Todas as experiências de rato foram conduzidos de acordo com a lei alemã de protecção dos animais e de acordo com a aprovação dos comités Institutional Animal Care locais (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia [número de identificação de aprovação: AZ 84-02.04.2013 .A428]). 1. Preparação de Meios <ol><li> Prepare forma 293T: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% (v / v) de FBS, L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), penicilina / estreptomicina (1x). </li><li> Prepare MEF meio: DMEM, 10% (v / v) de FBS, L-glutamina (2 mM), aminoácidos não essenciais 1x, penicilina / estreptomicina (1x). </li><li> Preparar o meio TS (w / o FGF4 / heparina): meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 20% (v / v) de FBS (célula estaminal cultura grau), penicilina / estreptomicina (1x), L-glutamina (2 mM ), piruvato de sódio (1 mM), 2-mercaptoetanol (0,1 mM). </li><li> Preparar o meio TS com FGF4 / heparina (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) de FBS (célula estaminalcultura grau), penicilina / estreptomicina (1x), L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), 2-mercaptoetanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml de heparina. Nota: FGF4 e heparina são adicionados diretamente para a mídia imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepare TS-CM com FGF4 / heparina (TS-CM + F4H): 70% ar-MEF TS meio + 30% preparado de fresco TS meio + 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml de heparina. Nota: FGF4 e heparina são adicionados diretamente para a mídia imediatamente antes da utilização. </li><li> Prepare meio de transfecção: avançada DMEM, 2% (v / v) de FBS (grau de cultura de células-tronco), L-glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (1x). </li><li> Prepare forma Virus-produção: avançada DMEM, 5% (v / v) de FBS (grau de cultura de células-tronco), L-glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (1x). </li></ol> 2. Murino Embryonic de fibroblastos Derivação <ol><li> Definir acasalamentos cronometrados usando peso 129S2SV fêmeas e machos homozigotos ratos R26 :: rtTA (nome estirpe; B6.Cg-Gt (Rosa) 26Sor TM1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Em E13.5 sacrifício ratinhos por deslocamento cervical e isolar fibroblastos primários de murino embrionárias (MEFs) de acordo com protocolos padrão 8. Em seguida, células de chapa a partir de um embrião de um prato de 150 mm à media MEF. </li><li> Uma vez que as culturas primárias MEF atingem a confluência em pratos de 150 mm, lavar as células duas vezes com 10 ml de PBS e adicionar uma solução de tripsina / EDTA 4 ml de 0,05%. Incubar pratos para 3-4 min no incubador a 37 ° C. </li><li> Após incubação de verificação se as células isoladas a partir da placa, utilizando um microscópio invertido (usando uma lente de 10X). Adicionar 5 ml de meio de MEF para parar tripsinização e recolher suspensão de células para um tubo de 50 ml. </li><li> suspensão de células piscina de vários pratos e recolher em um tubo de 50 ml. suspensão de células Centrifugar durante 3 min a 200 xg e 10 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em FBS contendo 10% (v / v) de sulfóxido de dimetilo. Congelar MEFs em alíquotas para posterior utilização. Nota: Como alternativa, use typ selvageme MEFs primárias; No entanto, um vector lentiviral expressando rtTA adicional necessita de ser transduzidas juntamente com os outros vectores lentivirais (por exemplo, utilizando o plasmídeo FUdeltaGW-rtTA descrito por Maherali et al. 9). </li><li> Preparação de meio TS MEF-condicionado Nota: Antes de experiências de conversão, MEF-condicionado (CM) TS