und tiefe) , zB mit einer wasserdichten Farbe. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,7-2,9, bis das Gewebe vollständig laminiert. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Führen Immunohistochemistry <ol><li> 100 l der erforderlichen primären Antikörper in der empfohlenen Verdünnung. Hier zB Verwendung CD 31 (monoklonaler Maus anti human) und LYVE1 Antikörper (Kaninchen - anti human), die beide in einer Verdünnung von 1: 100 in PBS (enthaltend 2% BSA) und über Nacht bei 4 ° C inkubieren. Um das Medium ändern, in der 96-Well-Platte, halten Sie die Pipette auf die Wand des Bohrlochs und entfernen Sie die Flüssigkeit. </li><li> Am nächsten Tag, waschen Sie die Proben dreimal jeweils 5 min mit 200 bis 300 &amp; mgr; l PBS auf dem Schüttler. 100 l der entsprechenden Sekundärantikörper; hier verwenden Ziege anti-Maus-Fluorescein (FITC) und Ziege anti-Kaninchen-Cyaninfarbstoffe 3 (Cy3) und die Proben bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden inkubiert. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper 1: 300 in PBS 2% Ziegenserum enthält. </li><li> Spülen Sie die Proben wieder dreimal jeweils 5 min in 200 bis 300 &amp; mgr; l PBS auf dem Schüttler. </li><li> Führen Kernfärbung, zB </em&gt;. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Verdünnung 1: 2000, 100 &amp; mgr; l in jeder Vertiefung und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren), dann waschen Sie erneut 2-mal in 200 bis 300 &amp; mgr; l PBS auf dem Schüttler. </li><li> Übertragen Sie die Proben auf Objektträger, betten sie in 1-2 Tropfen fluoreszierenden Eindeckmediums, fügen Sie ein Deckglas, verschließen Sie diese durch die Kanten Abdeckung mit transparenten Lack, und lagern bei 4 ° C für die spätere Verwendung oder direkt die Folien mit dem konfokalen untersuchen Mikroskop. </li><li> Verwenden, um ein konfokales Mikroskop (oder Äquivalent), um die Proben zu analysieren. Verwenden Sie die gewünschte Vergrößerung, zB 10-40x Vergrößerung. </li><li> Um die Dicke der Proben zu überprüfen, messen mit der konfokalen Mikroskopie mit Z-Stacks. Die Menge der möglichen skleralen Abschnitte hängt von der Lage der Sklera, als die Dicke äquatorial und posterior (Einführung Vergleich) unterscheidet. </li></ol>

<ol>
	<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+(LYVE1)-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera.">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera.">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li><li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection.">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li><li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antilymphangiogenic+therapy+to+promote+transplant+survival+and+to+reduce+cancer+metastasis:+what+can+we+learn+from+the+eye.">Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li><li>Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+privilege+as+the+result+of+local+tissue+barriers+and+immunosuppressive+microenvironments.">Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments.</a> Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).</li><li>Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+anterior+chamber-associated+immune+deviation+requires+an+intact,+functional+spleen.">Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen.</a> J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).</li><li>Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+chamber-associated+immune+deviation,+ocular+immune+privilege,+and+orthotopic+corneal+allografts.">Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts.</a> Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).</li><li>Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+collagen+from+normal+human+sclera.">Characterization of collagen from normal human sclera.</a> Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).</li><li>Lee, R. E., Davison, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+composition+and+turnover+in+ocular+tissues+of+the+rabbit.">Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit.</a> Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).</li><li>Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+content+of+the+scleral+spur,+trabecular+mesh,+and+sclera.">Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).</li><li>Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The sclera. , (2012).</li><li>Kiss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Blutkreislauf+des+Auges.">Der Blutkreislauf des Auges.</a> Ophthalmologica. 106, 225 (1943).</li><li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+Part+I.+Aqueous+veins.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).</li><li>Ashton, N., Smith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+III.+Arterial+relations+of+Schlemm's+canal.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal.</a> Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).</li><li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts+II.+Aqueous+veins.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).</li><li>Hayreh, S. S., Scott, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+iris+angiography.+II.+Disturbances+in+iris+circulation+following+strabismus+operation+on+the+various+recti.">Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti.</a> Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).</li><li>Virdi, P. S., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+segment+ischemia+after+recession+of+various+recti.+An+experimental+study.">Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study.</a> Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).</li><li>Bron, A. J., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment.">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li><li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+(author's+transl).">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li></ol>

The authors declare no financial disclosures. The contents of this article are solely the responsibility of the authors.

die menschliche Sklera Laminieren ist ein Verfahren zur konfokalen Mikroskopie an diesem Gewebe durchgeführt wird. Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren ist die Verwendung von Ethanol anstelle von Formalin für das Gewebe zu befestigen. Nach unserer Erfahrung sind bessere Ergebnisse erhalten, wenn Ethanol anstelle von Formalin für die Fixierung verwendet wird. Blunt Skalpelle verschlimmern das Verfahren und sollte vermieden werden. Ebenso sollte die Austrocknung der Sklera vermieden werden, da es das Verfahren ver...

Die Sklera ist die starre äußere Schicht, die das Auge bedeckt, die aus dichtem Bindegewebe besteht. Es hilft intraokularen Strukturen zu schützen und intraokularen Druck aufrechtzuerhalten. Somit ist die Sklera für klare Sicht unerlässlich. Es ist frei von Lymphgefäßen 1,2 und bildet dadurch eine äußere lymphatischen freie Grenze zwischen ihm und dem lymphatischen freien inneren Auge 3-7. Es bietet auch Bindungsstellen für Extraokularmuskeln, damit anatomische Ähnlichkeiten mit Sehnen zu teilen. Da vor allem die Sklera dichten Bündeln von Typ - I - Kollagen besteht und hat kleinere Anzahlen von Kollagentypen III, IV, V, VI, VIII 8,9 und Elastin 10,11, ist dieses Gewebe nicht leicht für die Immunhistochemie verwendet werden . Anatomisch kann die Sklera in drei Schichten getrennt werden: (1) die oberflächliche vaskularisierten Episklera unterhalb der Bindehaut und Tenon-Kapsel und in Richtung der Seiten und th gefundene Rückseite des Auges die Bahn zugewandt ist; (2) das sklerale Stroma, der Hauptteil der Sklera; und (3) die Lamina fusca, die eine dünne, pigmentierte Schicht direkt über der Uvea befindet. Unsere anatomischen Kenntnisse über die Sklera resultiert im Wesentlichen aus der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts. Damals untersuchten die Forscher die Anatomie des Gefäßsystems hauptsächlich durch die Verwendung Tusch Injektionen 12 und Gefäß Gießen 13-15. Später wurde in angiographischen Studien erforscht 16-19. Seit dieser Zeit wurden ältere Techniken verbessert und neue entwickelt worden, die erlaubt haben, uns vorherigen anatomischen Kenntnisse zu ergänzen. Zum Beispiel hat es nur etwa ein Jahrzehnt her , dass wir eine solche zuverlässige lymphatische Marker als lymphatischen Gefäßendothel spezifischen Hyaluronan - Rezeptor-1 (LYVE1) 20 oder podoplanin 21 hatten. Die konfokale Mikroskopie bietet neue Möglichkeiten für die Untersuchung der anatomischen Merkmale der unterschiedlichen tiHEMEN des Auges. Es ermöglicht mehrere Flecken zum Differenzieren von Zellen oder Marker zur Lokalisierung von Zellen in Bezug auf die Blutgefäße und anderer anatomischer Strukturen verwendet werden. Es gibt einen Überblick, wenn die Probe von einer größeren Größe und ermöglicht es uns durch eine Probe abzutasten, wenn auf der Suche nach einem bestimmten Zelltyp. Mit Z-Stack-Technologie kann die konfokale Mikroskopie für Proben auf 100-200 &amp; mgr; m bis verwendet werden. Die Sklera unterscheidet zwischen 0,3 mm hinter der Muskelinsertionen und 1 mm am hinteren Pol 11 in der Dicke. Aufgrund sowohl seine Dicke und Undurchsichtigkeit ist die Sklera für die konfokale Mikroskopie mit herkömmlichen Methoden nicht geeignet. Um Abhilfe zu schaffen, wurden skleralen Gewebe laminiert für ihre Analyse mit der konfokalen Mikroskopie zu ermöglichen. Diese Technik ist nützlich für ein besseres Verständnis der beiden physiologischen und pathologischen Situationen im menschlichen Sklera gewinnt.

