German Research Foundation (FOR2240 "(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye" to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 "Joining Forces to Corneal Regeneration" (to CC).

השימוש ברקמות אדם צריך להיות נבדקת ואושר על ידי עושה ועדות מוסדיות או שווה הערך. העבודה המתוארת כאן אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית והיה אישור לבדיקה מדעית. עבודה זו בוצעה על פי הצהרת הלסינקי. דגימות scleral אדם התקבלו מעיני תורמים הגלובוס (HR המקסימלי שלאחר המוות זמן 24) על עיניים בנק מחלקת עיניים, אוניברסיטת קלן, גרמניה. 1. הכנה ניסויית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 96% אתנול וזרחתי בופר (PBS) צינורות שונים. הכן את נוגדנים ראשוניים עם הדילול המומלץ של PBS המכיל אלבומין 2% שור (BSA) ולשמור את כל פתרונות על קרח. כן 100 μl לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את כל המכשירים ולהשתמש אזמלים חדים. אחרי חזר חיתוך עם אותה הסכין, לשנות את האזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג 1-2 מלקחיים COLIBRI, מספריים לנתח מיקרו ישר, אזמל # 10או נוצה מיקרו אזמל עיניים, וארבעה 26 מחטים G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטפים בנייר אלומיניום סביב צלחת קלקר או להשתמש צלחת הפקק כדי להדביק את הרקמה. לעבוד מתחת למיקרוסקופ סטריאו משקף. עבודה סטרילית מתחת זרימת אוויר למינרית במידת הצורך. </li></ol> 2. מכינים את בלובן העין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמד בעדינות את הנורה ולבצע ניקור ניקוב מצד corneoscleral, ולאחר מכן סובב את לִקְדוֹחַ. סובב את לִקְדוֹחַ בזהירות ובאופן שווה על פני השטח כדי לבצע חתך עגול באותה מידה. השתמש לִקְדוֹחַ 15.5 מ&quot;מ בגודל. חותך את המצורפים הנותרים עם מספריים מעוקלים. הסר את הניקור corneoscleral. זה יגרום נורה anteriorly נפתחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את בלובן העין על מקלון עם החלק הפתוח כלפי מעלה. הסר את הרשתית עִנבִּיָה, באמצעות מלקחיים COLIBRI למשוך את שתי שכבות (הרשתית עִנבִּיָה) מן בלובן העין. אל תשאירו את עִנבִּיָה פיגמנט על בלובן העין הפנימית. השתמש במספריים מעוגלים כדי להסיר את הרשתית עִנבִּיָה מן הגבשושיות. הסר את remלחמית aining, שרירי extraocular, ו של הקפסולה שֶׁגֶם מן בלובן העין שטחית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדגם scleral בגודל הנדרש באמצעות מספריים ישרים מסוג ואת מלקחי COLIBRI. קח על 2 ס&quot;מ 2 דגימות scleral בגודל ממקומות שונים. בגלל גודלו הקטן, החזק את בלובן העין בעדינות לגזור לגודל המתאים כריבועים באמצעות מספריים ישר-סוג. ניקור corneoscleral מגדיר את השולים הקדמיים של דגימות scleral. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע חזר תופס עם מלקחי כאזור שבו רקמת התפס אינה מתאימה מיקרוסקופיה confocal מנתח. הכן את המספר הנדרש של דגימות בהתאם לסוג הניסוי (למשל קדמי לעומת בדיעבד, להשוות איור 1) ואת כמות הנוגדנים בשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים דגימות 1.5 מ&quot;ל צינורות לשימוש מאוחר יותר. תקן דגימות 1.5 מ&quot;ל 96% אתנול במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים בכל 5 דקותב 1.5 מ&quot;ל PBS על שייקר. אם עובד עם רקמה קפוא, לבצע שלב זה לפני ההקפאה תוך שניות ספורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש רקמה טריה. עם זאת, אם הדבר אינו אפשרי, צמד להקפיא את בלובן העין בחנקן נוזלי ולשמור אותו ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. אם עובד עם רקמה קפוא, להפשיר לפני השימוש. הימנע פשרת מעגלים חוזרים ונשנים של הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מדגם ב PBS המכיל BSA 1.5 מ&quot;ל 5% בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. צעד זה גורם לנפיחות של המדגם כי הוא מועיל עבור למינציה וגם מונע מחייב נוקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגימות תפחו, להכין את ריבועי scleral ללמינציה. לעבוד מתחת למיקרוסקופ, למשל מיקרוסקופ סטריאו משקף. הצמד את דגימות scleral האחוריות הממברנה הקלקר עטוף בנייר אלומיניום או צלחת הפקק באמצעות 26 מחטי G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כופפו את הקצוות של מחטים כך שהם לא להפריע את שדה הראייה מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למינציה samp scleral בעובי מלאles. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, החזק את קצה scleral הקדמי באמצעות מלקחיים COLIBRI. ואז לחתוך בזהירות שכבה דקה של בלובן העין שטחית באמצעות אזמל # 10, הנוצה מיקרו עיניים אזמל, או להב מרית. החזק את האזמל אופקי ולחתוך את השכבה השטחית בצורה רחבה ככל האפשר מן השכבה שמתחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח שכבת scleral דקה מכיכר scleral. שיטה זו ניתן להשוות טכניקות ניתוח סטנדרטיות להכין דש במהלך trabeculectomy וצריך לגרום שכבות עבות 30-80 מיקרומטר (השווה איור 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנוע התייבשות של בלובן העין על ידי הוספת כמויות קטנות של PBS לרקמה, PBS μl למשל 50 בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השכבות לחתוך לתוך 100 μl של PBS ב 96 את הצלחת היטב ולתייג פי הנטייה (לכיוון חצוני ומתמחה) ואת השכבה (שטחי ועמוק) למשל עם צבע עמיד למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.7-2.9 עד רקמת למינציה מלאה. &lt;/ Li&gt; </ol> .3 בצע אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של הנוגדנים העיקריים הנדרשים לתוך הדילול המומלץ. הנה, למשל, השימוש CD 31 (אדם אנטי עכבר חד שבטי) נוגדני LYVE1 (אדם ארנב נגד), הוא דילול של 1: 100 ב PBS (המכיל 2% BSA) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי לשנות את המדיום בצלחת 96 באר, להחזיק פיפטה אל הקיר של הבאר ולהסיר את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את דגימות שלוש פעמים בכל 5 דקות עם 200-300 PBS μl על שייקר. הוספת 100 μl של נוגדנים משני המתאימים; כאן להשתמש isothiocyanate והעמסת העכבר עז נגד (FITC) וצבעים cyanine ארנב עז נגד 3 (Cy3), דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. לדלל את הנוגדנים משני 1: 300 ב PBS המכיל סרום עיזים 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את דגימות שוב שלוש פעמים בכל 5 דקות ב 200-300 μl PBS על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מכתים הגרעין, למשל </em&gt;. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (דילול 1: 2,000, 100 μl היטב כל דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר), ולאחר מכן לשטוף שוב 2 פעמים ב 200-300 PBS μl על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות על גבי שקופיות מיקרוסקופ, להטביע אותם 1-2 טיפות של המדיום גובר פלורסנט, להוסיף coverslip, לאטום אותו על ידי כיסוי קצוות עם לכה שקופה, ולאחסן ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר או ישירות לבחון את השקופיות עם confocal מִיקרוֹסקוֹפּ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ confocal (או שווה ערך) כדי לנתח את הדגימות. השתמש ההגדלה הרצויה, הגדלה למשל 10-40X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת את העובי של הדגימות, למדוד עם מיקרוסקופ confocal באמצעות Z- ערימות. כמות חלקי scleral אפשרי תלויה במיקום של בלובן העין, כמו העובי שונה equatorially ו בדיעבד (השווה מבוא). </li></ol>