mídia tem que estar preparado, o que é necessário para subcultura de linhas ITSC individuais (descritos na secção 6). <ol><li> Placa 1 x 10 7 MEFs mitoticamente inactivadas por mm prato 150 em meio MEF no número desejado de pratos. Inactivar MEFs por irradiação com raios γ com uma dose de 9 Gy. Nota: O rendimento per mm prato 150 é de aproximadamente 60 ml de CM. </li><li> No dia após o plaqueamento, aspirado e descartar forma MEF e adicionar 20 ml de meio TS preparadas de fresco (sem FGF4 / heparina) em cada prato de MEFs e pratos lugar mitoticamente inactivados de volta na incubadora a 37 ° C. </li><li> após incubaçãomeio TS durante três dias em MEFs mitoticamente inactivadas, recolher meio em tubos de 50 ml cônico. Filtrar através de um filtro de 0,2 um e prosseguir com 2.6.4. Substitua CM com 20 ml de meio TS fresco para a preparação de um lote adicional de CM. Nota: mitoticamente inactivadas MEFs pode ser utilizado para a preparação CM até três vezes. </li><li> Aliquota de 35 ml de CM filtrado para tubos de 50 mL cónicos e armazenar a -20 ° C até serem necessários. Após descongelação, adicionar 15 ml de meio TS preparado de fresco, a fim de obter 70% de TS-CM e armazenar a 4 ° C durante até um mês. </li></ol></li></ol> 3. Lentivirus Vector Produção em células 293T Nota: Todos os passos são realizados no espaço de laboratório licenciado para o Nível de Biossegurança 2. <ol><li> Antes de experiências de conversão, prepare lentivirais para a doxiciclina (DOX) dependentes sobre-expressão de Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2 e mCherry. Para cada um lentivírus, as células 293T co-transfectar utilizando orespectivo vector de transferência de lentivírus em conjunto com um plasmídeo de empacotamento e um VSV-G plasmídeo que expressa o envelope (para informações plasmídeo referem-se à Tabela Materiais). Nota: Para obter informações úteis sobre a produção de vírus referem-se a Gavrilescu et al 10.. Embora ele descreve a produção de retrovírus, os comentários gerais a respeito da qualidade das células 293T e DNA plasmídeo são verdadeiras para a produção de lentivírus também. CUIDADO: medidas de segurança apropriadas devem ser tomadas, quando se trabalha com vetores de lentivírus e trabalho tem de ser realizado numa instalação de Nível de Biossegurança 2. </li><li> Revestimento cinco placas de 100 mm com solução cobrindo os pratos com 5 ml de solução e agitação ligeira para distribuir uniformemente solução de revestimento de poli-L-lisina (100 ug / ml). Colocar as cápsulas de volta na incubadora a 37 ° C durante 30 min. Após a solução de revestimento aspirado 30 min e lavar pratos uma vez com PBS. </li><li> Placa 7 x 10 6 293T células por placa em 10 ml de meio de células 293T, sWirl pratos para distribuir uniformemente as células e pratos lugar de volta na incubadora a 37 ° C. </li><li> Na manhã seguinte, substituir o meio de crescimento com 5 ml de meio de transfecção. Adicionar 6 ul de uma solução de estoque 1.000x cloroquina (25 mM) e pratos lugar de volta na incubadora a 37 ° C. </li><li> Enquanto isso, prepare mistura de transfecção: <ol><li> Para cada vector lentiviral preparar dois tubos de 5 ml de reacção, identificado como A e B. </li><li> Adicionar 600 ul de solução salina tamponada com HEPES 2x (HBS) ao tubo A. </li><li> No tubo de mistura B 61,5 ul solução de CaCl 2 (2 M), com 18,5 ug de ADN lentivector e 9,25 ug psPAX2 e 9,25 ug de pMD2.G. Ajustar o volume para 600 mL com a cultura estéril grau de H 2 O. </li><li> Adicionar solução de tubo B gota a gota tubo A, enquanto vórtex. Incubar mistura de transfecção durante 15 min à TA. </li></ol></li><li> Adicione a mistura de transfecção com muito cuidado, gota a gota às células 293T preparados na placa de 100 mm. UMAepois de 5 a 6 hr remover o meio e substituir por 10 ml de meio de produção de vírus. Coloque pratos de volta na incubadora a 37 ° C. Nota: Tenha cuidado ao remover e substituir médio vez que as células 293T facilmente destacar do prato. mudança de meio 5-6 h após a transfecção é crucial, uma vez que a exposição prolongada à cloroquina é tóxico para as células. </li><li> Na manhã seguinte, remova cuidadosamente e elimine médio e substituir com 7 ml de meio virus-produção. </li><li> Na manhã seguinte, colher o primeiro lote de meio contendo vírus. Aspirar médio e recolher em um tubo de 15 ml. Mais uma vez, adicionar 7 ml de meio de produção de vírus para as células. Loja vírus contendo meio no frigorífico até que o segundo lote é colhido no dia seguinte. </li><li> Na manhã seguinte, aspirar o segundo lote de meio contendo vírus adicionando-o ao tubo de 15 ml contendo o primeiro lote. células 293T pode agora ser descartada. Filtro contendo vírus do meio através de um sur 0,45acetato de celulose livre de factant filtro -membrane. Aliquota filtrada, meio e armazenar a -80 ° C para posterior utilização contendo vírus. Nota: A produção de vírus também pode ser realizado em placas de 6 poços. Reduza volumes e números de celulares em conformidade. </li></ol> 4. Fibroblasto Transdução com 4 fatores e mCherry controle vetorial Nota: Todos os passos são realizados numa instalação de segurança biológica Nível 2. <ol><li> Para uma representação esquemática do delineamento experimental referem à Figura 1. Descongelar uma alíquota dos primários rtTA-MEFs e placa 3,33 x 10 5 células por poço de um prato de 6 poços, num volume total de 2 ml de meio de MEF. Preparar pelo menos 3 poços e rotulá-los com 4 fatores (4F), mCherry e controle. Nota: Em alternativa, MEFs de tipo selvagem pode ser utilizado, quando um vector lentiviral expressando rtTA é adicionado ao cocktail lentivector durante o passo 4.2. </li><li> No dia seguinte, depois que as células totalmente recuperado da cryopreconservação, substituição de suportes MEF nas três-6 poços com 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) e 1 ml (controlo) de meios de transdução, respectivamente. Descongelar uma alíquota de PLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -ets e vírus -mCherry à temperatura ambiente e adicionar 100 ml de cada sobrenadante contendo vírus (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) no 4F bem. Nota: Em caso de MEFs de tipo selvagem, reduzir o volume dos meios de comunicação preplated por 100 mL e, adicionalmente, adicione 100 ml de vírus FUdeltaGW-rtTA contendo sobrenadante à mistura 4F. </li><li> Adicionar 100 ul de mCherry meio contendo vírus para o bem marcado com mCherry. Adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / mL em cada poço. Colocar o prato de volta na incubadora a 37 ° C e incubar MEFs O / N com o sobrenadante que contém o vírus. Nota: Em caso de MEFs de tipo selvagem, reduzir o volume de meio por 100 ul preplated e, adicionalmente, adicionar 100 ul de FUdeltaGW-rtTA sobrenadante contendo vírus. </li><li> Na manhã seguinte, retire cuidadosamentee meios contendo vírus lavar três vezes com 2 ml de PBS. Finalmente, adicione 2 ml de meio TS (sem FGF4 / heparina). Nota: MEFs transduzidas podem ser utilizadas directamente para ensaios de indução ITSC ou congeladas para utilização posterior. </li></ol> 5. Fibroblasto a conversão ITSC Nota: Todos os passos são realizados no espaço de laboratório licenciado para o Nível de Biossegurança 2. <ol><li> Lavar MEFs transduzidas duas vezes com 2 ml de PBS e após a adição de 0,5 ml de solução de tripsina / EDTA a incubar-los no incubador durante 3-4 min. Verificar sob um microscópio invertido para o desprendimento adequado das células. <ol><li> Inativar a tripsina, adicionando 1 ml de meio TS. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar durante 3 min a 200 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 ml de meio TS. Use a amostra de controlo não transduzidas para contar as células. </li><li> Placa 4F-MEFs, mCherry-MEFs e MEFs controlo não transduzidas cada um a uma densidade de 2 x 10 5células por prato de cultura de células de 100 mm de 10 ml TS meio contendo 2 ug / ml de DOX (TS meio + FGF4 / heparina + DOX). </li><li> Como alternativa, executar transdiferenciação em pratos menores. Placa 3,6 x 10 3 células por cm 2 sobre o tamanho do prato desejado, o volume de escala em conformidade. </li></ol></li><li> No dia seguinte, utilizando um microscópio de epifluorescência (usando uma lente de 10X e um filtro adequado para excitação de fluorescência vermelha) monitorizar a expressão da proteína mCherry, a fim de estimar a eficácia de transdução. Nota: eficiência de transdução deve ser perto de 100%. Se o aumento da morte celular é aparente após a indução do transgene, isto significa que o título do vírus era demasiado elevada. Transdução deverá ser repetido com uma quantidade reduzida de meio contendo vírus. </li><li> De agora em diante media mudança em todos os pratos em dias alternados até o dia 10 após o plaqueamento. Em seguida, alimentar as células com meio sem DOX TS (TS meio + FGF4 / heparina). </li><li> Usando um monitor de microscópio invertidoaparecimento de &#39;transdifferentiated áreas&#39; (consulte a Figura 2B e C) em 4F prato por até 3 semanas. Tais colônias não deve ser visível nos dois pratos de controle (mCherry-MEFs e MEFs não transduzidas). </li></ol> 6. Isolamento de individuais ITSC Lines Nota: Para a etapa 6.3 um capuz de cultura de tecidos não é necessária. Recomenda-se limpar o microscópio invertido com 70% de etanol para minimizar as chances de contaminação bacteriana. colónias ITSC individuais podem ser isolados entre os dias 21 e 28 dias de transdiferenciação. <ol><li> Adicionar 40 ul de solução de tripsina / EDTA a 0,05% em 12 cavidades de uma placa de 96 poços de fundo em U e colocar o prato em gelo. </li><li> Antes de isolamento colónia, médio aspirado em 4F-MEF prato transdiferenciação. Lave as células uma vez com 10 ml de PBS. Mais uma vez, adicione 10 ml PBS e colocar prato sob um microscópio invertido. </li><li> Usando uma pipeta de 100 uL-ajustado para 40 ul elevador colónias individuais, por circling-los com a ponta da pipeta e aspirando a colônia flutuante. Transferir as células de uma colónia em cada um bem do preparado prato de 96 poços. Depois de pegar 12 colónias colocar prato de 96 poços na incubadora a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Separar as células por pipetagem para cima e para baixo várias vezes e suspensão de células de transferência para um poço de um prato de 24 poços com preparados 500 uL de meio TS-CM (30% fresco TS meio + 70% + CM FGF4 / heparina). </li><li> No dia seguinte, substituir o meio com meio TS-CM fresco para remover as células mortas. Mudança de meio todos os outros dias. </li><li> Monitor para o aparecimento de colônias epiteliais com limites claros (veja a Figura 2). Uma vez colônias aparecer, cultura até 70% confluentes ou por até uma semana e expandir gradualmente em pratos maiores. A partir de agora, células de cultura como bona fide TSCs, de acordo com protocolos padrão em meio de soro contendo ou em, meios definidos isentos de soro 3,5,11. </li></ol>

