Diese Methode kann dazu beitragen, die wichtigsten Herausforderungen im Bereich der Krebsimmuntherapie zu bewältigen, indem sie die Entwicklung von onkolyktischen Vektoren für eine gezielte Immunmodulation erleichtert. Der Hauptvorteil des angewandten Reverse-Gensystems ist seine Vielseitigkeit; daher können Vektoren angepasst werden, um verschiedene Forschungsfragen zu adressieren und Tumoren mit unterschiedlichen Immunsignaturen anzusprechen. Die Virusausbreitungsschritte, insbesondere die Bestimmung des optimalen Zeitpunkts für die Ernte des Virus, sind von einem Textprotokoll schwer zu lernen, da die Synzytätsbildung im Laufe der Zeit visuell beurteilt werden muss.
Um mit dem Entwurf und klonen von rekombinanten immunmodulatorischen Vektoren zu beginnen, wie im Manuskript beschrieben. Dieses Protokoll beschreibt spezifische Schritte zur Entwicklung eines onkolytischen Masern-Impfstoffvektors, der einen bispezifischen T-Zell-Engager kodiert. Um das Masernvirus aus der cDNA zu retten, 24 Stunden vor der Transfektionsplatte produzieren Masernvirus-Produzentenzellen gleichmäßig auf einer 6-Wand-Platte.
Samen 200. 000 Zellen in 2 Milliliter DMEM, die 10 Prozent FBS pro Brunnen enthalten, um 65 bis 75 Prozent Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen. Mischen Sie 5 Mikrogramm rekombinanter DNA, die das Masernvirus-Antigenom kodiert, das zur Transfektion der Zellen verwendet wird. Geeignete Plasmide und ein fluoreszierender Reporter in einem Gesamtvolumen von 200 Mikroliter DMEM.
Fügen Sie 18,6 Mikroliter liposomaler Transfektionsreagenz in die Mischung ein und streichen Sie sofort das Rohr zum Mischen. Inkubieren Sie diese Transfektionsmischung für 25 Minuten bei Raumtemperatur. Um die MV-Produzentenzellen zu transfekten, entfernen Sie das Medium aus der 6 Well-Platte, die auf 65 bis 75 Prozent Konfluenz gewachsen ist, und fügen Sie 1,8 Milliliter DMEM mit 2 Prozent FBS und 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin pro Brunnen hinzu.
Dann fügen Sie die Transfektionsmischung tropfenweise zu jedem Brunnen hinzu und wirbeln Sie vorsichtig. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch 2 Milliliter frisches DMEM mit 2 Prozent FBS und 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und wiederholen Sie dies, wenn Medium sauer wird, das von der gelben Farbe erkannt wird.
Verwenden Sie ein Mikroskop, um Zellen täglich für die Reporter-Genexpression und Synzytia-Bildung zu beobachten. Wenn große Synzytia, bestehend aus 20 oder mehr Zellen, sichtbar sind oder wenn Zellen zu dicht werden, ernten sie das Virus. 24 Stunden vor dem erwarteten Erntesaatgut etwa 1,5 Millionen MV-Erzeugerzellen in 12 Milliliter DMEM mit 10 Prozent FBS auf 10-Zentimeter-Schalen, um 65 bis 75 Prozent Konfluenz zum Zeitpunkt der Virusimpfung zu erreichen.
Um das Virus zu sammeln, verwenden Sie einen Zellschaber, um anhaftende Erzeugerzellen vorsichtig von der 6-Wandplatte mit transfizierten Zellen zu kratzen. Übertragen Sie das Medium, das die abgekratzten Zellen enthält, in ein Zentrifugenrohr. Zentrifuge für mindestens 2500 mal G und 4 Grad Celsius für 5 Minuten, um Zellablagerungen zu entfernen.
Nach der Zentrifugation den zellfreien Überstand mit serumfreiem Medium auf ein Endvolumen von 4 Millilitern mischen, um Inokulum zuzubereiten. Entfernen Sie das Medium aus der 10-Zentimeter-Schale mit MV-Produzentenzellen und fügen Sie das Inokulum zu den Zellen hinzu. Mindestens 2 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid inkubieren.
Nach der Inkubation 6 Milliliter DMEM mit 10 Prozent FBS hinzufügen und Zellen über Nacht inkubieren. Dann ersetzen Sie das Medium durch 12 Milliliter frischedmEM mit 10 Prozent FBS und brüten bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid bis zur Ernte. Beobachten Sie die Zellen mindestens zweimal täglich.
Bevor Die Synzytia platzen, wenn Membranstörungen sichtbar werden, ernten sie das Virus. Um den ersten Durchgang zu ernten, entfernen Sie den Überstand von der Platte und fügen Sie 600 Mikroliter Serumfreies Medium hinzu. Verwenden Sie dann einen Zellheber, um die Zellen zu kratzen und in ein sauberes Rohr zu übertragen.
Unmittelbar danach die Virussuspension in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei 80 Grad Celsius mindestens 24 Stunden aufbewahren, um ein gründliches Einfrieren zu gewährleisten. Bestimmung von Titstern von Virusbeständen in Octuplicaten pro Aliquot mit 96 Wandplatten. Ziehen Sie zunächst die Erzeugerzellen aus T75-Zellkulturkolben in 50 Milliliter konische Röhre.
Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellsuspension auf 150 000 Zellen pro Milliliter in DMEM mit 10 Prozent FBS an. Fügen Sie 90 Mikroliter DMEM mit 10 Prozent FBS pro Brunnen einer 96 Wandplatte hinzu. Dann fügen Sie 10 Mikroliter aus einem Aliquot des Virusbestands zu allen 8 Brunnen in der ersten Spalte der Platte hinzu.
Mischen Sie gründlich durch Pipettierung nach oben und unten mindestens 10 Mal. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter jedes Brunnens von der ersten bis zur zweiten Säule zu übertragen und gründlich zu mischen, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Wiederholen Sie dies für jede Spalte, um serielle zehnfache Verdünnungen des Virus mit frischen Pipettenspitzen für jeden Verdünnungsschritt zu erhalten.
Entsorgen Sie 10 Mikroliter aus jedem Brunnen der letzten Säule. Fügen Sie 100 Mikroliter Zellsuspension mit 150.000 Zellen pro Milliliter zu jedem Brunnen hinzu, um sicherzustellen, dass es keine Zellklumpen gibt. Inkubieren bei 37 Grad Celsius, 5 Prozent Kohlendioxid für 48 Stunden.
Prüfen Sie die Synchronisierung mit einem Lichtmikroskop. Zählen Sie die Syncytia in jedem Brunnen der Spalte mit dem höchsten Verdünnungsfaktor, der sichtbare Synzytia enthält. Bei Viren, die einen fluoreszierenden Reporter kodieren, kann Die Synzytia mittels Fluoreszenzmikroskopie gezählt werden.
Zur Analyse der Masernvirusreplikation kinetik einen Tag vor der Infektion Samen 100, 000 Vero-Zellen in 1 Milliliter DMEM mit 10 Prozent FBS pro Brunnen auf 12 Wandplatten mit mindestens 2 Brunnen für jeden Zeitpunkt von Interesse. Um die Zellen zu infizieren, ersetzen Sie das Medium durch 300 Mikroliter Serumfreies Medium, das die jeweilige Menge des Virus enthält. Bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid für mindestens 2 Stunden inkubieren.
Entfernen Sie Inoculum und fügen Sie 1 Milliliter DMEM mit 10 Prozent FBS hinzu und setzen Sie die Inkubation fort. An relevanten Zeitpunkten nach der Infektion ernten virale Wahrscheinlichkeit durch direktes Abkratzen von Zellen in das Medium. Übertragen Sie den Inhalt von jedem Brunnen auf eine einzelne Röhre.
Fangen Sie in flüssigem Stickstoff einfrieren und lagern Sie bei 80 Grad Celsius bis zur Titration und gehen Sie dann wie im Manuskript beschrieben vor. Um mit der Bewertung der bTE-induzierten zellvermittelten Zytotoxizität durch LDH-Freisetzung zu beginnen, isolieren Sie zunächst sezernierte Transgenprodukte, die von virusinfizierten Zielzellen exprimiert werden, und isolieren Immuneffektorzellen, wie im Manuskript beschrieben. Dann Samen Zielzellen in einer U-boden 96 Wandplatte und enthalten Proben, wie im Manuskript beschrieben.
Fügen Sie den jeweiligen Proben zuvor isolierte Immunmodulatoren in gewünschten Konzentrationen hinzu. Fügen Sie Immundefektzellen in den gewünschten Verhältnissen hinzu und fügen Sie mittlere zu einem Gesamtvolumen von 100 Mikroliterpro-Brunnen hinzu. Inkubieren Sie für die gewünschten zuvor festgelegten Zeitrahmen bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid.
45 Minuten vor der Probenentnahme 10 Mikroliter 10-fache Lysislösung zu Brunnen hinzufügen, die T max Proben und die entsprechenden Medium-Kontrollen enthalten, und die Inkubation fortsetzen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 mal G für 4 Minuten. Übertragen Sie 50 Mikroliter Überstand von jedem Brunnen auf die Brunnen einer flachen unteren 96 Wandplatte, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht übertragen werden.
Nach der Herstellung der Substratlösung nach dem Hersteller fügen Sie 50 Mikroliter zu jedem Brunnen. Inkubieren Bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten oder bis T max Proben tiefrot werden. Nach der Inkubation 50 Mikroliter Stop-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen.
Zentrifuge für 1 Minute bei 4000 mal G und dann mit einer ausgehöhlten Nadel Luftblasen zu entfernen. Messen Sie die optische Absorption mit 490 Nanometern und berechnen Sie, wie im Manuskript beschrieben. Nach der Impfung mit unveränderter und BTE-kodierender onkolytischer Masernviren erscheinen die Wachstumskurven der verglichenen Vektoren auf Vero-Zellen ähnlich.
Zelllebensfähigkeitskurven auf mc38 murinen kochromalen Karzinomzellen, die das humane karzinoembryonale Antigen stabil exezieren, und die MV-Rezeptoren CD46 nach der Impfung zeigen, dass die lytische Aktivität des transgenen kodierenden Virus in der murinen Tumorzelllinie zurückbleibt. Die Durchflusszytometrie von Zielantigen-exemittierenden Zellen, die mit BTE es bei fünf verschiedenen Verdünnungen inkubiert wurden, zeigte bTE-Bindung durch Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise. In Immunoblot nach magnetischem Pulldown von BTE-assoziierten Zellen zeigte sich, dass bei Nicht-Targeting-BTE keine nachweisbaren Mengen von Zellen vorhanden waren;während bei der Ausrichtung von BTE-Proben gebundene Zellen in der Elutionsfraktion vorhanden waren.
BTE vermittelte Zielantigen spezifische und konzentrationsabhängige Zytotoxizität von murinen T-Zellen wird durch repräsentativen LDH-Freisetzungstest angezeigt und zeigt, dass im vorliegenden Beispiel 15 Prozent spezifische Zelltötung bei einer relativ hohen BTE-Konzentration von 1 Mikrogramm pro Milliliter im Vergleich zu Referenzzellen erreicht wurde. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, regelmäßig Zellen zu überwachen, um das Fortschreiten der Infektion zu überprüfen. Vergessen Sie nicht, dass rekombinante Masern-Impfstoffstämme, obwohl abgeschwächt, besonders für immununterdrückte Personen gefährlich sein können.
Vermeiden Sie die Exposition, indem Sie die entsprechenden Biosicherheitsverfahren befolgen. Personen, die mit Viren umgehen, sollten vor der Durchführung dieser Methoden geimpft werden. Nach diesem Verfahren kann eine virale Expression weiterer Transgene erreicht werden, um Virus-Wirte-Wechselwirkungen und therapeutische Effekte zu analysieren.
Die Entwicklung dieser Techniken hat den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biotherapie geebnet, um die Auswirkungen lokal exprimierter Immunmodulatoren in zahlreichen Tumorentitäten zu erforschen;In Vitro, In Vivo, und auch in klinischen Studien.