<ol>
	<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+(LYVE1)-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera.">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera.">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li><li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection.">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li><li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antilymphangiogenic+therapy+to+promote+transplant+survival+and+to+reduce+cancer+metastasis:+what+can+we+learn+from+the+eye.">Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li><li>Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+privilege+as+the+result+of+local+tissue+barriers+and+immunosuppressive+microenvironments.">Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments.</a> Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).</li><li>Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+anterior+chamber-associated+immune+deviation+requires+an+intact,+functional+spleen.">Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen.</a> J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).</li><li>Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+chamber-associated+immune+deviation,+ocular+immune+privilege,+and+orthotopic+corneal+allografts.">Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts.</a> Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).</li><li>Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+collagen+from+normal+human+sclera.">Characterization of collagen from normal human sclera.</a> Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).</li><li>Lee, R. E., Davison, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+composition+and+turnover+in+ocular+tissues+of+the+rabbit.">Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit.</a> Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).</li><li>Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+content+of+the+scleral+spur,+trabecular+mesh,+and+sclera.">Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).</li><li>Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The sclera. , (2012).</li><li>Kiss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Blutkreislauf+des+Auges.">Der Blutkreislauf des Auges.</a> Ophthalmologica. 106, 225 (1943).</li><li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+Part+I.+Aqueous+veins.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).</li><li>Ashton, N., Smith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+III.+Arterial+relations+of+Schlemm's+canal.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal.</a> Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).</li><li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts+II.+Aqueous+veins.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).</li><li>Hayreh, S. S., Scott, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+iris+angiography.+II.+Disturbances+in+iris+circulation+following+strabismus+operation+on+the+various+recti.">Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti.</a> Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).</li><li>Virdi, P. S., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+segment+ischemia+after+recession+of+various+recti.+An+experimental+study.">Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study.</a> Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).</li><li>Bron, A. J., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment.">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li><li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+(author's+transl).">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li></ol>

