Name: protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into trophoblast stem cells
Uploaded: 2016-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells at JoVE.com

Tüm fare deneyleri, hayvan koruma ve yerel kurumsal hayvan bakım komiteleri (Landesamt fuer Natur, Çevre und Verbraucherschutz, Kuzey Ren-Vestfalya [onay kimlik numarası onayı ile anlaşarak Alman hukukuna göre yapılmıştır: 84-02.04.2013 AZ .A428]). 1. Medya Hazırlık <ol><li> Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 (h / h) FBS, L-glutamin (2 mM), sodyum piruvat (1 mM), penisilin / streptomisin (1x): 293T orta hazırlayın. </li><li> DMEM,% 10 (h / h) FBS, L-glutamin (2 mM), 1 x esansiyel olmayan amino asitler, penisilin / streptomisin (1x): MEF orta hazırlayın. </li><li> TS orta hazırlayın (ağırlık / FGF4 / heparin o): Roswell Park Memorial Institute ortamı (RPMI) 1640,% 20 (h / h) FBS (kök hücre kültürü dereceli), penisilin / streptomisin (1x), L-glutamin (2 mM ), sodyum piruvat (1 mM), 2-merkaptoetanol (0.1 mM). </li><li> kök hücre (RPMI 1640,% 20 (h / h) FBS: FGF4 / heparin (TH + F4H) TS orta hazırlayınKültür derecesi), penisilin / streptomisin (1x), L-glutamin (2 mM), sodyum piruvat (1 mM), 2-merkaptoetanol (0.1 mM), 25 ng / ml FGF4 / ml heparin 1 ug. Not: FGF4 ve heparin, doğrudan kullanımdan hemen önce ortama ilave edilir. </li><li> FGF4 / heparin (TS-CM + F4H) TS-CM Hazırlama:% 70, MEF-durumunu TS ortamı +% 30 taze hazırlanmış TS ortamı + 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml heparin. Not: FGF4 ve heparin, doğrudan kullanımdan hemen önce ortama ilave edilir. </li><li> Transfeksiyon ortamı hazırlayın: İleri DMEM,% 2 (v / v) FBS (hücre kültürü dereceli kök), L-glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (1x). </li><li> Virüs üretimi orta hazırlayın: İleri DMEM,% 5 (h / h) FBS (hücre kültürü dereceli kök), L-glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (1x). </li></ol> 2. Fare Embriyonik fibroblast Derivasyon <ol><li> 129S2SV kadın ve homozigot erkek R26 :: rtTA fareler (suşu adı ağırlık kullanarak set zamanlı çiftleşmelerin; B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Ve servikal dislokasyon ile E 13.5 kurban fareler üzerinde standart protokollere 8&#39;e göre birincil fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) izole eder. Bundan sonra, MEF medyada bir 150 mm tabağına bir embriyodan plaka hücreleri. </li><li> Birincil MEF kültürleri 150 mm tabaklar üzerinde konfluense ulaştıktan sonra, 10 mi, PBS ile iki kez yıkama hücreleri ve 4 ml% 0.05 tripsin / EDTA solüsyonu ekleyin. 37 ° C&#39;de inkübatör içinde 4 dakika - 3 yemekler inkübe edin. </li><li> Kuluçka kontrolünden sonra ters bir mikroskop (10X lens kullanarak) ile çanak ayrılmış hücreler eğer. trypsinization durdurmak ve bir 50 ml konik tüp içine hücre süspansiyonu toplamak için MEF medya 5 ml ekleyin. </li><li> Havuz hücre çeşitli yemekler süspansiyon ve 50 ml konik tüp içine toplamak. 