Dieses Protokoll ermöglicht die spontane Selbstorganisation von Mikrotubuli-Tactoiden mit einem antiparallelen Vernetzer, MAP65. Dieses System kann uns helfen, die Organisation von Mikrotubuli und biologische Systeme wie mitotische Spindeln zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein minimalistisches System handelt, das spindelartige Formen für Mikrotubuli nachbilden kann, die hochgradig reproduzierbar und für viele Labore zugänglich sind.
Diese Methode ist nicht nur auf zelluläre Systeme anwendbar, sondern kann auch als Modell für Flüssigkristallstudien im mesoskaligen Maßstab dienen. Um Tubulin herzustellen, nehmen Sie zuerst ein Aliquot unmarkiertes Tubulin mit einem Milligramm lyophilisiertem Tubulin aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank und halten Sie es auf Eis. Dann fügen Sie 200 Mikroliter kaltes PEM-80 hinzu.
Um das gesamte Lyophilat aufzulösen, halten Sie die Tube 10 Minuten auf Eis. Als nächstes nehmen Sie eine Tube mit rhodaminmarkiertem Tubulin mit 20 Mikrogramm lyophilisiertem Tubulinpulver aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank und bewahren Sie es auf Eis auf. Dann fügen Sie vier Mikroliter kaltes PEM-80 hinzu und halten Sie die Tube für 10 Minuten auf Eis, um das gesamte Lyophilat aufzulösen.
Sobald sich die lyophilisierten Tubuline aufgelöst haben, fügen Sie 100 Mikroliter der resuspendierten, unmarkierten Tubulinlösung zu der vier Mikroliter rhodaminmarkierten Tubulinlösung hinzu. Mischen Sie dann die Lösungen, indem Sie sechs- bis siebenmal sehr langsam verrohren. Um die restlichen 100 Mikroliter unmarkierter Tubulinlösung zu lagern, führen Sie zuerst das Röhrchen in flüssigen Stickstoff ein, um die Lösung einzufrieren, und halten Sie das Röhrchen dann für die zukünftige Verwendung bei minus 80 Grad Celsius.
Als nächstes verteilen Sie die Tubulinmischung in sieben neue Röhrchen, indem Sie jeweils 15 Mikroliter hinzufügen. Frieren Sie die Röhrchen wie zuvor demonstriert in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Um Durchflusskammern für die Durchführung von Experimenten zusammenzubauen, reinigen Sie zunächst einen Glasobjektträger mit doppelt destilliertem Wasser und trocknen Sie ihn mit einem fusselfreien Labortuch.
Als nächstes reinigen Sie den Objektträger zuerst mit Ethanol, gefolgt von doppelt destilliertem Wasser. Um einen Fließweg zu erstellen, schneiden Sie ein 40 bis 50 Millimeter langes Stück doppelseitiges Klebeband ab. Teilen Sie es dann dazwischen, um zwei dünnere Bandstreifen zu erstellen, und legen Sie die beiden Streifen im Abstand von fünf bis acht Millimetern auf die Folie.
Als nächstes legen Sie silanisierte Deckscheine auf den Fließweg. Dann versiegeln Sie den Schlitten und die Abdeckung rutschte die doppelseitigen Bandstreifen durch, indem Sie vorsichtig mit der Rückseite eines Stiftes auf den Bandbereich drückten. Wenn die Dichtung gut gemacht ist, sollte sich das Band von durchscheinend zu klar drehen.
Um das zusätzliche Klebeband an den Rändern zu entfernen, schneiden Sie das Band mit einer Rasierklinge ab, so dass nur ein Millimeter vom Eingang der Durchflusskammer entfernt bleibt. Beschriften Sie dann die Kammer mit geeigneten experimentellen Parametern Um die taktischen Experimente durchzuführen, tauen Sie zunächst alle notwendigen Reagenzien auf Eis auf und lagern Sie sie während der Arbeit auf dem Eis. Als nächstes beschichten Sie die Durchflusskammer mit 20 Mikrolitern 5% nichtionischem Blockcopolymer-Tensid, das in PEM-80 gelöst ist, mit kleinen Tropfen an beiden Enden der Kammer, um die Bildung von Luftblasen im Inneren zu verhindern.
Bewahren Sie dann die Durchflusskammer in einer feuchten Kammer aus Petrischale mit einem nassen, fusselfreien Labortuch für mindestens fünf bis sieben Minuten auf. Als nächstes mischen Sie PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, Dithiothreitol, Glukose, Polyethylenglykol, die zuvor hergestellte Tubulinmischung und MAP65 mit GFP MAP65 zur Visualisierung in einem sterilen Röhrchen durch fünf- bis sechsmaliges Pipettieren, wobei das Rohr auf Eis gehalten wird. Dann fügen Sie einen Mikroliter einer vorgemischten Lösung von Glukoseoxidase hinzu und katalasieren Sie in das Röhrchen der Tubulin-MAP-Mischung und mischen Sie erneut, indem Sie sieben bis acht Mal paspeln.
Teilen Sie das Gesamtvolumen der Lösung in zwei Teile, die in separaten Kammern verwendet werden. In der Zwischenzeit muss die Flüssigkeit, die zuvor in die Durchflusskammer gegeben wurde, durch Kapillarwirkung entfernt werden, indem ein fusselfreies Labortuch am anderen Ende der Kammer verwendet wird, zusammen mit der Zugabe des Tubulin-MAP-Gemisches zur Durchflusskammer. Sobald sich die Probe vollständig in der Kammer befindet, versiegeln Sie die beiden Enden der Kammer mit fünfminütigem Epoxidharz und halten Sie sie etwa 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um Mikrotubuli-Tactoide zu keimen und zu züchten.
Für die Abbildung der Tactoide mittels Fluoreszenzmikroskopie verwenden Sie Objektive mit einer numerischen Apertur von 1,2 oder mehr in 60-facher oder höherer Vergrößerung, um genügend Licht in Fluoreszenz zu sammeln. Nehmen Sie die Bilder mit einem kostenlosen Metalloxid-Halbleiter oder einer ladungsgekoppelten Gerätekamera auf. Um die Probe zu erhalten, bewahren Sie sie in einer auf 37 Grad Celsius eingestellten Umweltkammer auf.
Alternativ können hierfür auch andere Bühnenheizungen, einschließlich Heißluft-Bühnenheizungen und objektiv temperierte Halsbänder mit zirkulierendem Warmwasser, eingesetzt werden. Da geeignete Anregungsquellen für die korrekte Fluoreszenz von Rhodamintubuli unerlässlich sind, verwenden Sie einen 561-Nanometer-Laser mit mindestens einem Milliwatt Leistung an der Probe für qualitativ hochwertige Bilder. Ändern Sie jedoch für GFP MAP65 die Anregungsquelle in einen 488-Nanometer-Laser.
Wenn Sie eine Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie verwenden, verwenden Sie einen Rhodaminfilterwürfel mit einer Anregung von 540 12,5 Nanometern, einem dichroitischen Cutoff von 545 Nanometern 12,5 Nanometern und einer Emission von 575 Nanometern Long-Pass. Verwenden Sie für GFP MAP einen GFP-Filterwürfel mit einer Anregung von 480 15 Nanometern, einer dichroitischen Abschaltung von 505 Nanometern 15 Nanometern und einer Emission von 515 Nanometern Longpass. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Beleuchtungsleistung und die Belichtungszeiten so sind, dass die Intensitätsskala für die Kamera nicht gesättigt ist, nehmen Sie mindestens 10 Bilder aus verschiedenen Bereichen auf, um über 100 Tactoide sowohl im roten als auch im grünen Kanal abzubilden, und speichern Sie sie als 16-Bit-TIFF-Bilder zur Analyse.
Mit diesem Protokoll können Mikrotubuli-Tactoide, deren Bildung innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen ist, direkt unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden. Die Tactoide sind sowohl mit einem 561-Nanometer-Laser im Tubulinkanal als auch mit einem 488-Nanometer-Laser im MAP65-Kanal sichtbar. Die Bilder überlappen sich auch perfekt miteinander.
Bei dieser Methode konnte auch die Länge und Breite der Tactoide gemessen werden. Es wurde festgestellt, dass das Intensitätsprofil eines Tactoiden mit seiner Breite variiert. Darüber hinaus wurde die unbewegliche Natur der Mikrotubuli-Tactoide durch die Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichen oder FRAP-Experimenten nachgewiesen, die nach dem Photobleichen keine Erholung der Fluoreszenz zeigten.
Auf der anderen Seite zeigten FRAP-Experimente eine mobile Natur von MAP65, für die eine allmähliche Erholung und Fluoreszenz nach dem Photobleichen beobachtet werden konnte. Diese Fluoreszenzrückgewinnung durch MAP65 kann an einen steigenden exponentiellen Zerfall angepasst werden, um die Amplitude und die Zeitskala der Erholung zu finden. Der taktische Experimentteil sollte innerhalb von 10 bis 12 Minuten abgeschlossen sein, da das Tubulin auf Eis schnell schlecht werden kann, was sich nachteilig auf die Keimbildung von Tactoiden auswirken kann.
Zukünftige Arbeiten mit verschiedenen Mikrotubuli-Vernetzungsproteinen und Vernetzungsmotorproteinen, Enzymen, die Mikrotubuli bewegen können, werden weiterhin neue Informationen über die Selbstorganisation der mitotischen Spindel liefern.