The authors declare no financial disclosures. The contents of this article are solely the responsibility of the authors.

למינציה בלובן העין האנושית היא שיטה לביצוע במיקרוסקופ confocal על רקמה זו. שלב קריטי בתהליך זה הוא השימוש באתנול במקום פורמלין עבור הדבקת הרקמה. מניסיוננו, תוצאות טובות יותר מתקבלות כאשר באמצעות אתנול במקום פורמלין עבור קיבעון. אזמלים בלאנט להחמיר את ההליך וכן יש להימנע...

בלובן העין היא השכבה החיצונית הנוקשה המכסה את העין, העשוי רקמת חיבור צפופה. זה עוזר להגן על מבנים תוך-עיני וכדי לשמור על לחץ תוך עיני. לפיכך, בלובן העין חיוני לראייה ברורה. זהו ללא כלי הלימפה 1,2 ובכך מהווה גבול חיצוני הלימפה ללא הבינה לבין העין הפנימית ללא הלימפה 3-7. הוא גם מספק אתרים מצורפים עבור שרירי extraocular וחולק דמיון אנטומי עם גידים. מכיוון בלובן העין מורכבת בעיקר צרורות צפופות של סוג אני קולגן יש מספרים קטנים של סוגי קולגן III, IV, V, VI, VIII 8,9 ואלסטין 10,11, רקמה זו אינה קלה לשימוש עבור אימונוהיסטוכימיה. אנטומית, בלובן העין ניתן לחלק לשלוש שכבות עיקריות: (1) episclera vascularized השטחי, נמצאות מתחת הלחמית הקפסולה של שֶׁגֶם ולקראת הצדדים הבחזרה הדואר של העין מול מסלולו; (2) את stroma scleral, החלק העיקרי של בלובן העין; ו (3) את lamina fusca, המהווה שכבה דקה, פיגמנט ממוקם ישירות מעל עִנבִּיָה. הידע אנטומי שלנו על בלובן העין נובע בעיקר מן המחצית הראשונה של המאה ה -20. באותו זמן, חוקרים בדקו את האנטומיה של כלי דם בעיקר באמצעות זריקות דיו הודו 12 וכלי דם ליהוק 13-15. מאוחר יותר, זה נחקר במחקרים והאנגיוגרפית 16-19. מאז אותה תקופה, שיטות ישנות שופרו חדשים פותח אפשרו לנו להשלים את הידע האנטומי קודם. לדוגמה, זה כבר רק יותר מעשור אחד מאז היו לנו סמנים הלימפה אמין כמו-1 קולטן hyaluronan ספציפי האנדותל של כלי הדם הלימפה (LYVE1) 20 או 21 podoplanin. מיקרוסקופיה Confocal מציעה אפשרויות חדשות ללימוד התכונות אנטומיות של ti השונהssues של העין. היא מאפשרת כתמים מרובים כדי לשמש להבחנת סמנים של תאים או עבור הלוקליזציה של תאים ביחס כלי דם מבנים אנטומיים אחרים. הוא מספק סקירה כאשר המדגם הוא בגודל גדול יותר ומאפשר לנו לסרוק באמצעות מדגם כאשר בחיפוש אחר סוג תא מסוים. בעזרת טכנולוגיה Z-Stack, מיקרוסקופיה confocal יכול לשמש דגימות עד 100-200 מיקרומטר. בלובן העין שונה בעובי בין 0.3 מ&quot;מ מאחורי הוספות שרירים 1 מ&quot;מ בקוטב האחורי 11. בשל הוא עובי השקיפות שלה, בלובן העין אינו מתאים מיקרוסקופיה confocal בשיטות מסורתיות. כדי לתקן את זה, רקמות scleral היו למינציה כדי לאפשר ניתוח שלהם עם מיקרוסקופיה confocal. טכנולוגיה זו שימושית להשגת הבנה טובה יותר של שני מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים ב בלובן העין האנושית.