<ol><li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+commun%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538(2014).</li>
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</ol>

The authors have nothing to disclose.

O protocolo de transdiferenciação baseado 4 fator (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) aqui apresentado oferece um método confiável para gerar fielmente convertido iTSCs de fibroblastos de rato embrionárias. Além disso, o método é também aplicável para os fibroblastos da cauda de pós-natal, apesar de com uma queda na eficácia em comparação com os fibroblastos embrionários 3. Em geral, a qualidade de fibroblastos primários é um fator crítico de resultado transdiferenciação e deve ser tomado cuidado...

Recentemente, um estudo comparando várias abordagens de células-tronco embrionárias mouse para Trophoblast conversão de células-tronco revelou que em todos os sistemas analisados, a conversão da linhagem permaneceu incompleto. Em vez de células estaminais induzidas trofoblasto (iTSCs) chamados haste trofoblasto células semelhantes a células foram gerados reter uma memória do destino celular de origem 1. Aqui, seguimos uma abordagem diferente da geração de ITSC. Semelhante à indução directa de células estaminais pluripotentes a partir de fibroblastos embrionários de murídeo (MEFs) 2, iTSCs foram convertidos directamente a partir de tecido somático diferenciada. Em primeiro lugar, foram identificados 12 fatores candidatos indutores TSC destino quando overexpressed em MEFs. Mais tarde, os fatores Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 foram identificados como sendo necessária e suficiente para a indução ITSC 3. Simultaneamente, outro grupo verificou independentemente Tfap2c, GATA3 e Eomes ser suficiente para converter em MEFs iTSCs. No entanto, nesseestudo, o tempo necessário para a expressão do transgene é consideravelmente mais longa em comparação com o nosso estudo, indicando diferentes cinéticas de conversão, quando ETS2 está ausente do cocktail transdiferenciação 4. Soro fetal convencional de bovino (FBS) contendo a cultura de células estaminais trofoblásticas blastocisto derivado induzidas e baseia-se na presença de factores segregados por MEFs inactivado pelo crescimento 5,6. Durante a indução ITSC, esses fatores são fornecidos por MEFs, que não têm a combinação cheia de transgenes e não são submetidos a transdiferenciação. No entanto, uma vez ITSC colónias individuais são sub-cultivadas, que exigem meios de comunicação, o qual foi pré-condicionada por MEFs inactivado pelo crescimento. A partir daí, iTSCs podem ser cultivadas e tratadas como blastocisto TSCs derivado de acordo com protocolos padrão. É de notar, em contraste com Tanaka et al. 5, que rotineiramente cultura CET e gelatinizar iTSCs sem pratos de cultura de células.

<table><tbody><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-10G</td><td>Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>human recombinant Fibroblast Growth Factor 4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 &amp;micro;g/ml stock solution. Store aliquots at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ProFection Mammalian Transfection System</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, no glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgene</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Gata3</td><td>Addgene</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgene</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgene</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm1(rtTA*M2)Jae/J 7&lt;/sup&gt;</td><td>JAX Mice</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>Charles River</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into trophoblast stem cells

células-tronco trofoblasto (CET) surgem como consequência da primeira decisão destino celular no desenvolvimento dos mamíferos. Eles podem ser cultivadas in vitro, conservando a capacidade de auto-renovação e de se diferenciar em todos os subtipos da linhagem trofoblasto, equivalente ao in vivo haste população de células que dá origem à porção fetal da placenta. Portanto, TSCs oferecer um modelo único para estudar o desenvolvimento da placenta e embrionárias contra decisão destino celular extra-embrionário in vitro. Desde a fase de blastocisto em diante, uma barreira epigenética distinto constituído por metilação do DNA e histonas modificações firmemente separa as duas linhagens. Aqui, descrevemos um protocolo para superar totalmente essa barreira linhagem pela transitória sobre-expressão de trofoblastos reguladores chave Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 em fibroblastos embrionárias de ratinho. As células-tronco induzidas trofoblastos são capazes de auto-renovação e são quase idênticas às blastocisto células-tronco trofoblasto derivados in termos de morfologia, expressão do gene marcador e padrão de metilação. Funcional in vitro e em ensaios in vivo confirmam que estas células são capazes de se diferenciar ao longo da linhagem trofoblasto gerar células trofoblásticas gigantes poliplóide e chimerizing a placenta quando injectadas em blastocistos. A indução de células estaminais a partir de tecido somático trofoblasto abre novas vias para estudar as características genéticas e epigenética desta linhagem extra-embrionárias e oferece a possibilidade de gerar linhas de células estaminais trofoblasto sem destruir o respectivo embrião.

No prato onde a expressão do transgene do 4F é activado, as células mudam rapidamente morfologia (comparar a Figura 2A e B). Por volta do dia 14 - 21 transdifferentiated áreas distintas emergem (dois exemplos são apresentados na Figura 2B e C). Estas colónias primárias não possuem morfologia típica TSC; No entanto, uma vez que são sub-cultivadas, a morfologia característica epitelial com bordas apertadas e limites brilhantes altamente reminisc...

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Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.6K visualizações.  Institute of Pathology, University of Bonn Medical School. Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Vídeo: Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources. 
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

The protocol presented in this study describes methods for the real-time monitoring of reprogramming progression via the kinetic measurement of positive and negative pluripotent stem cell markers using flow cytometry analysis. The protocol also includes the imaging-based assessment of morphology, and marker or reporter expression during iPSC generation.

Kinetic Medição e visualização em tempo real de Reprogramação Somatic

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Biologia do Desenvolvimento

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Biologia

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...