200 x g&#39;de 3 dakika 10 ° C santrifüjleyin hücre süspansiyonu. </li><li> % 10 (hac / hac), dimetil sülfoksid ihtiva eden FBS içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücre pelletini atın. Daha fazla kullanım için parçalar halinde MEFS dondurun. Not: Alternatif olarak, yaban TYP kullanınE birincil MEFS; Bununla birlikte, rtTA ifade ek lentiviral vektör (Maherali ve ark., 9 ile tarif FUdeltaGW-rtTA plasmidi kullanılarak, örneğin), diğer lentiviral vektörleri ile birlikte transdüse edilmesi gerekmektedir. </li><li> MEF-klimalı TS ortamı hazırlanması Not: Ön dönüşüm deneyleri, MEF-klimalı (CM) TS medya (bölüm 6&#39;da açıklanan) Bireysel ITSC hatlarının alt kültür için gerekli olan, hazırlıklı olmak vardır. <ol><li> Plaka yemekleri istenilen sayıda MEF ortamda 150 mm çanak başına 1 x 10 7 mitotik inaktive MEFS. 9 Gy dozda γ-ışıması ile MEFS inaktive. Not: 150 mm tabak başına verimi yaklaşık 60 mi CM taşımaktadır. </li><li> kaplama, aspirat gün sonra ve MEF orta atmak ve geri 37 ° C&#39;de inkübatör içine MEFS ve yer yemekleri mitotik inaktive her yemeğin üzerine taze (FGF4 / heparin olmadan) TS orta hazırlanmış 20 ml ekleyin. </li><li> inkübasyondan sonra,mitotik inaktive MEF&#39;ler üç gün TS ortamı, 50 ml konik tüp içinde ortam toplanır. 0.2 um&#39;lik bir filtreden orta filtre edin ve 2.6.4 devam edin. CM bir başka üretim hattının hazırlanması için taze bir TH ortamı 20 ml CM değiştirin. Not: Mitotik inaktive MEF&#39;ler üç kereye kadar CM hazırlanması için de kullanılabilir. </li><li> Kısım -20 ° C&#39;de 50 ml konik tüp ve deposuna süzüldü CM 35 mi kadar gerekli. Çözündükten sonra, en fazla bir ay boyunca 4 ° C &#39;de% 70, TS-CM elde etmek için ve mağaza taze hazırlanmış TH ortamı 15 ml ekleyin. </li></ol></li></ol> 293T Hücreleri 3. lentiviral Vektör Üretimi Not: Tüm adımlar Biyogüvenlik Seviye 2 lisanslı laboratuvar alanı yürütülmektedir. <ol><li> Önceki dönüşüm deneyleri, aşırı ifadesi Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2 ve mCherry bağımlı doksisiklin (DOK) için lentiviral vektörler hazırlamak. Her bir lentivirüs için, ko-transfeksiyonu 293T hücreleri kullanılarakBir ambalaj plazmid ve VSV-G ifade eden zarf plazmid (plazmid bilgi için malzemeler Tablo bakınız) ile birlikte ilgili lentiviral transferi vektör. Not:. Yararlı bilgiler için virüs üretimi Gavrilescu ark 10 bakınız ilgili. o retrovirüs üretimini tarif rağmen, 293T hücreleri ve plazmid DNA kalitesi ile ilgili genel yorumlar da lentivirüs üretimi için doğrudur. DİKKAT: lentiviral vektörler ve iş ile çalışırken uygun güvenlik önlemleri alınması gereken bir Biyogüvenlik Seviye 2 tesislerinde yapılmalıdır. </li><li> Kat poli-L-lisin (100 ug / ml) çözeltisi, 5 ml yemekler kapsayan ve hafifçe eşit kaplama çözeltisi dağıtmak sallayarak çözeltisi ile beş, 100 mm&#39;lik tabaklar. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübatör içinde yemekler yerleştirin. 30 dakika soluklu kaplama çözümden sonra ve bir kez PBS ile bulaşıkları yıkayın. </li><li> 10 ml 293T hücre medya çanak başına plaka 7 x 10 6 293T hücreleri, sWirl yemekler eşit 37 ° C&#39;de geri inkübatör içine hücreleri ve yer yemekleri dağıtmak için. </li><li> Ertesi sabah, transfeksiyon ortamı, 5 ml büyüme ortamı değiştirin. geri 37 ° C&#39;de inkübatör içine klorokin çözeltisi (25 mM) ve yer yemekleri 1,000x stokunun 6 ul ekleyin. </li><li> Bu arada, transfeksiyon karışımı hazırlandı: <ol><li> Her lentiviral vektör için iki 5 ml reaksiyon tüpleri hazırlayın, A ve B etiketli </li><li> 2x HEPES Ekle 600 ul tüp A. tuz (HBS) tamponlu </li><li> 18.5 mikrogram Lentivector DNA ve 9,25 mg psPAX2 ve pMD2.G. ve 9.25 mikrogram ile tüp B karışımı 61.5 ul CaCl2 çözeltisi (2 M), Steril kültür notu H 2 O ile 600 ul ses seviyesini ayarlamak </li><li> vorteks ederken tüp B damla bilge tüp A dan çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika için transfeksiyon karışımı inkübe edin. </li></ol></li><li> çok dikkatli transfeksiyon karışımı ekleyin 100 mm çanak hazırlanan 293T hücrelere damla damla. bir6 saat için fter 5 orta kaldırmak ve virüs üretim ortamının 10 ml ile değiştirin. 