Name: protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into trophoblast stem cells
Uploaded: 2016-07-25T15:00:00.000+00:00
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AZ 84-02.04.2013: Alle Maus-Experimente wurden mit der Zustimmung der lokalen institutionellen Tierpflegegremien (Landes fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen [Zulassungs ID-Nummer nach dem deutschen Gesetz des Tierschutzes und im Einvernehmen durchgeführt .A428]). 1. Medienvorbereitung <ol><li> Bereiten 293T-Medium: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Penicillin / Streptomycin (1x). </li><li> Bereiten MEF Medium: DMEM, 10% (v / v) FBS, L-Glutamin (2 mM), 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, Penicillin / Streptomycin (1x). </li><li> Bereiten TS-Medium (w / o FGF4 / Heparin): Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640, 20% (v / v) FBS (Stammzellkultur-Qualität), Penicillin / Streptomycin (1x), L-Glutamin (2 mM ), Natriumpyruvat (1 mM), 2-Mercaptoethanol (0,1 mM). </li><li> Bereiten Sie TS-Medium mit FGF4 / Heparin (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) FBS (StammzellKulturqualität), Penicillin / Streptomycin (1x), L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), 2-Mercaptoethanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 &amp; mgr; g / ml Heparin. Anmerkung: FGF4 und Heparin werden direkt in die Medien unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt. </li><li> Vorbereitung TS-CM mit FGF4 / Heparin (TS-CM + F4H): 70% MEF Anlage TS Medium + 30% frisch hergestellten TS-Medium + 25 ng / ml FGF4, 1 &amp; mgr; g / ml Heparin. Anmerkung: FGF4 und Heparin werden direkt in die Medien unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt. </li><li> Bereiten Sie Transfektionsmediums: Erweiterte DMEM, 2% (v / v) FBS (Stammzellkulturqualität), L-Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (1x). </li><li> Bereiten Sie Virus-Produktionsmedium: Erweiterte DMEM, 5% (v / v) FBS (Stammzellkulturqualität), L-Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (1x). </li></ol> 2. murine embryonale Fibroblasten-Ableitung <ol><li> Set timed Paarungen wt 129S2SV Frauen mit und homozygote männlichen R26 :: rtTA Mäuse (Stamm Name; B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Am E13.5 Opfer Mäuse durch Genickbruch und zu isolieren primären murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) nach Standardprotokollen 8. Danach Platte Zellen aus einem Embryo auf einem 150-mm-Schale in MEF-Medien. </li><li> Sobald primäre MEF Kulturen Konfluenz auf 150-mm-Schalen erreichen, waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml PBS und 4 ml 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung. Inkubieren Geschirr für 3 bis 4 min in den Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Nach der Inkubation zu überprüfen, ob Zellen von der Schale abgelöst einem inversen Mikroskop (mit einem 10fach-Objektiv) verwendet wird. 5 ml MEF Medien Trypsinierung zu stoppen und Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen sammeln. </li><li> Pool Zellsuspension aus mehreren Gerichten und sammeln in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge Zellsuspension für 3 min bei 200 xg und 10 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in FBS, enthaltend 10% (v / v) Dimethylsulfoxid. Frieren MEFs in Aliquots für die weitere Verwendung. Hinweis: Alternativ können Sie auch Wildtype primäre MEFs; jedoch muss eine zusätzliche lentiviralen Vektor exprimierenden rtTA zusammen mit den anderen lentiviralen Vektoren transduziert werden (zum Beispiel unter Verwendung des FUdeltaGW-rtTA Plasmid durch Maherali et al. 9). </li><li> Herstellung von MEF Anlage TS - Medium Hinweis: Vor der Umwandlung Experimente, MEF Anlage (CM) TS Medien vorbereitet werden muss, die für die Subkultur der einzelnen ITSC Linien erforderlich ist (beschrieben in Abschnitt 6). <ol><li> Plate 1 x 10 7 mitotisch inaktivierten MEF pro 150 - mm - Schale in MEF Medium auf gewünschte Anzahl an Gerichten. Inaktivieren MEFs durch γ-Bestrahlung mit einer Dosis von 9 Gy. Hinweis: Die Ausbeute pro 150 mm Schale ca. 60 ml CM ist. </li><li> Der Tag nach der Plattierung, absaugen und MEF Medium verwerfen und 20 ml hinzufügen frisch TS-Medium hergestellt (ohne FGF4 / Heparin) auf jede Schale von mitotisch inaktivierten MEF und Ort Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Nach InkubationTS-Medium für drei Tage auf mitotisch inaktivierten MEF, sammeln Medium in 50 ml konischen Röhrchen. Filtermedium durch ein 0,2-um-Filter und fahren Sie mit 2.6.4. Ersetzen CM mit 20 ml frischem Medium TS zur Herstellung einer weiteren Charge von CM. Hinweis: Mitotisch inaktivierten MEF für CM Vorbereitung bis zu drei Mal verwendet werden. </li><li> Aliquotieren 35 ml gefiltertes CM in 50 ml konischen Röhrchen und bei -20 ° C bis benötigt. Nach dem Auftauen 15 ml frisch hergestellten TS-Medium um 70% TS-CM und lagern bei 4 ° C zu erhalten, für bis zu einem Monat. </li></ol></li></ol> 3. Lentivirale Vector Produktion in 293T-Zellen Hinweis: Alle Schritte werden im Laborraum zu Biosafety Level lizenziert 2 durchgeführt. <ol><li> Vor der Umwandlung Experimente, lentivirale Vektoren für die Doxycyclin (DOX) abhängig Überexpression von Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2 und mCherry vorzubereiten. Für jede Lentiviren, Co-transfizieren mit 293T-Zellen diejeweiligen lentiviralen Transfervektor zusammen mit einem Verpackungs Plasmid und einem VSV-G-exprimierenden Plasmid Hülle (für Informationen Plasmid zu den Materialien siehe Tabelle). Hinweis: Für hilfreiche Informationen in Bezug auf die Produktion Virus Gavrilescu beziehen et al . 10. Obwohl es Retro Produktion beschreibt auch, allgemeine Bemerkungen in Bezug auf Qualität von 293T-Zellen und Plasmid-DNA sind wahr für Lentiviren Produktion. VORSICHT: Geeignete Sicherheitsmaßnahmen getroffen werden müssen, wenn sie mit lentiviralen Vektoren und Arbeit Arbeit hat in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt werden. </li><li> Coat fünf 100 mm-Schalen mit Poly-L-Lysin (100 &amp; mgr; g / ml) Lösung, die durch Abdecken der Gerichte mit 5 ml der Lösung und Schaukel sanft Beschichtungslösung gleichmäßig verteilen. Die Schalen werden wieder in den Inkubator bei 37 ° C für 30 min. Nach 30 absaugen Beschichtungslösung min und spülen Geschirr einmal mit PBS. </li><li> Tafel 7 x 10 6 293T Zellen pro Schale in 10 ml 293T-Zellmedien, swirl Gerichte gleichmäßig Zellen und Platz Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C zu verteilen. </li><li> Am nächsten Morgen, Wachstumsmedium mit 5 ml Transfektionsmediums ersetzen. In 6 ul einer 1,000x Lager von Chloroquin-Lösung (25 mM) und Platz Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Inzwischen bereiten Transfektionsgemischs: <ol><li> Für jeden lentiviralen Vektor zwei 5 ml Reaktionsgefäße herzustellen, die mit A und B. </li><li> In 600 ul 2x HEPES-gepufferte Salzlösung (HBS) auf das Rohr A. </li><li> In Rohr B - Mix 61,5 ul CaCl 2 - Lösung (2 M), mit 18,5 ug lentivector DNA und 9,25 ug psPAX2 und 9,25 ug pMD2.G. Stellen Sie die Lautstärke auf 600 &amp; mgr; l mit sterilem Kulturqualität H 2 O. </li><li> In Lösung von Rohr B tropfenweise zu Rohr A während verwirbelt. Inkubieren Transfektion Mischung 15 min bei RT. </li></ol></li><li> In Transfektionsgemischs fallen sehr sorgfältig weise auf die vorbereiteten 293T-Zellen auf der 100-mm-Schale. EINfter 5 bis 6 h entfernen Medium und ersetzen mit 10 ml Virus-Produktionsmedium. Platzieren Geschirr wieder in den Inkubator bei 37 ° C. Hinweis: Seien Sie vorsichtig beim Entfernen und Ersetzen Medium, da leicht 293T-Zellen aus der Schale lösen. Medienwechsel 5-6 Stunden nach der Transfektion ist von entscheidender Bedeutung, da längere Exposition gegenüber Chloroquin auf die Zellen toxisch ist. </li><li> Am nächsten Morgen, sorgfältig entfernen und zu entsorgen Medium und mit 7 ml Virus-Produktionsmedium ersetzen. </li><li> Am nächsten Morgen ernten die erste Charge von virushaltigen Medium. Absaugen Medium und sammeln sich in einem 15 ml konischen Röhrchen. Wieder 7 ml Virus-Produktionsmedium auf die Zellen hinzufügen. Shop virushaltige Medium im Kühlschrank, bis die zweite Partie am folgenden Tag geerntet wird. </li><li> Am nächsten Morgen die zweite Charge von virushaltige Medium absaugen es zu den 15 ml konischen Röhrchen, das die erste Partie Zugabe. 293T-Zellen können nun verworfen. Filter virushaltige Medium durch einen 0,45 &amp; mgr; m surfactant freie Celluloseacetat -Membran Filter. Aliquot filtriert, virushaltige Medium und bei -80 ° C zur weiteren Verwendung. Anmerkung: Die Virusproduktion kann auch in 6-Well-Platten durchgeführt werden. Nach unten skalieren Volumen und Zellzahlen entsprechend. </li></ol> 4. Fibroblast Transduction mit 4 Faktoren und mCherry Steuervektor Hinweis: Alle Schritte werden in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt. <ol><li> Für eine schematische Darstellung der experimentellen Umriss siehe Abbildung 1. Auftauen eine aliquote Menge von primären rtTA-MEFs und 3,33 x 10 5 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well - Platte in einem Gesamtvolumen von 2 ml MEF Medien plattieren. Bereiten Sie mindestens 3 Vertiefungen und beschriften mit 4 Faktoren (4F), mCherry und Kontrolle. Hinweis: Alternativ können Wildtyp-MEFs verwendet werden, wenn ein rtTA exprimierenden lentiviralen Vektor zur lentivector Cocktail während 4,2 Schritt hinzugefügt wird. </li><li> Am folgenden Tag, nachdem die Zellen vollständig von cryopre erholtservation Ersetzen MEF Medien in den drei 6-wells mit 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) und 1 ml (Kontrolle) von Transduction Medien, respectively. Tauen Sie eine aliquote Menge von PLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, ets und -mCherry Virus bei RT und fügen 100 ul jeder Virus enthaltenden Überstand (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) in den 4F gut. Hinweis: Bei Wildtyp-MEFs, reduzieren Volumen von vorplattiertes Medien von 100 &amp; mgr; l und fügen Sie zusätzlich 100 ul FUdeltaGW-rtTA Virus auf das 4F Mischung enthaltende Überstand. </li><li> 100 l mCherry virushaltigen Medien auf die gut mit mCherry gekennzeichnet. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 &amp; mgr; g / ml in jede Vertiefung. Die Schale wieder in den Inkubator bei 37 ° C und Inkubation MEFs O / N mit virushaltigen Überstand. Hinweis: Bei Wildtyp-MEFs, reduzieren Volumen von vorplattiertes Medien von 100 &amp; mgr; l und fügen Sie zusätzlich 100 ul FUdeltaGW-rtTA virushaltige Überstand. </li><li> Am nächsten Morgen, sorgfältig entfernenvirushaltigen Medien und wasche dreimal mit 2 ml PBS. Schließlich 2 ml TS-Medien (ohne FGF4 / Heparin). Anmerkung: Transduzierte MEFs kann entweder direkt zur ITSC Induktionsexperimente verwendet werden, oder zur weiteren Verwendung eingefroren. </li></ol> 5. Fibroblast zu ITSC Conversion Hinweis: Alle Schritte werden im Laborraum zu Biosafety Level lizenziert 2 durchgeführt. <ol><li> Waschen Sie transduzierten MEFs zweimal mit 2 ml PBS und nach Zugabe von 0,5 ml Trypsin / EDTA-Lösung sie im Inkubator inkubieren 3-4 min. Überprüfen Sie unter einem inversen Mikroskop für die ordnungsgemäße Ablösung der Zellen. <ol><li> Inactivate Trypsin von 1 ml Medium TS Zugabe. Übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen und zentrifugieren für 3 min bei 200 x g. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 2 ml TS-Medium. Verwenden Sie die untransduzierten Kontrollprobe, die Zellen zu zählen. </li><li> Platte 4F-MEFs, mCherry-MEFs und untransduzierten Steuer MEFs jeweils in einer Dichte von 2 x 10 &amp; sup5 ;Zellen pro 100 mm Zellkulturschale in 10 ml TS-Medium, enthaltend 2 &amp; mgr; g / ml dox (TS-Medium + FGF4 / Heparin + DOX). </li><li> Alternativ führen transdifferentiation auf kleinere Gerichte. Platte 3,6 x 10 3 Zellen pro cm 2 auf gewünschte Schale Größe, Umfang Volumen entsprechend. </li></ol></li><li> Am nächsten Tag, ein Epifluoreszenz-Mikroskop (mit einem 10fach-Objektiv und einen Filter geeignet für rote Fluoreszenzanregung) überwachen die Expression von mCherry Protein um Transduktionseffizienz zu schätzen. Hinweis: Transduktionswirksamkeit sollte auf 100% betragen. Wenn erhöhte Zelltod nach Transgen Induktion offensichtlich ist bedeutet dies, dass Virus-Titer zu hoch war. Transduktion sollte mit verringerter Menge an Virus-haltigem Medium wiederholt werden. </li><li> Von nun an Wechselmedien auf allen Plattierung jeden zweiten Tag bis zum Tag 10 nach der Gerichte. Danach füttern Zellen mit TS-Medium ohne DOX (TS-Medium + FGF4 / Heparin). </li><li> Unter Verwendung eines invertierten Mikroskops Monitor fürAussehen von &#39;transdifferentiated Gebiete &quot;auf 4F Schale (auf 2B und C beziehen) für bis zu 3 Wochen. Solche Kolonien sollten sich nicht auf die beiden Kontrollschalen (mCherry-MEFs und untransduzierten MEF) sichtbar sein. </li></ol> 6. Isolierung einzelner ITSC Linien Hinweis: Für Schritt 6.3 eine Gewebekultur Haube ist nicht erforderlich. Es wird empfohlen, den inversen Mikroskop mit 70% Ethanol abzuwischen, um die Chancen auf eine bakterielle Kontamination zu minimieren. Einzel ITSC Kolonien können zwischen den Tagen 21 und 28 Tagen nach der Transdifferenzierungs isoliert werden. <ol><li> In 40 ul 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung in 12 Vertiefungen einer 96-U-Boden-Well-Platte und die Schale auf dem Eis. </li><li> Vor Kolonieisolierung, aspirieren Medium auf 4F-MEF transdifferentiation Gericht. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 ml PBS. Wieder, 10 ml PBS und Ort Schale unter einem inversen Mikroskop. </li><li> Mit einer 100-ul-Pipette auf 40 ul eingestellt einzelnen Kolonien Lift, durch circling sie mit der Pipettenspitze und dem schwimmenden Kolonie Absaugen. Transfer Zellen einer Kolonie jeweils in eine Vertiefung der vorbereiteten Schale mit 96 Vertiefungen. Nach dem Pflücken 12 Kolonien platzieren Schale mit 96 Vertiefungen in den Inkubator bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Distanzieren Zellen durch Auf- und Abpipettieren mehrmals und Transfer Zellsuspension in eine Vertiefung einer Schale mit 24 Vertiefungen mit vorbereiteten 500 ul TS-CM-Medium (30% Frisch TS-Medium + 70% CM + FGF4 / Heparin). </li><li> Am folgenden Tag ersetzen Medium mit frischem TS-CM-Medium toten Zellen zu entfernen. Ändern Medium jeden zweiten Tag. </li><li> Monitor für Auftreten von epithelialen Kolonien mit hellen Grenzen (siehe Abbildung 2). Sobald Kolonien erscheinen, Kultur bis 70% konfluent oder für bis zu einer Woche und nach und nach größere Gerichte erweitern auf. Von nun an Kulturzellen als bona fide TSCs, nach Standardprotokollen in serumhaltigen Medien oder in serumfreiem, definiertem Medium 3,5,11. </li></ol>

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	<li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast.">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts.">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li><li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells.">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li><li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta/activin.">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li><li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues.">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells.">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550 (2007).</li><li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions.">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das 4-Faktor (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) auf der Basis transdifferentiation Protokoll hier vorgestellten bietet eine zuverlässige Methode treu zu erzeugen umgewandelt iTSCs von embryonalen Maus-Fibroblasten. Ferner ist das Verfahren auch für die postnatale tail Fibroblasten, allerdings mit einem Rückgang der Effizienz 3 embryonale Fibroblasten im Vergleich zu. Im allgemeinen Qualität der primären Fibroblasten ist ein kritischer Faktor transdifferentiation Ergebnis und Sorgfalt sollte frühen Passage-Zel...

Vor kurzem wurde eine Studie mehrere Ansätze von embryonalen Maus-Stammzellen zu vergleichen Stammzellen Umwandlung in Trophoblasten hat ergeben, dass in allen untersuchten Systemen Linie Umwandlung unvollständig geblieben. Anstelle von induzierten Trophoblasten Stammzellen (iTSCs) so Trophoblast Stammzellen-ähnliche Zellen genannt wurden generiert 1 einem Speicher des Zellschicksals Herkunftshalte. Hier verfolgen wir einen anderen Ansatz der ITSC Generation. Ähnlich wie bei der direkten Induktion von pluripotenten Stammzellen , die aus murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) 2, haben iTSCs wurde von differenzierten somatischen Gewebe direkt umgesetzt. Zunächst identifizierten wir 12 Kandidaten Faktoren induzieren TSC Schicksal, wenn sie in MEFs überexprimiert. Später, die Faktoren Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 wurden für die ITSC Induktion 3 notwendig und ausreichend zu sein , identifiziert. Gleichzeitig fand eine andere Gruppe unabhängig Tfap2c, Gata3 und Eomes ausreichend, um MEFs zu konvertieren in iTSCs. Jedoch, dassStudie, die Zeit für die Transgen - Expression erforderlich ist , deutlich länger im Vergleich zu unserer Studie verschiedene Umwandlungskinetik anzeigt, wenn Ets2 vom transdifferentiation Cocktail 4 abwesend ist. Herkömmliche fötalem Rinderserum (FBS) enthält Kultur induziert und Blastozysten abgeleitet Trophoblast Stammzellen beruht auf der Anwesenheit von Faktoren , die durch Wachstumsinaktivierten MEFs sezerniert 5,6. Während der Induktions ITSC werden diese Faktoren durch MEFs vorgesehen, die die vollständige Kombination von Transgenen fehlt und die nicht transdifferentiation laufen. Sobald jedoch einzelne ITSC Kolonien sind subkultiviert, benötigen sie Medien, die durch das Wachstum-inaktivierten MEF vorkonditioniert wurde. Von da an iTSCs können nach Standardprotokollen wie Blastozysten abgeleitet TSCs kultiviert und behandelt werden. Bemerkenswert ist , im Gegensatz zu Tanaka et al. 5, wir routinemßig Kultur TSCs und iTSCs ohne Gelatinieren Zellkulturschalen.

<table><tbody><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-10G</td><td>Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>human recombinant Fibroblast Growth Factor 4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 &amp;micro;g/ml stock solution. Store aliquots at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ProFection Mammalian Transfection System</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, no glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgene</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Gata3</td><td>Addgene</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgene</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgene</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm1(rtTA*M2)Jae/J 7&lt;/sup&gt;</td><td>JAX Mice</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>Charles River</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into trophoblast stem cells

Trophoblast Stammzellen (TSZ) entstehen als Folge der ersten Zellschicksal Entscheidung in Säugetierentwicklung. Sie können in vitro kultiviert werden, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung zu halten und in alle Subtypen des Trophoblasten lineage, äquivalent zu der in vivo zu differenzieren , um den fetalen Teils der Plazenta - Zellpopulation stammen führt. Deshalb bieten TSCs ein einzigartiges Modell Entwicklung der Plazenta und embryonale gegen außer embryonale Zellschicksal Entscheidung in vitro zu studieren. Von der Blastozysten-Stadium ab, eine deutliche bestehend epigenetische Barriere von DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen trennt eng beide Linien. Hier beschreiben wir ein Protokoll um alle Funktionen der Linie Barriere durch transiente Überexpression von trophoblast Schlüsselregulatoren überwinden Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 in murinen embryonalen Fibroblasten. Die trophoblast induzierten Stammzellen sind in der Lage selbst zu erneuern und sind nahezu identisch abgeleitet trophoblast Stammzellen Blastozyste in Bezug auf die Morphologie, Marker Genexpression und Methylierungsmuster. Funktionelle in vitro und in vivo - Assays bestätigen , daß diese Zellen entlang der Trophoblast lineage Erzeugung polyploid Trophoblasten Riesenzellen und chimerizing die Plazenta , wenn sie in Blastozysten injiziert zu differenzieren können. Die Induktion von Trophoblast Stammzellen aus somatischen Gewebe eröffnet neue Wege genetischen und epigenetischen Merkmale dieser extraembryonale Linie zu studieren und bietet die Möglichkeit, trophoblast Stammzelllinien ohne Zerstörung des jeweiligen Embryo zu erzeugen.

Auf der Schale , wo die transgene Expression des 4F aktiviert wird, ändern sich Zellen schnell Morphologie (2A und B vergleichen). Um Tag 14-21 verschiedene transdifferentiated Bereiche entstehen (zwei Beispiele in 2B und C angegeben sind). Diese primären Kolonien fehlen typische TSC Morphologie; aber sobald sie subkultiviert, charakteristisch epitheliale Morphologie mit engen Kanten und helle Grenzen erinnert stark an bona fide TSCs entsteht (...

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Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.6K Aufrufe.  Institute of Pathology, University of Bonn Medical School. Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Serie: Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources. 
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

The protocol presented in this study describes methods for the real-time monitoring of reprogramming progression via the kinetic measurement of positive and negative pluripotent stem cell markers using flow cytometry analysis. The protocol also includes the imaging-based assessment of morphology, and marker or reporter expression during iPSC generation.

Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Biologie

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...