We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Methoden, die hier vorliegenden jüngsten Bemühungen beschriebenen Grund Mitosespindeln in Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen zu rekonstituieren. Studieren Spindelanordnung innerhalb geometrischen Grenzen bietet zahlreiche Vorteile. Wichtige Feedback-Mechanismen existieren zwischen Mikrotubuli der mitotischen Spindel und die geometrischen Zwänge, in denen sie zusammengesetzt sind. Mikrotubuli erzeugen können Kräfte drängen, wenn sie in geometrische Grenzen wachsen, die in mitotischen Spindel Verschiebung zur Folge haben kann. Darüber hinaus kann in eine physikalische Barriere wachsenden Mikrotubuli Katastrophen induzieren. Auch Spindelanordnung innerhalb eines begrenzten Geometrie kann zu einer allmählichen Erschöpfung der einzelnen Komponenten führen, wie Tubulin, die wiederum direkt die Rate Mikrotubuli Wachstum beeinflußt 36. Dies sind alles wesentliche Determinanten der Spindelanordnung, die untersucht werden können unter Verwendung der Assays hier beschrieben. Die beschriebenen Assays sind sehr empfindlich gegenüber kleinen Konzentration differences der Tröpfchen Komponenten. Dies ist der Fall für Tubulin, wo kleinere Konzentrationsunterschiede in entweder zu langsam oder zu schnelle Mikrotubuli Wachstum führen kann. In diesem Fall kann die Mikrotubuli Wachstumsraten oft noch durch Einstellen der Temperatur während der ~ 30 min des Versuchs zuerst korrigiert werden. Mitotischen Spindelanordnung und Positionierung ist auch sehr empfindlich gegenüber Variationen in der Konzentration von (cortical) Kraftgeneratoren. Dies ist wahrscheinlich auf die Konzentration, Reinheit und Aktivität der gereinigten Komponenten abhängt und für jede neu gereinigte Protein sorgfältig titriert werden muss. Darüber hinaus haben bestimmte Kompromisse in Abbildungseinstellungen vorgenommen werden, abhängig von der Natur des Assays. Zu Beginn ein hohes Maß an löslichen fluoreszierenden Tubulindimeren machen es schwierig, zu Bild einzelnen Mikrotubuli. Wie Mikrotubuli länger werden und lösliche Tubulin wird langsam aufgebraucht, wird das Signal-zu-Rausch-Verhältnis allmählich höher und erlaubt die Abbildung von individual Mikrotubuli. Im Gegensatz zu den Setups mit offenen Systemen verhindert die geometrische Confinement den Austausch von fluoreszierenden Molekülen und Sauerstofffänger Systemkomponenten innerhalb eines Bulk-Reservoir, in signifikanten Bleichen führt. Insbesondere zur Überwachung Spindelanordnung und Positionierung im Laufe der Zeit ist es dem Bild erforderlich mit niedriger Lichtintensitäten, selbst in Gegenwart eines starken Sauerstoff-Scavenger-System. Diese Verfahren ermöglichen die Bottom-up - Rekonstitution von vereinfachten spindelartigen Strukturen in vitro. Zusätzlich zu den Komponenten hier eingeführt sind viele andere Faktoren beschrieben worden bipolar Spindelbildung zu beeinflussen, Positionierung, Ausrichtung, Formen etc. 3. Dieses System kann weiter die einzelnen und kombinierten Effekte von zusätzlichen Kraftgeneratoren zu studieren erweitert werden. Wichtige Beiträge zur Spindelbildung, die derzeit von diesem System nicht vorhanden sind, sind die mitotischen Chromosomen. Mitotische Chromatin hat sich gezeigt,direkte Spindelbildung durch (1) chromokinesins , die so genannte 3 &#39;polar-Ausstoßkräfte erzeugen kann, (2) die Bildung eines RanGTP Gradienten durch die Chromatin-gebundenen RanGEF RCC1 38, (3) Kinetochore , die mit interagieren können (Depolymerisation Mikrotubuli) 39 und (4) das Chromatin selbst, die als eine mechanische Feder in-zwischen gegenüberliegenden Mikrotubuli 40 funktionieren kann. Schließlich bietet das beschriebene System noch begrenzte zeitliche und räumliche Kontrolle der Aktivität und Lokalisierung von eingeführten Kraftgeneratoren. In Zellen lokalisieren viele Spindelanordnung Faktoren an bestimmte Kompartimente oder aktiv sind innerhalb eines begrenzten Zeitfensters. Ein eindrucksvolles Beispiel ist die Aktivität von Dynein, die speziell an der hinteren Seite des C angereichert ist elegans ein Zellstadium Embryo asymmetrische Spindelpositionierung und die Zellteilung zu fördern. In diesem System untersuchen wir derzeit die Möglichkeit einer solchen nachahmt temporal und asymmetrische Aktivität unter Verwendung von Methoden aus der optogenetischen Techniken entlehnt. Darüber hinaus, wie es der Fall für die C. elegans Embryo und Zellen mit einer starren Zellwand, viele Zellen abrunden nicht in der Mitose. Die Form der geometrischen Haft wird einen grundlegenden Einfluss auf die Kräfte haben auf die Spindel wirkende 41. Es ist daher wichtig, Spindelanordnung und die Positionierung in nicht-kugelförmige Tröpfchen als auch zur Rekonstitution, potenziell komplexer mikrofluidischer Systeme , die ermöglichen die Gestaltung und Speicherung von Emulsionströpfchen 42,43. Schließlich in Geweben, Zell-Zell- und Zell-Substrat-Signalisierungs- und Befestigungs externe Signale liefern, die in gerichtete Spindelorientierung übersetzt werden kann, wie es oft in Epithelzellen und Stammzellen beobachtet wird. Alle diese speziellen Aspekte haben in dieser aktuellen Studie berücksichtigt und könnten die Herausforderungen der Zukunft bieten zu bauen in Richtung mehr in vivo -ähnlichen Rekonstitutionen der mitotischen Spindel assemb nichtly und Positionierung.