<table><tbody><tr><td>96% ethanol</td><td>Merck Chemicals, Darmstadt, Germany</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>binocular stereo microscope&amp;nbsp;</td><td>Motic, Hongkong, China</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G needles&amp;nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, Belgium</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm trepan</td><td>Geuder, Heidelberg, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>no.10 scalpel&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>ophthalmic scalpel micro feather&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>no. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)</td><td>Dako, USA</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 antibody&amp;nbsp; (polyclonal rabbit anti human)</td><td>Zytomed, Germany</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>goat anti mouse FITC antibody</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Germany</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rabbit Cy3 antibody</td><td>Dianova, Germany</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum normal</td><td>Dako, Glostrup, Denmark</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides&amp;nbsp;</td><td>Engelbrecht, Ederm&amp;uuml;nde, Germany</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Germany</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO fluorescent mounting medium&amp;nbsp;</td><td>DAKO, USA</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 confocal microscopy&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

using a laminating technique to perform confocal microscopy of the human sclera

Die Sklera ist ein dichtes Bindegewebe, bedeckt und schützt das Auge. Es besteht hauptsächlich aus dichten Kollagenbündeln (Typen I, III, IV, V, VI und VII). Aufgrund seiner Eigenfluoreszenz, Undurchsichtigkeit und die Dicke ist es nicht geeignet für die konfokale Mikroskopie gefunden. Ein alternativer Ansatz für die hier vorgestellt, die für die Immunhistochemie in Paraffin eingebettet Formalin fixierten Sklera verwendet, hat technische Herausforderungen, insbesondere, wenn das Gewebe für Antigen Retrieval Vorwärmen. Da die Sklera in beiden Zellen und Gefäße relativ schlecht ist, wurde die Verwendung von größeren Gewebeproben untersucht, um mit Blick auf Zellen zu verhindern und ihre Lokalisierung in Bezug auf Schiffen und anderen anatomischen Stellen zu verstehen. Um die Analyse von grßeren Gewebeproben unter dem konfokalen Mikroskop zu ermöglichen, eine Laminiertechnik wurde durchgeführt, um dünne Schichten von der Sklera erstellen. Im Anschluss an die Analyse der Ergebnisse von CD31 Blutgefäße und Lymphgefäße endothelialen Hyaluronan-Rezeptor 1 (LYVE1) positive Zellen, für die eine Genehmigung für die wissenschaftliche Untersuchung erhalten wurde, werden die Vorteile und Grenzen dieser Methode diskutiert.

In den repräsentativen Experimenten hier durchgeführt wird, gibt es nachweisbare Vorteile aus der Verwendung dieser besonderen Laminiertechnik abgeleitet. Das erste Experiment veranschaulicht die unterschiedlichen Netzwerk des episkleralen Blutgefß Plexus in drei repräsentativen Bilder (Bild 3). Die Gefäße sind positiv für CD31. Das zweite Experiment zeigt, Immunzellen, insbesondere LYVE1 + Zellen des E...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera at JoVE.com

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

Mit Hilfe einer Laminiertechnik konfokale Mikroskopie der menschlichen Sclera to Perform


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Research

JoVE Journal

Medicine

7.5K Aufrufe.  University of Cologne. Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used. 

Serie: Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Biotechnik

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.

Licht-Blatt-Mikroskopie zur dreidimensionalen Visualisierung der menschlichen Immunzellen

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Immunologie und Infektion

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

Zweite harmonische Generation Signale in Kaninchen Sklera als Instrument für die Bewertung des therapeutischen Gewebes Vernetzung (TXL) für Kurzsichtigkeit

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Medizin

<meta charset="utf8"></head><body>Fortschrittliches zweischichtiges 3D-Co-Kultursystem für Epithel- und Fibroblastenzellen

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung von 3D-Cokultur-Systemen mit nanofaserigen PVA-PCL-Membranen

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Neurowissenschaften

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Mit Hilfe einer Laminiertechnik konfokale Mikroskopie der menschlichen Sclera to Perform

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet

Licht-Blatt-Mikroskopie zur dreidimensionalen Visualisierung der menschlichen Immunzellen

Zweite harmonische Generation Signale in Kaninchen Sklera als Instrument für die Bewertung des therapeutischen Gewebes Vernetzung (TXL) für Kurzsichtigkeit

Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie