This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).

1. Herstellung von Ziel-RNA und Cas9 Konstrukten und Reparatur Donor Vektor <ol><li> Klonierung von gRNAs <ol><li> Entwerfen Sie eine Führungs-RNA - Zielsequenz Targeting des N1L Gen von Vaccinia - Virus nach dem Prinzip zuvor erklärt , 25. Richten Sie die Führung-RNA-Zielsequenz gegen das Genom des Vaccinia-Virus (in diesem Fall Lister-Stamm von Vaccinia-Virus), um auszuschließen, keine Off-Target gRNA Zielsequenzen. </li><li> Synthetisieren und klonen gRNA Oligos in einen gRNA Klonierungsvektor wie zuvor 25 beschrieben. Bestätigen Sie die Reihenfolge der einzelnen gRNA in dem resultierenden Vektor durch Sanger - Sequenzierung 33. Nennen Sie das resultierende gRNA konstruieren als gRNA N2 33. HINWEIS: Die Seite gRNA Ziel innerhalb des N1L - Gens und ist in dem Bereich zwischen dem linken Arm und rechten Arm , dass die Reparatur Donorvektor Abdeckungen (siehe Abbildung 1). </li></ol></li><li> Klonen Sie das Cas9 Gen, das das Kernlokalisationssignal (NLS) in die fehlendepST1374 Vektor und bezeichnen das Konstrukt als pST-Cas9 33. Hinweis: Jeder Säugetier-Expressions Klonierungsvektor kann für den Bau des Cas9 Expressionsvektor verwendet werden. </li><li> Der Bau der Reparatur Spender Vektor für HR <ol><li> Verwenden Sie das N1L Gen von VV als Zielregion für die Modifikation 33. Stellen Sie sicher, dass die Längen der linken und rechten Arme sind etwa 500-600 bp jeder, und flankierende den Zielbereich. HINWEIS: Der linke Arm / rechten Arm kann mit dem Zielbereich bis zu 50 bp überlappen (siehe Abbildung 1). </li><li> Klonen Sie die N1L Region Reparatur Spender Vektor als 33 zuvor beschrieben, 34 und die Reparatur Donorvektor als pT-N1L bezeichnen. HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für die Reparatur Spendervektor und dessen Zielregion. Andere Regionen der VV kann unter Verwendung Region (Gen) -spezifische gRNA (n) und regionsspezifische Reparatur Spender Vektor abgezielt. Jede Klonierungsvektor kann für die Konstruktion des Reparatur Donorvektor verwendet werden. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Expansion von Plasmid <ol><li> Verwandeln Sie das Plasmid in chemisch kompetente E. coli nach den Anweisungen des Herstellers. Man reinige das Plasmid ein Plasmid-Extraktions-Kits mit Bezug auf das Protokoll vom Hersteller geliefert werden. </li></ol></li></ol> 2. Seeding Zellen (Tag 1) <ol><li> Pflegen CV-1-Zellen (Affennierenfibroblasten) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Trypsinize CV-1-Zellen, die 80-90% konfluent sind <ol><li> Entfernen des Zellkulturmediums aus den T-175-Kolben, der CV-1-Zellen. Spülen Sie die Monoschicht mit 5 ml steriler PBS Rest Serum zu entfernen und den PBS anzusaugen. In 2,5 ml 1 × Trypsin-EDTA-Lösung, die Zellen und der Kolben wird in 37 ° C Inkubator für etwa 5 min zu decken Zellablösung zu unterstützen. </li><li> Hinzufügen10 ml Zellkulturmedium (siehe Schritt 2.1), um die Zellen durch vorsichtiges Pipettenwirkung auszusetzen. Zählen Sie die Zellzahlen unter Verwendung einer Zählkammer. </li><li> Aussäen Zellen in 6-Well-Platten <ol><li> Seed 2 × 10 5 CV-1 - Zellen in 2 ml Zellkulturmedium in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen am Tag vor der Transfektion. HINWEIS: Eine zusätzliche Zentrifugationsschritt Trypsin zu entfernen, ist nicht erforderlich. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Transfektion von Plasmid Cas9 und gRNA Plasmid (Tag 2) <ol><li> Transfizieren CV-1-Zellen (hergestellt in Schritt 2.2.3.1) mit 0,5 ug pST-Plasmid Cas9 und 0,5 ug gRNA N2 Plasmid, das ein Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 24 h in einem Inkubator (37 ° C mit 5% CO 2), und ersetzen Sie dann das Medium mit 2 ml frischem Zellkulturmedium (beschrieben in Schritt 2.1). </li></ol> 4. Die Infektion von CV-1-Zellen und Shuttle Donor Vector Transfection für HR (Tag 3) <ol><li> Verdünne das Rückgrat VVL15 Virus mit DMEM Zellkulturmedium bis zu einer Konzentration von 2 × 10 5 pfu / ml. 24 h nach der Transfektion von Cas9 und gRNA Plasmide, 100 &amp; mgr; l des verdünnten Virus in jede Vertiefung der transfizierten CV-1-Zellen. </li><li> 2 h nach der Virusinfektion, transfizieren 1,0 ug Shuttle Donorvektor in VVL15-infizierten Zellen für die HR eine Transfektionsreagenz Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Platzieren Sie die transfizierten Zellen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 für 24 h. </li></ol> 5. Ernte der rekombinante Virus (Tag 4) <ol><li> Nach 24 Stunden der Transfektion mit dem Shuttle-Donator Vektor für HR in Schritt 4.2, lösen die transfizierten CV-1-Zellen einen Zellschaber verwenden. Sammeln Sie die Zellsuspension in ein Kryoröhrchen und bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung. HINWEIS: Wischen Sie Zellkulturmedium ausgelaufene Flüssigkeit mit Desinfektionsmittel sofort und wischen Sie dann wieder mit 70% ethanol. </li></ol> 6. Reinigung des modifizierten VV (erste Runde) <ol><li> Am Tag 1 Saatgut 15 6-well - Platten mit 3 × 10 5 CV-1 - Zellen in jeder Vertiefung. <ol><li> Am Tag 2 auftauen die gefrorene Zellsuspension aus Schritt 5.1 in einem Wasserbad bei 37 ° C für 3 min, und die Kryoröhrchen kräftig für 30 s vortexen Zelllysat zu erhalten, ohne die Zelltrümmer zu entfernen. </li></ol></li><li> Für die Infektion von einer 6-Well-Platte von CV-1-Zellen, verdünnt 1 &amp; mgr; l Zelllysat mit 3 ml DMEM und 0,5 ml der verdünnten Zelllysat in jede Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen hinzuzufügen, oben auf Medien bereits Geschenk. Infect alle Platten mit 6 Vertiefungen, hergestellt in Schritt 6.1. HINWEIS: Die Entfernung von Zelldebris ist nicht erforderlich. </li><li> Nach zwei Tagen der Infektion (dh am Tag 4), RFP-positiven Plaques unter einem Fluoreszenzmikroskop durch kreisen um die Plaque Lage mit 10fach Objektivlinse und beschriften Sie die Plaques unter der Platte mit einem Markierungsstift identifizieren. ANMERKUNG: <strong&gt; Abbildung 3 für repräsentative RFP-positive Plaque. <ol><li> Bereiten Sie sechs markierte Kryovials, die 200 &amp; mgr; l Serum-freies DMEM Zellkulturmedium sechs verschiedenen RFP-positiven Plaques zu holen. Absaugen Zellkulturmedium aus dem gut mit markiertem plaque (s) (Schritt 6.3). Bringen Sie eine 200 ul Spitze auf eine P200 Pipette, die Lautstärke bei 30 &amp; mgr; l und nehmen ~ 10 &amp; mgr; l Zellkulturmedium von einem Cryovial. </li><li> Halten Sie die Pipette Druckknopf, ohne das Medium lösen und die Spitze verwenden, um die Fläche eines markierten Plaque zu kratzen. Lassen Sie die Pipette Drucktaster um die abgelösten Zellen zu heben und übertragen sie in die Cryovial enthält 190 &amp; mgr; l Serum-freiem DMEM. </li><li> Nehmen wir ein anderes 10 &amp; mgr; l Medium aus dem Fläschchen mit den zerkratzten Zellen (von den letzten Schritt) und wiederholen Sie den Vorgang des Aufnehmens die gleiche RFP-positive Plaque dreimal bis zu so viele zerkratzt Zellen wie möglich zu sammeln. Übertragen Sie alle Zellen in die gleiche Fläschchen und lagern Sie das Fläschchen bei -80 ° C. </ol></li></ol> 7. Die Reinigung der modifizierten VV (zweite Runde) <ol><li> Seed 3 × 10 5 CV-1 - Zellen in jede Vertiefung von sechs 6-Well - Platten und Kultur die Zellen für 24 h. </li><li> Tauen die gefrorenen Kryovials (aus Schritt 6.3.3) in 37 ° C warmen Wasserbad für 3 min, Strudel dann die Kryovials kräftig für 30 Sekunden Zelllysat zu erhalten. <ol><li> Mit 0,5 &amp; mgr; l des gemischten Zelllysat in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Infect für jede Plakette eine 6-Well-Platte. Inkubieren Sie die VV-infizierten 6-Well - Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 2 Tage (Zweite Runde Plaque - Reinigung). Dann wiederholen Sie Abschnitt 6.3. HINWEIS: Mehr als sechs RFP-positive Plaques ausgewählt werden können auf; zwei oder mehr Platten mit 6 Vertiefungen kann zur Reinigung jedes Plaque verwendet werden. </li></ol></li></ol> 8. Weitere Runden von Plaque Purifizierung <ol><li> Fahren Sie weitere drei bis fünf Runden der Reinigung nach dem gleichen Protokoll in Schritt 7 beschrieben, bis alle gebildeten Plaques aus einer positiven Plaque erscheinen RFP-positiv unter dem Mikroskop zu sein. HINWEIS: Diese Plakette dann rein betrachtet. </li><li> Sobald die Plaque rein ist (Abbildung 4, alle infizierten Zellen RFP exprimieren), ernten eine positive Plaque in einen Cryovial und bei -80 ° C , wie in Kapitel 6.3 beschrieben. Überprüfen Sie die Plakette nach dem Protokoll in Schritt 9 und 10 beschrieben. </li></ol> 9. Erweitern Sie die gereinigten Plaque (n) <ol><li> Seed 3 × 10 5 CV-1 - Zellen in jede Vertiefung einer 6-Well - Platte einen Tag vor der Virusinfektion. </li><li> Auftauen des gefrorenen Kryoröhrchen von 8,2 in einem 37 ° C Wasserbad für 3 min Zelllysat zu erhalten. Fügen Sie alle das Lysat (ohne Zelltrümmer zu entfernen) in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte von CV-1-Zellen (ausgesät in Schritt 9.1). Inkubieren der infizierten CV-1-Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für bis zu 3 Tagen. <ol><li> Erweitern Sie alle gereinigten Plaques (mindestens drei Plaques). HINWEIS: Die Infektionszeit variiert von 1-3 Tagen in Abhängigkeit von der Menge des Virus in dem Lysat. </li></ol></li><li> Ernten Sie die VV-infizierten Zellen einen Zellschaber verwenden, wenn mehr als 50% Zellen cytopathische Wirkung zeigen, unter einem Mikroskop beobachtet (Zellen sind abgerundet, leicht abgenommen und RFP positiv). Sammle die abgelösten Zellen zusammen mit dem Zellkulturmedium in einem 15 ml-Röhrchen. <ol><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand und halten das Zellpellet bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung oder verwenden Sie das Zellpellet sofort für Schritt 10. </li></ol></li></ol> 10. Prüfung der Änderung der Mutant VV PCR <ol><li> Extrahieren VV DNA aus dem Zellpellet, hergestellt in Schritt 9.3.1 einen DNA Extraction Kit nach Herstellerprotokoll. Eluieren der DNA mit 200 &amp; mgr; l doppelt destilliertem Wasser. HINWEIS: Verwenden Sie die Hälfte des Volumens des Pellets DNA zu extrahieren und den Rest für die virale Produktion zu halten, wenn der Klon als enthält, um die korrekte Modifikation / Einfügen überprüft wird. </li><li> Verifikation der Löschens des N1L Gens und die Insertion von RFP-Gens in das N1L Region. <ol><li> Amplify ein DNA-Fragment, das das Gen N1L (L025) und die L026-Gen entworfen Primer gegen die N1L Gen verwendet wird. Amplify das RFP-Gen mit RFP -spezifische Primer. Amplify ein Kontroll-DNA-Fragment, das A52R durch PCR-A52R-spezifische Primer verwendet wird. HINWEIS: Siehe Liste der Materialien für spezifische Primer. <ol><li> Führen Sie die PCR ein PCR-Master-Mix-Kit. Einrichten 25 &amp; mgr; l PCR-Reaktion unter Verwendung von 2 &amp; mgr; l DNA-Templat, denaturieren die PCR-Reaktion bei 94 ° C für 2 min, dann 30 Zyklen von PCR folgenden diese Schritte auszuführen: Denaturieren der DNA bei 94 ° C für 15 s, dann Tempern die Primer an die DNA-Matrizen bei 52 ° C für 15 s Verlängerung der PCR-Reaktion bei 72 ° C für 30 s. </li></ol></li></ol></li><li> Lösen Sie die PCR - Produkte einer 1% igen Agarosegel unter Verwendung 33. Nehmen Sie das Gel Bild unter Verwendung eines UV-Gel doc. Wenn der N1L PCR negativ und A52R und RFP PCRs positiv sind, dann wird die Plaque korrekt im N1L Region modifiziert. </li></ol>

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<li>Merchlinsky, M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+foreign+DNA+into+the+vaccinia+virus+genome+by+in+vitro+ligation%3A+recombination-independent+selectable+cloning+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors.</a> Virology. 190, 522-526 (1992).</li>
<li>Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+recombinant+vaccinia+viruses+using+PUV-inactivated+virus+as+a+helper%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper.</a> Biotechniques. 31, 534-540 (2001).</li>
<li>Johnson, R. D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand-break-induced+homologous+recombination+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells.</a> Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).</li>
</ol>

Authors have no competing financial interests.

Es gibt zwei Hauptziele in Bezug auf Änderung von VV zu therapeutischen Zwecken. Eines ist ein bestimmtes Gen, wie beispielsweise die Thymidinkinase (TK) Gen zu deletieren Virus für Anti-Tumor-therapeutische Verwendung zu dämpfen. Die andere ist, VV mit einem gewünschten therapeutischen Gens (wie etwa GM-CSF) oder ein Markergen (wie Luciferase-Gen) zu bewaffnen. eine dieser Verwirklichung beinhaltet das Löschen eines Zielbereichs / Gen. Eine direkte DNA Ligierungstechnik 35 und ein In - vitro - Verpackungsverfahren 36 verwendet wurden zuvor mutierten Vaccinia - Viren mit TK Genveränderungen zu erzeugen. Jedoch haben diese Verfahren beschränkt Anwendung Mutation von anderen Regionen im Genom hinsichtlich aufgrund eines Mangels an einzigartigen Restriktionsenzymstellen über das Genom. Der derzeitige Ansatz Mutante VV zur Schaffung beinhaltet Transfektion eines Shuttle (Donor) Vektor mit einem Selektionsmarker (RFP oder GFP) in CV-1-Zellen zwei Stunden nach der Infektion mit VV eine homologe Rekombination diedrei zu induzierenng der Selektionsmarker in den Zielbereich. Die Auswahl der Marker-positiven Plaques wird durch ihre Reinigung 24 h nach der Transfektion gefolgt. Die Plaque-Reinigungsverfahren kann bis zu 10 Runden, letzten 3-4 Wochen dauern und führt oft zu unerwünschten rekombinanten Viren mit Selektionsmarker in Off-Target-Regionen eingesetzt. DNA - Doppelstrangbrüchen effektiv homologe Rekombination in Säugerzellen 37, induzieren und durch diesen Mechanismus die Nutzbarmachung der Wirkungsgrad mutant VV des Erzeugens kann erheblich verbessert werden. Die gRNA geführte Cas9 System wurde in der Genom Bearbeitung und verbessert die Effizienz der homologen Rekombination in eukaryotischen Organismen 22, 25. Letzter Zeit in Wirtszellen , die Genome von Adenovirus und Typ I Herpes Simplex Virus bearbeitet wurden von der gRNA geführte Cas9 erfolgreich eingesetzt System 24. Es wurde kürzlich gezeigt, dass CRISPR Cas9 System ein leistungsfähiges Werkzeug für die effiziente Bearbeitung der VV-Genom ist und ein VV Vektor Konstruktion für eine exprimierendenbestimmten Gens. Beide N1L gRNA geführte Cas9 und die traditionelle homologe Rekombination (HR) Methode führte zu erfolgreichen HR Ereignissen an der gleichen Zielstelle von N1L. Interessanterweise jedoch gRNA geführte Cas9 induzierte HR bei viel höheren Wirkungsgrad als die herkömmliche Methode HR. Somit beseitigt die Verwendung von gRNA gelenkten Cas9 die Notwendigkeit, so viele Plaques zu reinigen mutant VVs zu erhalten. In dieser Arbeit konnten wir deutlich die Effizienz und den Zeitrahmen für die Erzeugung von Mutanten - VV die gRNA geführte Cas9 System 33 verwendet wird . Zu beachten ist, ist ein kritischer Schritt, eine hohe Effizienz der homologen Rekombination zur Gewinnung von CV-1-Zellen mit den Plasmiden exprimieren Cas9 und gRNA für 24 h zu transfizieren, bevor die herkömmliche homologe Rekombination durchgeführt wird. Die 24-h-Intervall erlaubt Cas9 und gRNA auf einem vernünftigen Niveau zum Ausdruck gebracht werden. Ferner müssen die gRNA Sequenz, die ein bestimmtes Gen Targeting kann optimiert werden, wie wir, dass die verschiedenen gRNA t Sequenzen gefundenargeting N1L Gen in ihrer Effizienz 33, 34 variiert. Die Begrenzung für die CRISPR / Cas9 in Bearbeitung VV ist die niedrige Rate von RFP-positiven Plaques in der ersten Runde der Rekombination. Um eine ausreichende Anzahl von RFP-positiven Plaques enthaltenden rekombinanten Virus zu erhalten, in der Regel mindestens zehn 6-Well-Platten benötigt, was macht Erstrunden-Screening langweilig. Daher besteht immer noch ein Bedürfnis, das Protokoll zu optimieren, um diese Einschränkung zu überwinden. Die geringe Größe des RFP-positiven Plaques ist ein weiteres potentielles Problem, das zu einem hohen Volumen von Lysat zurückzuführen ist verwendet, um eine 6-Well-Platte zu infizieren. Um dies zu überwinden, sollte ein kleineres Volumen des Lysats verwendet werden, um eine 6-Well-Platte zu infizieren, um größere Größe RFP-positive Plaques erhalten. ein kleineres Volumen von Lysat wird auch für eine bessere Trennung von RFP-positive Plaques aus den RFP-negativen ermöglichen. Folglich werden weniger Runden Plaquereinigung erforderlich reine RFP-positive Plaques zu erhalten. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Off-Target-Effekte sind immer ein unerwünschtes Problem in der Gen-Bearbeitung. CRISPR-Cas9 hat Off-Target-Effekte gezeigt. Doch mit einer sorgfältigen Gestaltung von gRNA, Off-Target - Effekte können vermieden werden , wenn die Bearbeitung der VV 33, 34 Genome. Dies ist der besondere Vorteil der gRNA geführte Cas9 System für die Bearbeitung des Genoms von VV. In Anbetracht der Versprechen von VV, mit dem CRISPR / Cas9 System wird die Entwicklung von mutierten VVs für die biomedizinische Forschung und in der translationalen Medizin beschleunigen. Darüber hinaus würde ein solches System auch beschleunigen Entdeckungen in der Zellbiologie, wie Dissektion der Signalwege von VV verwendet für die Aktin-basierte Motilität.

Vaccinia-Virus (VV) ist ein umhülltes DNA-Virus auf die Pockenvirus-Familie gehört und hat eine entscheidende Rolle in einer der größten Erfolge in der Medizin der Ausrottung der Pocken gespielt. In der post-Eradikation Ära der Pocken, VV zur Abgabe von Genen , die für Impfstoffe gegen HIV und andere Infektionskrankheiten als Vektor entwickelt 1-7 durch Einfügen von Genen aus verschiedenen Pathogenen in VV - Vektoren wurde. VV wurde auch als Vektor für die Krebsimmuntherapie 8-14 speziell für die Entwicklung von Tumor-bezogenen replizierende onkolytischen Vacciniavirus extensiv verwendet worden. Um eine wirksame Impfstoffvektor mit verbesserter Selektivität für Krebszellen, Modifikationen innerhalb des viralen Genoms zu schaffen, erforderlich sind, einschließlich Gen-Deletionen oder Einführung von therapeutischen Genen. Mit der Entwicklung der DNA-Technologie und ein besseres Verständnis der Molekularbiologie und Virologie, Insertion von Fremd-DNA in VV ursprünglich erreichend unter Verwendung der homologen Rekombination (HR) in den 1980er Jahren 15. Dieses Verfahren ist immer noch weit verbreitet VV-Vektoren für die Konstruktion. Einführung der genetischen Modifikation unter Verwendung eines Shuttle-Vektors für HR erreicht, die in pre-infizierten Zellen mit der VV-Genom rekombiniert. Jedoch hat dieses Verfahren als sehr ineffizient erwiesen (weniger als 1% homologe Rekombinationseffizienz 16) und führt oft in zufällige Insertion des Selektionsmarkers in Nicht-Zielbereiche und / oder den Verlust des Markers auf Virus Expansion. Die Effizienz der DNA homologe Rekombination zum Einführen exogener DNA in genomische Loci kann drastisch in Gegenwart von Doppelstrangbrüchen (DSB) 17 verbessert werden. Daher ist die Technologie, die DSBs an Ziel-Loci birgt ein großes Potenzial für die Genomtechnik von VV induzieren kann. Die neu entwickelte CRISPR-Cas9 System zeigt Versprechen für DSBs in jedem VV-Gen-Region auslösen. CRISPR-Cas9 ist ein RNA-geführte Nuklease in adaptiven Immunität gegen eindringende Phagen und andere fremde genetische Materialien beteiligt 18-20. Es gibt drei CRISPR-Cas - Systeme im Bereich der mikrobiellen Spezies 21. Der Typ II CRISPR-Cas-System ist für die Bearbeitung des Genoms von eukaryotischen Zellen und große Viren weit verbreitet. Es besteht aus dem RNA-guided Cas9 Endonuklease (aus Streptococcus pyogenes), eine einzige Führungs RNA (sgRNA) und das trans-aktivierende crRNA (tracrRNA) 22-24. Die Cas9 / sgRNA Komplex erkennt die komplementären 20-Nukleotid - genomischen Sequenz vorhergehenden einem 5&#39;-NGG-3 &#39;Protospacer benachbarten Motiv (PAM) Sequenz in Säugetierzellen 22, 23. Es ist für effektive Erzeugung von gentechnisch veränderten Zellen, Viren erfolgreich eingesetzt wurde und Tiermodelle 22-32. Der CRISPR-Cas9 System hat sich als ein effizientes Werkzeug für die Genom in Kombination im Zytoplasma von VV mit homologe Rekombination gezielt zu infizierten CV-1-Zellens zu erzeugen mutierten Vaccinia - Viren 33, 34 dar . Um die mögliche Anwendung dieses Verfahrens zu verlängern, wir detaillierte Informationen über dieses Systems Methodik vorzustellen. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um eine Mutante VV mit einem bestimmten Gen-Deletion zu erzeugen und / oder den Arm des mutierten Virus mit einem therapeutischen Transgen.

<table><tbody><tr><td>Plasmid #41824</td><td>41824</td><td>Addgene</td><td>gRNA cloning vector</td></tr><tr><td>pST1374</td><td>13426</td><td>Addgene</td><td>Cas9 cloning vector</td></tr><tr><td>pGEMT easy</td><td>A1360</td><td>promega</td><td>repair donor vector cloning</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>C4040-10</td><td>Invitrogen</td><td>transformation</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>27106</td><td>Qiagen</td><td>plasmid extraction</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Eagle&amp;rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>11965-092</td><td>Life Technologies</td><td>cell culture medium</td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>SH30088.03HI</td><td>Hyclone</td><td>cell culture serum</td></tr><tr><td>penicillin, streptomycin</td><td>15070-063</td><td>Thermo Scientific</td><td>antibiotics</td></tr><tr><td>Effectene</td><td>301425</td><td>Qiagen</td><td>transfection</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0&amp;nbsp;mL</td><td>W-06754-96</td><td>Thermo Scientific</td><td>collect virus</td></tr><tr><td>fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus BX51 Fluorescence&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>find RFP-positive plque</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>69506</td><td>Qiagen</td><td>DNA extraction</td></tr><tr><td>Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix</td><td>AB-0794/B</td><td>Thermo Scientific</td><td>PCR reagent</td></tr><tr><td>10 cm culture dish</td><td>Z688819-6EA</td><td>sigma</td><td>cell culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Z707759</td><td>sigma</td><td>cell culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>C5981</td><td>sigma</td><td>scrap cells</td></tr><tr><td>1x Trypsin-EDTA solution</td><td>T4299</td><td>sigma</td><td>trypsinize cells</td></tr><tr><td>Virkon</td><td>95015661</td><td>Anachem Ltd</td><td>desinfectant</td></tr><tr><td>Falcon tube</td><td>CLS430791-500EA</td><td>Sigma</td><td>hold cell suspension</td></tr><tr><td>N1L forward 5&amp;rsquo;-TATCTAGCAATGGACCGT-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>N1L reverse&amp;nbsp; 5&amp;rsquo;-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3&#039;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>A52R forward 5&amp;rsquo;-ATAGGATTGTGTGCATGC-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>A52R reverse 5&amp;rsquo;-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>RFP forward 5&amp;rsquo;- GCTACCGGACTCAGATCCA-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>RFP reverse 5&amp;rsquo;-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3&amp;rsquo;</td><td></td><td>Sigma</td><td>PCR primer</td></tr><tr><td>Argarose</td><td>A7431</td><td>Sigma</td><td>resolve PCR product</td></tr><tr><td>G:BOX F3</td><td>G:BOX F3</td><td>Syngene</td><td>UV gel doc</td></tr></tbody></table>

a simple and efficient approach to construct mutant vaccinia virus vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Für den Bau eines neuen VV Vektor, der Schlüssel ist Ausgangspunkt zu entwerfen und einen Spender-Shuttle-Vektor zu konstruieren, der eine bestimmte Region des Genoms ausrichten können. In dieser Studie wurde das VV N1L Gen als Beispiel Target verwendet. Die Kassette des Spender Shuttle - Vektor für die Rekombination und der Zielregion in dem VV in 1 gezeigt sind. Um die Effizienz der homologen Rekombination zu erhöhen, Plasmiden Cas9 und N1L spezifische gRNA exprimieren , wurden co-transfiziert in den CV -1 Zellen 48 h vor der homologen Rekombination 33 durchführt. Eines Tages (24 h) nach der Transfektion, RFP wurde in den CV-1 - Zellen (Abbildung 2) ausgedrückt. Nach der Infektion von CV-1 - Zellen mit dem gesamten Lysats aus der homologen Rekombination (Schritt 5), RFP-positive und negative Plaques wurden beobachtet sowohl in den CV-1 - Zellen (Abbildung 3). Nach dem Reinigungsprotokoll beschrieben, eine reine Plaque co<html> ULD nach 3-5 Runden der Reinigung erhalten werden. Wie in 4 gezeigt, aus einer reinen Plaque alle Plaques nach der Infektion mit Zelllysat mit dem mutierten Vaccinia - Virus abgeleitet präsentiert ein RFP - Signal. Um zu überprüfen , ob die reine Mutante VV die richtige Genveränderung hatte, wurde PCR verwendet , um die Abwesenheit des anvisierten N1L Gens zu bestätigen, wie in Abbildung 5 dargestellt. PCR des modifizierten Virus zeigte ein positives Signal für RFP und einen abwesenden Signal für N1L ( Abbildung 5 lane AG), während die Ergebnisse der PCR N1L für die Kontrollvirus (Ctr) mit intaktem N1L Bereich positiv ist. Die Kontroll-DNA-Fragmente von A52R waren positiv für alle rekombinanten Viren und Ctr-Virus. Die HR - Effizienz in RFP-positiven Plaques ist 100% (6/6) in diesem Experiment (es bis zu 94% in der vorherigen Arbeit 34 war). Das hier beschriebene Verfahren hat die Rekombinationseffizienz um mehr als das 100 - fache im Vergleich zu herkömmlichen Protokollen 33, 34 verbessert. Inhalt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig1.jpg" /> Abb . 1: Die Kassette des Donor - Shuttle - Vektor für die homologe Rekombination und die Zielregion in dem VV - Genom Die Reinigung Markergen RFP wird durch das H5 - Promotor angetrieben. Die Reparatur Donorvektor die N1L Region Ergebnisse im RFP Gen-Targeting, die in die N1L Region nach homologe Rekombination eingebaut. &#39;X&#39; zeigt die homologe Sequenz in der Reparatur Spender Vektor, der die gleiche Sequenz auf dem Vaccinia - Virus - Genom ersetzen wird. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Abbildung des CV-1 - Zellen einen Tag nach der homologen Rekombination Eines Tages nacr homologe Rekombination, die Zellen mit VV infiziert gegeben und durch Reparatur Spender Vektor sind RFP-positiv . A: Phasenkontrastbild (Originalvergrößerung 100X) . B: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme (Originalvergrößerung 100X). Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Ein RFP-positive Plaque in der ersten Runde der Reinigung des mutierten Virus in der ersten Runde der Reinigung des mutierten Virus, das RFP-positive Plaque (eingekreist mit roter Linie) mit der Zielregion Löschung werden von Plaques gebildet umgeben von Wildtyp - Virus (eingekreist mit gelbe Linie) . A: Phasenkontrastbild (Originalvergrößerung 100X) . B: Fluoreszenz microscopy Bild (Originalvergrößerung 100X). Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig4.jpg" /> Abb . 4: Die reine Mutante VV Nach 3-5 Runden der Reinigung, reine Plaques wurden wie alle Plaques erhalten wurden , waren RFP-positiv . A: Phasenkontrastbild (Originalvergrößerung 100X) . B: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme (Originalvergrößerung 100X) . Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54171/54171fig5.jpg" /> Abbildung 5: Verification der reinen Mutante VV. Die DNA wurde aus VV extrahiert infizierten CV-1 - Zellen. Die Deletion der Zielregion N1L durch PCR unter Verwendung von Primern N1L, das Einfügen von RFP in N1L Region überprüft wurde, wurde durch PCR unter Verwendung von Primern, RFP bestätigt. Die Spuren AF zu sechs gereinigten Plaques entsprechen, Spur G ist eine Steuertafel mit N1L Deletion in früheren Arbeiten überprüft 33, Spur Ctr (Kontrolle) ist das Wildtyp - Vaccinia - Virus (mit N1L Region intakt). A52R - Gen wurde als Kontroll - Gen für alle Proben amplifiziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54171/54171fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Vaccinia-Virus (VV) ist in der biomedizinischen Forschung und der Verbesserung der Gesundheit des Menschen weit verbreitet. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, hocheffiziente Methode, um die VV-Genom mit Hilfe eines CRISPR-Cas9 System zu bearbeiten.

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

a-simple-efficient-approach-to-construct-mutant-vaccinia-virus

Universidad Científica del Sur

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.2K Aufrufe.  Queen Mary University of London.  Vaccinia-Virus (VV) ist in der biomedizinischen Forschung und der Verbesserung der Gesundheit des Menschen weit verbreitet. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, hocheffiziente Methode, um die VV-Genom mit Hilfe eines CRISPR-Cas9 System zu bearbeiten. 

Serie: A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for safe and effective therapies tailored to individual tumor immune profiles. Oncolytic viruses enable the induction of anti-tumor immune responses as well as tumor-restricted gene expression. This protocol describes the generation and ex vivo analysis of immunomodulatory oncolytic vectors. Focusing on measles vaccine viruses encoding bispecific T cell engagers as an example, the general methodology can be adapted to other virus species and transgenes. The presented workflow includes the design, cloning, rescue, and propagation of recombinant viruses. Assays to analyze replication kinetics and lytic activity of the vector as well as functionality of the isolated immunomodulator ex vivo are included, thus facilitating the generation of novel agents for further development in preclinical models and ultimately clinical translation.

This protocol describes a detailed workflow for the generation and ex vivo characterization of oncolytic viruses for expression of immunomodulators, using measles viruses encoding bispecific T cell engagers as an example. Application and adaptation to other vector platforms and transgenes will accelerate the development of novel immunovirotherapeutics for clinical translation.

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Forschung

Krebsforschung

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für die Gentherapie über DNA-Familie Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Immunologie und Infektion

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Neurowissenschaften

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Generierung von rekombinanten aviären Herpesvirus Vektoren mit CRISPR/Cas9 gen bearbeiten

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.

Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Construction of Adenoviral Vectors using DNA Assembly Technology

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an adenoviral vector by manipulating the genomic DNA of wild-type HAdV-7 by using a DNA assembly method. First, an infectious clone of HAdV-7, pKan-Ad7, was generated by fusing the viral genomic DNA with a PCR product from plasmid backbone, comprising of the kanamycin-resistant gene and the origin of replication (Kan-Ori), through DNA assembly. This was done by designing a pair of PCR primers, that contained ~25 nucleotides of the terminal sequence of HAdV-7 inverted terminal repeat (ITR) at the 5' end, a non-cutter restriction enzyme site for HAdV-7 genome in the middle, and a template-specific sequence for PCR priming at the 3' end. Second, an intermediate plasmid-based strategy was employed to replace the E3 region with transgene-expressing elements in the infectious clone to generate an adenoviral vector. Briefly, pKan-Ad7 was digested with dual-cutter restriction enzyme Hpa I, and the fragment containing the E3 region was ligated to another PCR product of plasmid backbone by Gibson assembly to construct an intermediate plasmid pKan-Ad7HpaI. For convenience, restriction-assembly was used to designate the plasmid cloning method of combined restriction digestion and assembly. Using restriction-assembly, the E3 genes in pKan-Ad7HpaI was replaced with a green fluorescent protein (GFP) expression cassette, and the modified E3 region was released from the intermediate plasmid and restored to the infectious clone to generate an adenoviral plasmid pKAd7-E3GFP. Finally, pKAd7-E3GFP was linearized by Pme I digestion and used to transfect HEK293 packaging cells to rescue recombinant HAdV-7 virus. To conclude, a DNA assembly-based strategy was introduced here for constructing adenoviral vectors in general laboratories of molecular biology without the need of specialized materials and instruments.

<meta charset="utf8"></head><body>Konstruktion adenoviraler Vektoren mit Hilfe der DNA-Assemblierungstechnologie

In this study, an infectious clone of human adenovirus type 7 (HAdV-7) was constructed, and an E3-deleted HAdV-7 vector system was established by modifying the infectious clone. This strategy used here can be generalized to make gene transfer vectors from other wild-type adenoviruses.

Konstruktion adenoviraler Vektoren mit Hilfe der DNA-Assemblierungstechnologie

Adenoviral vectors have been used as a gene transfer tool in gene therapy for more than three decades. Here, we introduce a protocol to construct an ...

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

Zusammenfassung

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Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Generierung von rekombinanten aviären Herpesvirus Vektoren mit CRISPR/Cas9 gen bearbeiten

Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl

Konstruktion adenoviraler Vektoren mit Hilfe der DNA-Assemblierungstechnologie

Konstruktion adenoviraler Vektoren mit Hilfe der DNA-Assemblierungstechnologie