Während der Mitose werden die Chromosomen des Genoms replizierten an der Zell Äquators organisiert gleichmäßige Verteilung der Schwesterchromatiden über den neu gebildeten Tochterzellen gewährleisten. Chromosome Positionierung und Segregation wird vermittelt durch ihre Bindung an Mikrotubuli Spindel aus zwei gegenüberliegenden Zentrosomen stammen. Neben treuen Chromosomenverteilung zu gewährleisten, bestimmt die Orientierung der mitotischen Spindel auch die Zellteilungsebene 1. Koordinierte Ausrichtung der Zellteilung ist während vieler Stadien der Entwicklung und für Gewebshomöostase 2 wesentlich. Insbesondere kann geregelt mitotischen Spindelpositionierung in der asymmetrischen Verteilung von zellulären Inhalte führen oder sogar Tochterzellen unterschiedlicher Größe 2 produzieren. Mitotischen Spindelanordnung und Orientierung beginnt in Prophase und wird durch ein komplexes Zusammenspiel orchestriert zwischen kooperierenden und Antagonisierung Kraftgeneratoren 3,4. Die erzeugten Kräfte bestehen aus both Zug- und Druckkräfte. Diese Kräfte entstehen sowohl aus Spindel Kontakte mit der Zelle Kortex sowie aus der Spindel, und kann durch die Dynamik der Mikrotubuli sowie von molekularen Motoren und Vernetzern (Figur 1) erzeugt werden. Schubkräfte erzeugt werden, wenn die Mikrotubuli wachsen gegen starre Strukturen wie die Zelle cortex. In Abhängigkeit von der Gesamtwiderstandskraft innerhalb des Systems erzeugt wird , kann dies zur Folge haben in Neupositionierung der mitotischen Spindel (geringe Kräfte) oder Mikrotubuli Knicken oder Katastrophe (hohe Kräfte) 5-8 auszulösen. Die Menge an Kraft , die durch Druck hängt von Mikrotubuli Länge erzeugt werden kann, da Länge eine starke Determinante von 9 Mikrotubuli-Knicken. Darüber hinaus kann die Mikrotubuli , die von einem Zentrosomen stammen schieben gegen den anderen Zentrosomen, einen Mechanismus, der Prophase in frühen Zentrosomen Separation zum Antrieb 3,10 wurde vorgeschlagen. In der Werbungdition Kräften , die durch wachsende Mikrotubuli Mikrotubuli - Enden in Kontakt der Zelle Kortex schieben vermitteln kann auch Kräfte 11 ziehen. Untersuchungen von mehreren Laboratorien haben gezeigt , daß die gesteuerte Aktivität von kortikalen Kraftgeneratoren für die asymmetrische Positionierung der mitotischen Spindeln in vivo 1 erforderlich ist. Wesentlich für diese Zugkräfte ist Cortex-lokalisierte zytoplasmatischen Dynein (im Folgenden als &quot;Dynein&quot; genannt), ein Minus-Ende gerichtet Mikrotubuli Motorprotein 8,12,13. Zum Beispiel, Hefe, lateralen Wechselwirkungen der kortikalen dynein mit dem Mikrotubuli - Gitter Ergebnis in motorabhängigen Mikrotubuli entlang der Hirnrinde gleitenden 14 in Knospung. Jedoch kann kortikalen Zugkräfte auch durch die Fähigkeit der Dynein erzeugt werden 8 end-on Anlagen Depolymerisation von Mikrotubuli zu bilden. Die Energie , die von Mikrotubuli Schrumpfung erzeugt wird, kann zu Kräften führen, die im Allgemeinen eine Größenordnung höher (~ 50 pN sind (Referenz 15 </sup&gt;)) als die Kräfte , die von einzelnen Motorproteine ​​(~ 7-8 pN (ref erzeugt. 16)). End-on Befestigung der kortikalen dynein zu Depolymerisation von Mikrotubuli fördert Spindelpositionierung in Bäckerhefe 17 und C. elegans 13. Ob beide motorabhängigen Schiebe- und Mikrotubuli Depolymerisation angetrieben kortikalen Zugkräften zusammenarbeiten können oder sich gegenseitig aus in vivo ist derzeit nicht bekannt. Zusätzlich zu Mikrotubuli Schubkräfte und Dynein-vermittelte kortikalen Zugkräften wird Zentrosom Positionierung innerhalb der mitotischen Spindel durch zahlreiche andere Proteine ​​gesteuert. Kinesin-5 - Motoren, beispielsweise existieren , wie Tetramere , die antiparallele Mikrotubuli interpolaren vernetzen kann, was in der Erzeugung von nach außen gleitenden Kräfte 18-20. Mitglieder der Kinesin-Motor 5 - Familie sind für Zentrosomen Separation und bipolar Spindelanordnung in allen Eukaryonten erforderlichen sucht, mit der Ausnahme von C. elegans<html> (Übersicht in Bezug 21). Darüber hinaus diffusionsfähige Vernetzer