37 ° C&#39;de geri kuvöz içine yemekleri yerleştirin. Not: kaldırma ve 293T hücreleri kolayca çanak ayırmak beri orta değiştirirken dikkatli olun. klorokin uzun süreli maruz kalma hücrelerine toksik olduğu Orta değişiklik transfeksiyon sonra 5-6 saat çok önemlidir. </li><li> Ertesi sabah, dikkatli bir şekilde çıkarın ve orta atmak ve virüs üretim ortamının 7 ml ile değiştirin. </li><li> Ertesi sabah, virüs ihtiva eden ortam ilk parti hasat edilir. Aspire 15 ml konik tüp içinde orta ve toplamak. Yine, hücreler üzerine virüs üretim ortamının 7 ilave edin. İkinci parti ertesi gün hasat edilene kadar mağaza buzdolabında orta virüs içeren. </li><li> Ertesi sabah 15 ml ilk parti ihtiva eden konik bir tüp ekleyerek virüs içeren ortam ikinci parti aspire. 293T hücreleri artık atılabilir. Filtre 0.45 um sur yoluyla orta virüs içerenfactant içermeyen selüloz asetat -Membran filtresi. Alikot filtre, virüs ihtiva eden daha başka kullanım için 80 ° C &#39;de orta ve depolar. Not: Virüs üretimi de 6 oyuklu tabaklarda gerçekleştirilebilir. buna göre hacimleri ve hücre sayıları küçültün. </li></ol> 4. Fibroblast İletimi 4 Faktörler ve mCherry Kontrol Vektör Not: Tüm adımlar, Biyolojik Güvenlik Seviye 2 tesiste gerçekleştirilmektedir. <ol><li> Deneysel anahat şematik bir temsili. Şekil 1&#39;e bakın primer rtTA-MEF&#39;ler bir kısım Çözülme ve MEF ortam 2 ml toplam hacim içinde 6 oyuklu çanak oyuk başına 3.33 x 10 5 hücre plaka. en az 3 kuyu hazırlayın ve 4 faktör (4F) mCherry ve kontrol, onları etiketlemek. Not: rtTA ifade lentiviral vektör Aşama 4.2 sırasında Lentivector kokteyline ilave edilir Alternatif olarak, vahşi tip MEF&#39;ler kullanılabilir. </li><li> hücreler takip eden günlük tam cryopre eldeservation sırasıyla İletimi ortamı, 0.6 ml (4F), 0.9 mi (MCherry) ve 1 ml (kontrol) ile üç 6-Wells MEF ortamı değiştirin. Oda sıcaklığında PLV-teto-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, ets ve -mCherry virüsünün tek bir kısım Çözülme ve de 4F her bir virüs içeren süpernatan 100 ul (Tfap2c, Gata3, Eomes ETS2) ekleyin. Not: vahşi tip MEF&#39;ler durumunda, 100 ul preplated ortamın hacmini azaltmak ve buna ek olarak 4F karışımı içeren süpernatant FUdeltaGW-rtTA virüsünün 100 ul ilave edin. </li><li> de mCherry ile etiketlenmiş için MCherry virüs içeren ortam 100 ul ekle. her kuyuya 8 ug / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar polibren ekleyin. 37 ° C&#39;de inkübatör içinde çanak yerleştirin ve virüs içeren süpernatan ile MEF&#39;ler O / N inkübe edin. Not: vahşi tip MEF&#39;ler durumunda, 100 ul preplated ortamın hacmini azaltmak ve buna ek olarak FUdeltaGW-rtTA virüs içeren süpernatan 100 ul ilave edin. </li><li> Ertesi sabah, dikkatlice çıkarınvirüs içeren ortam ve 2 ml PBS ile üç kez yıkanır. Son olarak, (FGF4 / heparin olmadan) TS medya 2 ml ekleyin. Not: kalıt aktarımlı MEF&#39;ler doğrudan ITSC İndüksiyon deneyleri için kullanılan ya da daha fazla kullanım için dondurulabilir. </li></ol> 5. Fibroblast ITSC Dönüştürme Not: Tüm adımlar Biyogüvenlik Seviye 2 lisanslı laboratuvar alanı yürütülmektedir. <ol><li> 4 dakika - 2 mi, PBS ile ve 0.5 ml tripsin / EDTA solüsyonu 3 inkübatörde inkübe ekledikten sonra iki kez kalıt MEFS yıkayın. hücrelerin düzgün ayrılması için bir ters mikroskop altında bakın. <ol><li> 1 ml TS orta ekleyerek tripsin inaktive. 200 x g&#39;de 3 dakika boyunca 15 ml konik bir tüp ve santrifüj içine hücre süspansiyonu aktarın. Süpernatantı atın ve 2 ml TS ortamda hücrelerin tekrar süspansiyon. hücreleri saymak için untransduced kontrol örneği kullanın. </li><li> Levha 4F-MEF&#39;ler, MCherry-MEF&#39;ler ve 2 x 10 5 yoğunluğunda untransduced kontrol MEF&#39;ler her10 mi TS 100 mm hücre kültür çanağı başına hücre ortamı 2 ug / ml Dox (TS ortamı + FGF4 / heparin + DOX) ihtiva etmektedir. </li><li> Alternatif olarak, küçük yemekler transdiferansiyonun gerçekleştirin. Buna göre istenilen çanak boyutu, ölçek hacmine cm2 başına 3.6 x 10 3 hücre Plate. </li></ol></li><li> Sonraki gün, transdüksiyon verimliliği hesaplamak için MCherry proteininin ifadesini izlemek (10X objektif ve kırmızı floresans uyarma için uygun olan bir filtre kullanılarak) Epifloresans mikroskop kullanılarak. Not: İletimi verimliliği% 100&#39;e yakın olmalıdır. artan hücre ölümü transgen indüksiyondan sonra belirgin ise, bu virüs titresi çok yüksek olduğu anlamına gelir. Transdüksiyon, virüs ihtiva eden ortam daha düşük bir miktarı ile tekrar edilmelidir. </li><li> Şimdi değişim medya andan itibaren tüm yemekleri kaplama gün sonra 10 kadar her gün üzerinde. Bundan sonra, Dox (TS ortamı + FGF4 / heparin olmadan) TS ortam hücreleri beslenir. </li><li> ters bir mikroskop monitör için kullanılmasıgörünümü kadar 3 hafta boyunca 4F çanak (Şekil 2B ve C bakın) &#39;alanlar transdiferansiye&#39;. Bu tür koloniler iki kontrol yemekleri (mCherry MEFS ve untransduced MEFS) görünür olmamalıdır. </li></ol> Bireysel ITSC Hatları 6. İzolasyonu Not: Aşama 6.3 için bir doku kültürü kapağı gerekli değildir. Bakteriyel kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için% 70 etanol ile inverted mikroskop aşağı silinmesi tavsiye edilir. Bireysel ITSC kolonileri gün 21 ve transdiferansiyonun 28 gün arasında izole edilebilir. <ol><li> 96 U-alt sıra çanak 12 kuyu içine% 0.05 tripsin / EDTA solüsyonu 40 ul ekle ve buz üzerinde çanak yerleştirin. </li><li> koloni izolasyonu, 4F-MEF transdiferansiasyon çanak aspire orta önce. 10 ml PBS ile bir kez hücreler yıkanır. Yine, ters bir mikroskop altında 10 ml PBS ekleyin ve yer çanak. </li><li> c, ayrı ayrı koloniler 40 ul ayarlanmış bir 100 ul pipet asansör kullanarakpipet ile onları ircling ve kayan koloni aspire. bir koloni devri hücreleri hazırlanan 96-iyi çanak bir kuyunun içine her. emilmesinden sonra 12 koloniler 5 dakika için 37 ° C inkübatörde 96 gözlü tabak yerleştirin. </li><li> TS-CM ortamı (% 30 taze TS ortamı +% 70 CM + FGF4 / heparin) hazırlanmış 500 ul ile 24-iyi çanak bir kuyuya birkaç kez ve transfer hücre süspansiyonu aşağı yukarı pipetleme hücreleri ayırmak. </li><li> Ertesi gün, ölü hücrelerin çıkarılması için yeni TS-CM ortamı ile orta yerine. her gün orta değiştirin. </li><li> Parlak sınırları ile epitel kolonilerin görünümü için Monitör (Şekil 2&#39;ye bakınız). koloniler görünür sonra, kültür% 70 konfluent kadar veya en fazla bir hafta ve yavaş yavaş daha yemekler genişletmek. Bundan sonra, serum içeren ortamda veya serumsuz tanımlanmış ortam 3,5,11 standart protokollere göre niyetli TSCs gibi kültür hücreleri. </li></ol>

<ol>
	<li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast.">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts.">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li><li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells.">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li><li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta/activin.">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li><li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues.">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells.">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550 (2007).</li><li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions.">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada sunulan 4 faktörü (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) esaslı transdiferansiasyon protokolü sadakatle oluşturmak fare embriyonik fibroblastlar gelen iTSCs dönüştürülmüş güvenilir bir yöntem sunmaktadır. Dahası, yöntem olmasına rağmen embriyonik fibroblastlar 3 ile karşılaştırıldığında verimlilik bir damla ile, aynı zamanda doğum sonrası kuyruk fibroblastlar için geçerlidir. Genel olarak, birincil fibroblast kaliteli transdiferansiasyon sonuçları ve bakım kritik bir faktör er...

Son zamanlarda, kök hücreler dönüşüm trofoblast fare embriyonik kök hücre çeşitli yaklaşımlar karşılaştıran bir çalışma, tüm analiz sistemleri, soy dönüşüm eksik kaldığını ortaya koymuştur. Bunun yerine bu yüzden trofoblast kök denilen uyarılmış trofoblast kök hücreler (iTSCs) hücre benzeri hücreler kökenli 1 hücre kaderi bir hafıza istinat oluşturulmuştur. Burada, ITSC nesil farklı bir yaklaşım izledi. Fare embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) 2 pluripotent kök hücrelerin doğrudan indüklenmesi benzer şekilde, iTSCs doğrudan farklılaşmış somatik dokudan dönüştürüldü. İlk olarak, biz MEFS aşırı eksprese zaman TSC kaderi uyaran 12 aday faktörleri belirledi. Daha sonra, faktör Tfap2c, Gata3, Eomes ve ETS2 ITSC indüksiyonu 3 için gerekli ve yeterli olduğu tespit edilmiştir. Eş zamanlı olarak, başka bir grubu, bağımsız olarak iTSCs halinde MEFS dönüştürmek için yeterli olması Tfap2c, Gata3 ve Eomes bulundu. Bununla birlikte, buÇalışma, transgen ekspresyonu için gereken zamanın büyük ölçüde daha uzun ETS2 transdiferansiasyon kokteyl 4&#39;ten olmadığı zaman, farklı dönüşüm kinetik gösteren, çalışmamızda karşılaştırılır. Uyarılmış ve blastosist türetilmiş trofoblast kök hücre kültürü içeren geleneksel fetal sığır serumu (FBS), büyüme inaktive MEF&#39;ler 5,6 salgılanan faktörler varlığında dayanır. ITSC ​​İndüksiyon sırasında, bu faktörler transgenlerin tam kombinasyon yoktur ve transdiferansiyonun geçiren değildir MEF&#39;ler, tarafından sağlanır. Ancak, bir kez bireysel ITSC kolonileri onlar büyüme inaktive MEFS tarafından öngörülmekte olan medya, gerek alt kültür. Orada kaynaktan, iTSCs kültürlenmiş ve standart protokollere göre blastosist türetilmiş TSCs gibi tedavi olabilir. Not, hücre kültürü yemekleri jelatinleştirmeden olmadan Tanaka et al. 5, rutin kültür TSCs ve iTSCs aksine.

<table><tbody><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-10G</td><td>Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chloroquine diphosphate salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>human recombinant Fibroblast Growth Factor 4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 &amp;micro;g/ml stock solution. Store aliquots at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ProFection Mammalian Transfection System</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, no glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgene</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Gata3</td><td>Addgene</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgene</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgene</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm1(rtTA*M2)Jae/J 7&lt;/sup&gt;</td><td>JAX Mice</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>Charles River</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into trophoblast stem cells

Trofoblast kök hücreleri (TSCs) memeli gelişiminin ilk hücre kaderi karar bir sonucu olarak ortaya çıkar. Onlar kendini yenilemek ve plasentanın fetal kısmına hücre popülasyonu veren yükselişi kök vivo eşdeğer trofoblast soy tüm alt içine ayırt etmek yeteneğini koruyarak, in vitro kültüre edilebilir. Bu nedenle, TSCs in vitro ekstra embriyonik hücre kaderi kararı karşısında plasental gelişim ve embriyonik incelemek için eşsiz bir model sunuyoruz. itibaren blastosist aşamasına gelen DNA metilasyonu ve histon modifikasyonları oluşan ayrı bir epigenetik bariyer sıkıca her iki soy ayırır. Burada, tam aşırı ifadesi fare embriyonik fibroblastlar trofoblast anahtar düzenleyiciler Tfap2c, Gata3, Eomes ve ETS2 ve geçici bu soy engeli aşmak için bir protokol açıklar. uyarılmış trofoblast kök hücreler kendini yenilemek mümkün ve türetilmiş trofoblast kök hücreleri blastokist hemen hemen aynıdır imorfoloji, işaretleyici gen ifadesi ve metilasyon motifinin n terimleri. In vitro ve in vivo deneylerde Fonksiyonel bu hücrelerin trofoblast soy polyploid trofoblast dev hücrelerin üretilmesi ve blastosist enjekte edildiğinde plasentayı kimerize boyunca ayırt etmek mümkün olduğunu onaylayın. somatik doku trofoblast kök hücrelerin uyarılması, bu ekstra-embriyonik soyunun genetik ve epigenetik özelliklerini incelemek için yeni yollar açar ve ilgili embriyo zarar vermeden trofoblast kök hücre hatları üretme imkanı sunuyor.

4F transgen ifadesi aktive çanak, hücreler hızla morfolojisi (Şekil 2A ve B karşılaştırın) değiştirin. Gün etrafında 14-21 farklı transdiferensiye alanlar (iki örnek Şekil 2B ve C olarak verilmiştir) ortaya çıkar. Bu birincil koloniler tipik TSC morfolojisi eksikliği; ancak onlar sıkı kenarları ve iyi niyetli bir TSCs son derece anımsatan parlak sınırları ile alt-kültür, karakteristik epitel morfoloji ortaya (Şekil 2...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells at JoVE.com

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

protocol-for-direct-conversion-murine-embryonic-fibroblasts-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.6K Görüntüleme.  Institute of Pathology, University of Bonn Medical School. Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Video: Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources. 
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

The protocol presented in this study describes methods for the real-time monitoring of reprogramming progression via the kinetic measurement of positive and negative pluripotent stem cell markers using flow cytometry analysis. The protocol also includes the imaging-based assessment of morphology, and marker or reporter expression during iPSC generation.

Somatik yeniden programlanması Kinetik Ölçümü ve Gerçek Zamanlı Görselleştirme

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Gelişim Biyolojisi

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Biyoloji

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...