<table><tbody><tr><td>96% ethanol</td><td>Merck Chemicals, Darmstadt, Germany</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>binocular stereo microscope&amp;nbsp;</td><td>Motic, Hongkong, China</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G needles&amp;nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, Belgium</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm trepan</td><td>Geuder, Heidelberg, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>no.10 scalpel&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>ophthalmic scalpel micro feather&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>no. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)</td><td>Dako, USA</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 antibody&amp;nbsp; (polyclonal rabbit anti human)</td><td>Zytomed, Germany</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>goat anti mouse FITC antibody</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Germany</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rabbit Cy3 antibody</td><td>Dianova, Germany</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum normal</td><td>Dako, Glostrup, Denmark</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides&amp;nbsp;</td><td>Engelbrecht, Ederm&amp;uuml;nde, Germany</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Germany</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO fluorescent mounting medium&amp;nbsp;</td><td>DAKO, USA</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 confocal microscopy&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

using a laminating technique to perform confocal microscopy of the human sclera

בלובן העין היא רקמת חיבור צפופה שמכסה ומגן על העין. זה מורכב בעיקר חבילות קולגן צפופות (סוגים אני, III, IV, V, VI, ו- VII). בשל autofluorescence, העמימות, והעובי שלה, זה לא נמצא מתאים מיקרוסקופיה confocal. גישה חלופית לזו שהוצגה כאן, אשר משתמשת בלובן העין קבוע בפורמלין מוטבע פרפין עבור אימונוהיסטוכימיה, יש אתגרים טכניים, במיוחד כאשר החימום המוקדם הרקמה לאחזור אנטיגן. מאז בלובן העין הוא דל יחסית בשני התאים וכלי, שימוש דגימות רקמה גדולות שנחקר כדי לסייע במניעת תאים המשקיפה ולהבין הלוקליזציה שלהם ביחס כלי ואתרי אנטומיים אחרים. כדי לאפשר הניתוח של דגימות רקמה גדולות תחת מיקרוסקופ confocal, טכניקת למינציה בוצעה ליצור שכבות דקיקות מן בלובן העין. בעקבות ניתוח התוצאות של כלי הדם CD31 ו hyalu אנדותל כלי הלימפהרונאן קולטן 1 (LYVE1) תאים חיוביים, לגביה אישור לבדיקה מדעית הושג, את היתרונות והמגבלות של שיטה זו הם דנו.

בניסויי הנציג בצעו כאן, ישנם יתרונות להדגמה נגזרים השימוש בטכניקת למינציה המסוימת הזה. הניסוי הראשון ממחיש את הרשת המגוונת של מקלעת כלי דם episcleral בשלוש תמונות נציג (איור 3). הכלי הן חיובי עבור CD31. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:righ...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera at JoVE.com

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

באמצעות טכניקה למינציה לבצע Confocal מיקרוסקופית של האדם בלובן העין


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Research

JoVE Journal

Medicine

7.5K Views.  University of Cologne. Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used. 