der ASE1 / PRC1 Familie werden auch überlappende Mikrotubuli Regionen von interpolaren Mikrotubuli in vivo zu lokalisieren bekannt und in - vitro - 22-27. Die Kräfte , die durch ASE1 getriebene Expansion des überlappenden Mikrotubuli-Region sind groß genug , Kinesin-14 vermittelte Schiebekräfte in vitro 28,29 entgegenzuwirken. In den Zellen wird ASE1 / PRC1 für stabile Bildung erforderlich Mikrotubuli Regionen in der Spindel Mittelbereich überlappender 25-27,30, was darauf hindeutet , dass die durch diffusionsfähige Vernetzer erzeugten Kräfte wesentlich zur Spindel Organisation beitragen können. Schließlich Kräfte aus der mitotischen Chromatin und Kinetochore beeinflussen mitotischen Spindelanordnung und Positionierung durch verschiedene Wege 3. Da diese Komponenten hier nicht Teil der Rekonstitution Assays beschrieben sind, werden sie nicht im Detail diskutiert werden. jove_content &quot;&gt; Verschiedene Theorien existieren, wie die verschiedenen molekularen Komponenten und Kräfte über kooperieren in Spindelanordnung und Positionierung beschrieben, aber wir sind noch weit von einem quantitativen Verständnis. Neben Experimente in lebenden Zellen, in vitro - Experimenten mit gereinigten Komponenten bieten eine leistungsfähige Route zu helfen , dieses Ziel zu erreichen. Hier haben wir eine visuelle Anleitung zu einer angepassten und erweiterten Version der kürzlich veröffentlichten Methoden (Roth et al. 31) präsentiert, in denen Grund Spindeln in Wasser-in-Öl - Emulsionströpfchen wiederhergestellt werden, beginnend mit einem minimale Anzahl von Komponenten. Verwendung von Mikrofluidik-Techniken werden kugelförmige Tröpfchen mit einer Größe erzeugt, die zu mitotischen Zellen vergleichbar sind. Innerhalb dieser Tröpfchen kann gereinigte Zentrosomen und Tubulin, um Wechselwirkungen zu studieren aster Dynamik der Mikrotubuli kombiniert werden, Krafterzeugung und aster-aster. Durch Einführung von kortikalen (wie dynein) und interpolaren (wie Kinesin-5 / ASE1) Kraft-Generatoren, wirrekonstituieren immer komplexer spindelartige Strukturen, die die in vivo Situation ähnlich starten.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Preparation of microfluidic chips&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Photomask on film substrate)</td><td>Selba S.A. Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &amp;lt;1-0-0&gt;10-20 &amp;Omega;-cm, 500-550 &amp;mu;m, SSP, with 2 flats)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater&amp;nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Corona treater</td><td>Electro-technic products</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Microfluidic setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum chamber</td><td>Kartell</td><td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm, thickness 1.5</td></tr><tr><td>Glass-slides</td><td></td><td></td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Puncher</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory sealing film</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td><td></td><td></td><td>Home made</td></tr><tr><td>Brightfield Microscope</td><td>Leica</td><td>PMIRB&amp;nbsp;</td><td>Any inverted brightfield would suffice</td></tr><tr><td>Pressure controler</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tubing</td><td>Cluzeau Info. Labo, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td><td>VWR, The Netherlands</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Reconstituting spindle formation and positioning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-dithioltheitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosine-&#039;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&amp;kappa;-casein (&amp;kappa;-casein from bovine serum milk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. Introducing spindle-assembly factors&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosine-&#039;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &amp;ge;97% (enzymatic))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

Die Verfahren, dargestellt in den vorhergehenden Abschnitten ermöglichen die Wiederherstellung der spindelartige Strukturen mit zunehmender Komplexität der geometrischen Einschluss von Wasser-in-Öl-Emulsionströpfchen verwendet wird. Dieser Abschnitt beschreibt repräsentative Ergebnisse, die qualitativ die Fähigkeit dieser Assays demonstrieren. Während der Mitose, wenn die bipolare Spindel montiert ist, Rundzellen up Kugeln zu bilden mit einem Durchmesser von etwa 15 um, wie für menschliche Zellen gemessen. Diese Eigenschaft mitotischen Zellform stellt eine geometrische Grenze , die beide einengt und Spindel Größe und Ausrichtung 35,36 lenkt. Mikrofluidik - Techniken bieten ein Maß an geometrische Begrenzung, die die Situation in lebenden Zellen beobachtet genau gleicht und daher erlaubt die Bottom-up - Rekonstruktion von Mitosespindeln in vitro. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Microtubule Astern sind für sich bereits in der Lage komplexe Verhalten, wenn Mikrotubuli Wachstum von geometrischen Grenzen eingeschränkt ist. Als Mikrotubuli wachsen, drängen durch den Einbau von neuen Tubulindimeren erzeugten Kräfte treiben die beiden Zentrosomen zu den Seiten der Emulsionströpfchen entgegenwirkt. Zunächst diffundieren Zentrosomen frei innerhalb des begrenzten Volumens (4a, linke Tafel). Nach ca. 20-30 Minuten werden die ersten Mikrotubuli sichtbar und Zentrosom Diffusion eingeschränkt wird als Mikrotubuli gegen die Rinde in alle Richtungen wachsen. Astern mit Mikrotubuli von mittlerer Länge (etwa 50% des Tropfendurchmesser) kann (sterisch) abstoßen anderen, mit Mikrotubuli gegeneinander schieben, die anderen Zentrosomen und die Rinde. Dies führt zu einem typischen &quot;bipolar&quot; spindelartige Anordnung mit den beiden Zentrosomen einander (4a, Mitte) entgegenwirkt . Wenn Mikrotubuli wachsen mehr als ~ 50% des tröpfchen diaMeter, erhalten die Zentrosomen geschoben weiter an gegenüberliegenden Grenzen des Tropfens, mit Mikrotubuli entlang der Tröpfchen Cortex (4a, rechts) wächst. Es ist wichtig, sowohl zu beachten, dass in diesen Tests Mikrotubuli Wachstumsraten sind sehr empfindlich auf Temperatur und Tubulin-Konzentrationen. Diese Parameter werden daher dringend die Zeit beeinflussen, wenn die Keimbildung wird zunächst beobachtet und wenn stationären Zustand aster Positionen erreicht werden. In Zellen, kortikalen Zugkräfte durch die Bildung von tragenden Befestigungen zwischen Mikrotubuli Plus-Enden und Cortex-assoziiertes dynein erzeugt. In tierischen Zellen, hängt diese Assoziation auf der Gai / LGN / NuMA - Komplex, der an die Plasmamembran über N-terminale Myristoylierung von G☐i - 1 ausgerichtet ist. In diesen Rekonstitution Assays wird die Anforderung des Gai / LGN / NuMA-Komplex durch direkte Kopplung Dynein an biotinylierte Lipide umgangen durch dieBildung von Biotin-Streptavidin-Biotin-Komplexe. Diese Anleihen sind relativ stabil (K D ~ 10 -14 M) 37 und bilden schnell ( in der Regel innerhalb von 10 Minuten nach der Emulsionstropfenbildung, vor Mikrotubuli Nukleation wird deutlich) (Abbildung 4b). In Gegenwart von kortikalen dynein behalten Zentrosomen typischerweise eine zentralere Position, wohingegen in der Abwesenheit von Dynein, Zentrosomen zu gegenüberliegenden Seiten des Tröpfchens cortex (Abbildung 4c) gedrückt werden. Wir folgern dies das Ergebnis von zwei Effekten ist, die verhindern und Mikrotubuli Schubkräfte entgegenzuwirken. (1) Dynein fördert direkt Mikrotubuli Katastrophen, wodurch Mikrotubuli Länge zu beschränken und übermäßige Mikrotubuli Knicken zu verhindern, und (2) kortikalen Zugkräfte führen zu Netto-Zentrieren Kräfte auf die einzelnen Astern 8, der die aster-aster Abstoßungskräfte entgegenzuwirken. Das diffusionsfähige Vernetzer ASE1 f induziertorces, die die überlappenden Bereich von anti-parallel Mikrotubuli 29 tendenziell zunehmen. In Übereinstimmung damit, in Gegenwart von ASE1 (und in Abwesenheit von Dynein) Zentrosomen nahe beieinander gefunden mit ASE1 lokalisierende interpolaren Mikrotubuli (4d) zu gebündelt. Die Mitglieder des Kinesin-5-Familie fahren Zentrosom Trennung durch Kräfte aus der Spindel (siehe Einleitung) Bereitstellung schieben. In Gegenwart von Cut7 (der S. pombe Kinesin-5 Ortholog), Zentrosomen sind an gegenüberliegenden Seiten der Emulsionströpfchen geschoben, auch in Gegenwart von ASE1 (Figur 4e). Durch die Kombination von kortikalen und interpolare Kraftgeneratoren kann der Grad der Komplexität weiter erhöht werden, in diesen Experimenten, was schließlich zu einem umfassenden Verständnis der bipolaren mitotischen Spindelanordnung führt. Eine detaillierte quantitative Beschreibung dieser Ergebnisse werden in der Zukunft (Roth et al., Manuskript in Vorbereitung) zur Verfügung stehen. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Neben der Position der Zentrosomen zu festen Zeitpunkten zu beobachten und ihr Verhalten in Bezug auf die beobachteten Längen der Mikrotubuli, wertvolle Informationen können im Anschluss an die Positionierung über erhalten werden Zeit. Durch die Reduzierung Belichtungszeiten und Laserintensitäten, ist es nun möglich aster Positionierung in 2 min Intervallen für mindestens 1 Stunde mit nur ~ 30% Bleichen folgen. Dies ermöglicht die Überwachung von aster Montage und Positionierung von frei diffundierenden Zentrosomen (0 min.) Über die zentrale (12 min.) Zu dezentralen Astern (36 min und weiter) (Abbildung 5c). Dies erleichtert die Studie sowohl stationäre Verhalten und Spindelanordnung Kinetik. Durch Tröpfchen mit verschiedenen Inhalten in der gleichen Probe kombiniert, ist es zum Beispiel möglich , Zentrosomen Positionierung und Spindelanordnung kinetics in Tröpfchen direkt mit und ohne kortikalen Krafterzeuger (Abbildung 5b) vergleichen. Abbildung 1: Kräfte , die auf die mitotische Spindel Mehrere krafterzeugenden Moleküle wirken auf die Mikrotubuli der mitotischen Spindel Spindelbildung und Positionierung zu fördern.. Mikrotubuli, die in die Zelle Rinde wachsen, um eine Schubkraft auf dem Zentrosom erzeugen. Cortical dynein (lila) fängt Mikrotubuli und erzeugt eine Zugkraft auf den Zentrosomen Depolymerisation. Innerhalb der Spindel, Kinesin-5 / Cut7 Motorproteine ​​liefern eine nach außen gerichtete Schiebekraft auf antiparallele Mikrotubuli, während Vernetzer der PRC1 / ASE1 Familie eine nach außen erzeugen entgegengesetzte Kraft schieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen .</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Mikrofluidik - Chip - Design (A) Entwurf von 4 - Zoll - Fotomaske 4 Mikrofluidik - Chips enthält. (B) Detaillierte Darstellung eines einzelnen Chips. Chips enthalten einen Ausgangskanal und drei Einlass durch einen Staubfilter gefolgt Kanäle. Einlasskanal 1 enthält die Wasserphase, Kanal 2 der Lipid / Öl-Phase und Kanal 3 können die gebildeten Tröpfchen mit zusätzlichen Lipid / Öl-Phase zu verdünnen, verwendet werden. (C) Detaillierte Darstellung der Kreuzung , wo die Lipid / Öl-Phase (kommt von oben und unten) mit der Wasserphase trifft (von links kommend). An der Kreuzung wird Tröpfchen bilden und dem Austrittskanal auf der rechten Seite in Richtung fließen. (D) Detaillierte Darstellung eines Staubfilter mit 2 &amp; mgr; m - Kanälen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Methodik für Wasser-in-Öl - Emulsion Tröpfchenbildung (A) Mikrofluidik - Chip und der Mikrofluidik Schlauch auf einem Hellfeld - Mikroskop. Sowohl die Wasser- und Lipid / Öl-Phasen-Röhren sind mit den Chip Einlässe 1 bzw. 2. (B) Einschränkung auf Mikrofluidik - Chip , wo die Wasser- und Lipid / Öl-Phasen erfüllen. Durch Ändern der Drücke können Tröpfchen Größe gesteuert werden. (C) Entwurf von PDMS beschichteten Flusszellen. Nach dem Laden der Tröpfchen in der Strömungszelle werden die offenen Enden mit zusätzlichen Valap geschlossen. (D) Schematische Darstellung der Tröpfchenbildung. Tröpfchen werden verwendet Zentrosomen zu verkapseln, Tubulin und zusätzliche Komponenten für mitotischen Spindelbildung erforderlich. (E) Schematische Darstellung der kortikalen-dynein Targeting. Biotinylated (Bio) dynein wird an biotinylierte Lipide durch Streptavidin (Strp) ausgerichtet. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Repräsentative Ergebnisse spindel Rekonstitutionen mit zunehmender Komplexität (A) Maximale Intensität Projektionen von Tröpfchen , die zwei Zentrosomen Beispiele von kurzen, mittleren und langen Mikrotubuli zeigt. Zentrosomen und Mikrotubuli werden durch die Zugabe von 10% HiLyte-488 markiertes Tubulin visualisiert. Maßstabsbalken = 10 um. (B) Lokalisierung von GFP-Biotin-Dynein-TMR in Abwesenheit (-, links) und Anwesenheit (+, rechts) von Streptavidin (Strp). (C) Microtubule aster Positionierung in Abwesenheit (-, links) oder Gegenwart (+, rechts) der kortikalen GFP-Biotin-Dynein-TMR. (D) Mikrotubulus aster (linkes Bild, green) Positionierung in Gegenwart von ASE1 (Mitteltafel, rot). (E) Mikrotubulus aster (links, grün) Positionierung in Gegenwart von ASE1 und Cut7 (Kinesin-5) (mittleres Feld, rot). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Abbildung 5: Imaging Aster Positionierdynamik in vitro (A) Entwurf eines PDMS Tasse , die bis zu mehreren Stunden Tröpfchen Bildgebung ermöglicht.. (B) Erzeugung, Speicherung und Darstellung von Tröpfchen (übertragen) mit unterschiedlichen Inhalten, veranschaulicht durch Abwesenheit (links) die Aufnahme (rechts) von fluoreszierendem Dextran (Alexa 647). (C) Einzelebene Bilder einer 60 min Zeitraffer (2 - Minuten - Intervallen) von einem z-Stapel entnommen (2 &amp; mgr; m Abstände) von adroplet eine einzige Zentrosom enthält. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Rekonstitution von Grund Mitosespindeln in Sphärische Emulsionströpfchen

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

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9.7K Aufrufe.  Delft University of Technology. The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Serie: Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Forschung

Biochemie

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of fabricating micellar nanocrystals based on combining top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. This method involves first using electrospray to generate uniform ultrafine liquid droplets, each of which functions as a micro-reactor in which self-assembly reaction occurs forming micellar nanocrystals, with the structures (micelle shape and nanocrystal encapsulation) controlled by the organic solvent used. This method is largely continuous and produces high quality micellar nanocrystal products with an inexpensive structure control approach. By using a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF), worm-shaped micellar nanocrystals can be produced due to solvent-induced/facilitated micelle fusion. Compared with the common spherical micellar nanocrystals, worm-shaped micellar nanocrystals can offer minimized non-specific cellular uptake, thus enhancing biological targeting. By co-encapsulating multiple nanocrystals into each micelle, multifunctional or synergistic effects can be achieved. Current limitations of this fabrication method, which will be part of the future work, primarily include imperfect encapsulation in the micellar nanocrystal product and the incompletely continuous nature of the process.

The present work describes a method to fabricate micellar nanocrystals, an emerging major class of nanobiomaterials. This method combines top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. The fabrication method is largely continuous, can produce high quality products, and possesses an inexpensive means of structure control.

Herstellung von sphärischen und Wurm-förmigen Mizellen Nanokristalle durch die Kombination von Elektrospray, Selbstmontage und lösemittelhaltige Strukturkontrolle

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

Chemie

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function depends on a robust quality control system to maintain protein homeostasis (proteostasis). Declines in mitochondrial proteostasis have been linked to cancer, aging, neurodegeneration, and many other diseases. Msp1 is a AAA+ ATPase anchored in the outer mitochondrial membrane that maintains proteostasis by removing mislocalized tail-anchored proteins. Using purified components reconstituted into proteoliposomes, we have shown that Msp1 is necessary and sufficient to extract a model tail-anchored protein from a lipid bilayer. Our simplified reconstituted system overcomes several of the technical barriers that have hindered detailed study of membrane protein extraction. Here, we provide detailed methods for the generation of liposomes, membrane protein reconstitution, and the Msp1 extraction assay.

Here, we present a detailed protocol for reconstitution of Msp1 extraction activity with fully purified components in defined proteoliposomes.

Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is especially the case during mitosis or meiosis, where the microtubules form the spindle during cell division. The spindle is the machinery used to segregate genetic material during cell division. Toward creating self-organized spindles in vitro, we recently developed a technique to reconstitute microtubules into spindle-like assemblies with a minimal set of microtubule-associated proteins and crowding agents. Specifically, MAP65 was used, which is an antiparallel microtubule crosslinker from plants, a homolog of Ase1 from yeast and PRC1 from mammalian organisms. This crosslinker self-organizes microtubules into long, thin, spindle-like microtubule self-organized assemblies. These assemblies are also similar to liquid crystal tactoids, and microtubules could be used as mesoscale mesogens. Here, protocols are presented for creating these microtubule tactoids, as well as for characterizing the shape of the assemblies using fluorescence microscopy and the mobility of the constituents using fluorescence recovery after photobleaching.

This article presents a protocol for the formation of microtubule assemblies in the shape of tactoids using MAP65, a plant-based microtubule crosslinker, and PEG as a crowding agent.

Selbstorganisation von Mikrotubuli-Taktoiden

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Biotechnik

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the requirement of microfluidics to form controlled droplets imposes a barrier to non-experts, limiting their use. Here, we describe particle templated emulsification, an approach to generate monodisperse droplets without microfluidics. Using templating hydrogel spheres, we encapsulate samples in monodispersed droplets by simple vortexing. We demonstrate the approach by using it to perform microfluidic-free digital PCR.

Water-in-oil droplet assays are useful for analytical chemistry, enzyme evolution, and single cell analysis, but typically require microfluidics to form the droplets. Here, we describe particle templated emulsification, a microfluidic-free approach to perform droplet assays.

Partikel-Template-Emulgierung ermöglicht mikrofluidsäurefreie Tröpfchen-Assays

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

Biologie

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Einfluss des Zytoskeletts auf die Kernform und Kondensatdynamik in Maus-Eizellen

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named oocytes. Their development is marked by cell growth and subsequent divisions, two critical phases that prepare the oocyte for fusion with sperm to initiate embryogenesis. During growth, oocytes reorganize their cytoplasm to position the nucleus at the cell center, an event predictive of successful oocyte development in mice and humans and, thus, their embryogenic potential. In mouse oocytes, this cytoplasmic reorganization was shown to be driven by the cytoskeleton, the activity of which generates mechanical forces that agitate, reposition, and penetrate the nucleus. Consequently, this cytoplasmic-to-nucleoplasmic force transmission tunes the dynamics of nuclear RNA-processing organelles known as biomolecular condensates. This protocol provides an experimental framework to document, with high temporal resolution, the impact of the cytoskeleton on the nucleus across spatial scales in mouse oocytes. It details the imaging and image analysis steps and tools necessary to evaluate i) cytoskeletal activity in the oocyte cytoplasm, ii) cytoskeleton-based agitation of the oocyte nucleus, and iii) its effects on biomolecular condensate dynamics in the oocyte nucleoplasm. Beyond oocyte biology, the methods elaborated here can be adapted for use in somatic cells to similarly address cytoskeleton-based tuning of nuclear dynamics across scales.

Autor im Rampenlicht: Aufklärung der Dynamik von Mechano-Transduktion und nuklearer Agitation in Maus-Eizellen

This protocol provides an experimental framework to document the physical impact of the cytoskeleton on nuclear shape and the internal membrane-less organelles in the mouse oocyte system. The framework can be adapted for use in other cell types and contexts.

Erfassung der zytoskelettbasierten Agitation des Maus-Eizellkerns über räumliche Skalen hinweg

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...