Video: Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. Conventional methods assess neurological deficits and electrophysiology and quantitative sensory testing quantifies functional alterations to detect neuropathy. However, the earliest damage appears to be to the small fibres and yet these tests primarily assess large fibre dysfunction and have a limited ability to demonstrate regeneration and repair. The only techniques which allow a direct examination of unmyelinated nerve fibre damage and repair are sural nerve biopsy with electron microscopy and skin-punch biopsy. However, both are invasive procedures and require lengthy laboratory procedures and considerable expertise. Corneal Confocal microscopy is a non-invasive clinical technique which provides in-vivo imaging of corneal nerve fibres. We have demonstrated early nerve damage, which precedes loss of intraepidermal nerve fibres in skin biopsies together with stratification of neuropathic severity and repair following pancreas transplantation in diabetic patients. We have also demonstrated nerve damage in idiopathic small fibre neuropathy and Fabry's disease.

Corneal Confocal microscopy is a non-invasive clinical technique which may be used to quantify C fibre damage to diagnose and stratify patients with increasing neuropathic severity.

מיקרוסקופיה confocal קרנית: שיטה חדשנית לא פולשני לכמת סיב פתולוגיה קטנים neuropathies היקפיים

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Developmental Biology

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.

מיקרוסקופ אור גיליונות עבור ויזואליזציה תלת מימדי של תאים חיסוניים אנושי

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Immunology and Infection

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Bioengineering

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

השני דור הרמונית אותות ב הארנב בסקלרה ככלי להערכה של רקמות טיפולית cross-linking של קוצר ראייה (TXL)

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Neuroscience

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Biology

הכנה והדמיה של עדשת עין מורין תושבות שלמות

Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization

The ocular lens is a transparent flexible tissue that alters its shape to focus light from different distances onto the retina. Aside from a basement membrane surrounding the organ, called the capsule, the lens is entirely cellular consisting of a monolayer of epithelial cells on the anterior hemisphere and a bulk mass of lens fiber cells. Throughout life, epithelial cells proliferate in the germinative zone at the lens equator, and equatorial epithelial cells migrate, elongate, and differentiate into newly formed fiber cells. Equatorial epithelial cells substantially alter morphology from randomly packed cobble-stone-shaped cells into aligned hexagon-shaped cells forming meridional rows. Newly formed lens fiber cells retain the hexagonal cell shape and elongate toward the anterior and posterior poles, forming a new shell of cells that are overlaid onto previous generations of fibers. Little is known about the mechanisms that drive the remarkable morphogenesis of lens epithelial cells to fiber cells. To better understand lens structure, development, and function, new imaging protocols have been developed to image peripheral structures using whole mounts of ocular lenses. Here, methods to quantify capsule thickness, epithelial cell area, cell nuclear area and shape, meridional row cell order and packing, and fiber cell widths are shown. These measurements are essential for elucidating the cellular changes that occur during lifelong lens growth and understanding the changes that occur with age or pathology.

מחבר זרקור: בדיקה מורפומטרית מעמיקה וכימות מבנה העדשה המקורי באמצעות הדמיה של תושבת שלמה 

The present protocols describe novel whole mount imaging for the visualization of peripheral structures in the ocular lens with methods for image quantification. These protocols can be used in studies to better understand the relationship between lens microscale structures and lens development/function.

הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון

The ocular lens is a transparent flexible tissue that alters its shape to focus light from different distances onto the retina. Aside from a basement ...

באמצעות טכניקה למינציה לבצע Confocal מיקרוסקופית של האדם בלובן העין

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מיקרוסקופיה confocal קרנית: שיטה חדשנית לא פולשני לכמת סיב פתולוגיה קטנים neuropathies היקפיים

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

מיקרוסקופ אור גיליונות עבור ויזואליזציה תלת מימדי של תאים חיסוניים אנושי

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

השני דור הרמונית אותות ב הארנב בסקלרה ככלי להערכה של רקמות טיפולית cross-linking של קוצר ראייה (TXL)

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון

הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון